劉子記 牛 玉 楊 衍

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南儋州571737)

苦瓜（Momordica charantiaL.， 2n = 2x =22）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）一年生蔓生草本植物，起源于非洲，共包括59 個種，其中47 個種分布于非洲，12 個種分布于亞洲和大洋洲，在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)有著悠久的栽培歷史［1-2］。苦瓜富含維生素C、維生素E 及多種礦物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值。另外，苦瓜所含的藥理活性成分具有顯著的抗腫瘤［3-4］、降血糖［5］、消炎［6］和提高人體免疫力［7］等多種功效。隨著消費者對苦瓜營養(yǎng)價值和藥用價值的充分認(rèn)識，苦瓜生產(chǎn)迅速發(fā)展，推動了苦瓜研究工作的深入開展。構(gòu)建遺傳連鎖圖譜是分析遺傳變異、基因定位和進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，苦瓜遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建研究取得了較大的進(jìn)展，大大促進(jìn)了重要農(nóng)藝性狀基因的定位及比較基因組學(xué)研究。本文總結(jié)了苦瓜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及數(shù)量性狀定位的研究進(jìn)展，以期為苦瓜重要農(nóng)藝性狀基因克隆及分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。

1 基于一代、二代分子標(biāo)記構(gòu)建苦瓜遺傳圖譜的研究現(xiàn)狀與比較分析

張長遠(yuǎn)［8］以野生苦瓜材料M041530 和栽培種苦瓜材料CY013 雜交產(chǎn)生的F2代作圖群體為材料，利用SRAP 標(biāo)記構(gòu)建了苦瓜遺傳連鎖圖譜，圖譜包括127 個標(biāo)記，共18 個連鎖群，圖譜全長2094.2 cM，標(biāo)記間的平均距離為16.5 cM（表1）。圖譜上存在明顯的3 個偏分離區(qū)域，分別位于第LG-8、LG-9和LG-18連鎖群上。采用復(fù)合區(qū)間作圖法對單株產(chǎn)量、單株結(jié)果數(shù)量、果實縱徑、果實橫徑、肉厚、單果重量等性狀進(jìn)行了QTL分析，分別找到控制單株產(chǎn)量、單株結(jié)果數(shù)量、果實縱徑、果實橫徑、單果重量等QTL 各1 個，遺傳貢獻(xiàn)率分別為11.66%、16.05%、13.59%、11.66%和14.03%。盡管SRAP 標(biāo)記可以用于構(gòu)建遺傳圖譜，但通用性較差，該遺傳圖譜標(biāo)記數(shù)目較少，標(biāo)記間的遺傳距離較大，很難篩選到與目標(biāo)性狀緊密連鎖的標(biāo)記，另外，研究中定位的QTL位點能夠解釋的遺傳變異較小，多屬于微效基因位點。

Wang 等［9］以苦瓜雌性系Z-1-4 和自交系189-4-1 雜交產(chǎn)生的F2群體為試驗材料，基于SSR、AFLP 和SRAP 標(biāo)記構(gòu)建了苦瓜遺傳連鎖圖譜，圖譜共194 個標(biāo)記位點，包括26 個EST-SSR 標(biāo)記位點，28 個SSR 標(biāo) 記 位點，124 個AFLP 標(biāo)記位點 和16 個SRAP 標(biāo)記位點。圖譜全長1 009.5 cM，共包括12個連鎖群，標(biāo)記之間的平均距離5.2 cM（表1）。在構(gòu)建遺傳圖譜的基礎(chǔ)上對22 個農(nóng)藝性狀進(jìn)行了QTL 定位，在3 個環(huán)境中共檢測出9 個穩(wěn)定的主效QTL 位點，其中2 個QTL 位點控制雄花高度，2 個QTL 位點控制雄花節(jié)位，1 個QTL 位點控制雌花節(jié)位，2個QTL位點控制雌花節(jié)率，2個QTL位點控制單株產(chǎn)量。QTL 分布熱點區(qū)域位于LG-1、LG-4 和LG-5 連鎖群，這些熱點區(qū)域可能具有一因多效。本研究與張長遠(yuǎn)［8］的研究結(jié)果相比，標(biāo)記數(shù)量有所增加，并且采用了SSR標(biāo)記，可用于圖譜間的比較研究，另外，本研究采用了AFLP 標(biāo)記，進(jìn)一步增加了圖譜密度，標(biāo)記間的距離有所變小，但AFLP 標(biāo)記和SRAP 標(biāo)記通用性較差，難以進(jìn)行圖譜整合研究。

米軍紅［10］以高抗白粉病野生苦瓜材料MC18 和高感白粉病苦瓜材料MC1-2 雜交產(chǎn)生的F2群體為研究材料，利用SRAP 和SCAR 標(biāo)記構(gòu)建了苦瓜遺傳圖譜并對抗白粉病基因進(jìn)行了QTL定位，圖譜共包括11 個連鎖群，LG-1 長1 676.7 cM，共包括18 個標(biāo)記，LG-2 長1 213.9 cM，共包括10 個標(biāo)記，LG-3長154.6 cM，包括2 個標(biāo)記，其余連鎖群各由1 個標(biāo)記構(gòu)成（表1），抗白粉病基因被定位在LG-2 連鎖群，鑒定出5 個與抗白粉病基因連鎖的SRAP 分子標(biāo)記，并將其中1個SRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記。與張長遠(yuǎn)［8］和Wang等［9］構(gòu)建的遺傳圖譜相比，該遺傳圖譜的標(biāo)記數(shù)量較少，盡管連鎖群的數(shù)量與苦瓜染色體數(shù)目一致，但多個連鎖群僅包括1個標(biāo)記，很難說明連鎖群與染色體的對應(yīng)關(guān)系。本研究基于該遺傳圖譜首次定位了抗白粉病基因位點，為苦瓜的抗病育種奠定了基礎(chǔ)。

Kole 等［11］以苦瓜品系臺灣白和CBM12 雜交產(chǎn)生的F2群體為研究對象，F(xiàn)2群體共包括146 個單株，利用AFLP 標(biāo)記構(gòu)建了苦瓜遺傳連鎖圖譜，圖譜共包括11 個連鎖群，108 個AFLP 標(biāo)記，圖譜全長3 060.7 cM，標(biāo)記間的平均距離為22.75 cM，其中7 個連鎖群分別包括9～28 個標(biāo)記，長234.7～889.8 cM，其余4 個連鎖群分別包括2～5 個標(biāo)記，長16.6～78.5 cM。標(biāo)記存在嚴(yán)重的偏分離現(xiàn)象（表1）?；谠搱D譜定位了5 個質(zhì)量性狀，分別為果實顏色、果實光澤、果實表皮結(jié)構(gòu)、柱頭顏色和種子顏色。12 個控制果實形狀的QTLs 分別被定位在5 個連鎖群，能夠解釋11.1%～39.7%的表型變異。與張長遠(yuǎn)［8］、Wang等［9］和米軍紅［10］構(gòu)建的圖譜相比，該圖譜主要基于AFLP 標(biāo)記，不僅標(biāo)記間遺傳距離較大，并且標(biāo)記在連鎖群上的分布存在明顯的偏分離情況。

綜上，基于一代、二代分子標(biāo)記構(gòu)建的苦瓜遺傳連鎖圖譜主要采用SRAP 和AFLP 分子標(biāo)記，屬于顯性標(biāo)記，盡管這些標(biāo)記可以加速遺傳圖譜構(gòu)建的進(jìn)程，但通用性較差，不能有效進(jìn)行遺傳圖譜的整合。另外基于顯性標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜會過分估計連鎖群的長度，圖譜飽和度較低，定位的重要農(nóng)藝性狀QTL較少，限制了其在分子輔助選擇方面的應(yīng)用。與SRAP 和AFLP 標(biāo)記相比，SSR 標(biāo)記共顯性遺傳、易于操作，適合進(jìn)行連鎖圖譜的構(gòu)建及圖譜間的比較分析，Wang 等［9］開發(fā)利用了部分SSR 分子標(biāo)記，但SSR 標(biāo)記數(shù)量非常有限。為了進(jìn)一步構(gòu)建苦瓜高密度遺傳連鎖圖譜及加強(qiáng)圖譜間的比較分析需要進(jìn)一步開發(fā)通用性較好，多態(tài)性較高，在染色體上分布較為均勻的分子標(biāo)記。

2 基于第三代高通量分子標(biāo)記構(gòu)建苦瓜遺傳圖譜的研究現(xiàn)狀與比較分析

基于一代、二代分子標(biāo)記構(gòu)建的苦瓜遺傳圖譜飽和度較低，很難鑒定到與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，限制了其在苦瓜遺傳改良中的應(yīng)用。為了構(gòu)建苦瓜飽和的遺傳連鎖圖譜，確定與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，需要進(jìn)一步開發(fā)高通量的分子標(biāo)記。近年來，基于下一代測序（next generation sequencing，NGS）的基因分型方法，包括限制性相關(guān)DNA 標(biāo)記測序（restriction-associated DNA tag sequencing，RAD-seq）和基于測序進(jìn)行基因分型（genotyping-by-Sequencing，GBS）被作為遺傳作圖的有效工具。這兩種方法對基因組中特定位置的短片段進(jìn)行測序并計算其頻率，個體之間的DNA多態(tài)性表現(xiàn)為這些短序列的有無。這些基于測序的基因分型工具可同時鑒定數(shù)千個全基因組范圍的多態(tài)性。

Matsumura 等［12］為了鑒定與純雌性基因連鎖的分子標(biāo)記，利用RAD-seq分析技術(shù)檢測基因組范圍的DNA 多態(tài)性，利用純雌性系OHB61-5 和雌雄同株系OHB95-1A 雜交產(chǎn)生的F2群體對多態(tài)性位點進(jìn)行基因型分析，基于552 個共顯性的RAD-tag 標(biāo)記構(gòu)建了苦瓜連鎖圖譜，共包括15 個連鎖群，圖譜全長1 821 cM（表1）。純雌性位點Mcgy 被定位在第一連鎖群的末端，與Mcgy最近的標(biāo)記為GT1998，該標(biāo)記由一個等位性標(biāo)簽組成，該SNP 在OHB61-5中為C 類型，在OHB95-1A 中為T 類型，GT1998 與Mcgy 位點的遺傳距離為8.33 cM。為了進(jìn)一步開發(fā)與純雌性緊密連鎖的標(biāo)記，構(gòu)建了純雌性系混池和雌雄同株系混池，結(jié)合親本池，基于RAD-seq技術(shù)確定了與純雌性位點緊密連鎖的SNP 標(biāo)記GTFL-1，該標(biāo)記與Mcgy 位點的遺傳距離為5.46 cM。本圖譜包括的標(biāo)記數(shù)量顯著高于張長遠(yuǎn)［8］、Wang等［9］、米軍紅［10］和Kole 等［11］構(gòu)建的圖譜，圖譜的密度顯著提高。但是在該研究中，連鎖群的數(shù)目（15 個連鎖群）并沒有覆蓋已知的染色體數(shù)目（11 條染色體），一些連鎖群只包含有限的標(biāo)記數(shù)量。這些結(jié)果很可能是由于標(biāo)記位置在分析群體中存在偏差，或者相同染色體上的連鎖群存在分離。為了解決這些問題，有必要增加標(biāo)記密度或更換作圖群體。在RAD-seq分析時采用不同限制性內(nèi)切酶可能會增加標(biāo)記的數(shù)量。另外，增加F2個體的數(shù)量將有助于繪制精確的連鎖圖譜。然而，當(dāng)一個作圖群體的雙親序列差異較小時，通過更換限制酶或增加群體規(guī)模來精確定位純雌性基因也是很困難的。

Urasaki 等［13］以O(shè)HB61-5 和OHB95-1A 雜交 產(chǎn)生的F2群體為研究對象基于RAD-seq 分析方法構(gòu)建了苦瓜遺傳圖譜。圖譜共包括1423 個標(biāo)記位點，11個連鎖群，圖譜全長3 426 cM（表1）。根據(jù)標(biāo)記在參考基因組序列中的位置，可以將255個序列骨架錨定到所構(gòu)建的連鎖圖上，每個骨架序列中的RAD 標(biāo)記位置幾乎與遺傳圖譜中的順序一致。Urasaki 等［13］和Matsumura 等［12］基于相同的作圖群體構(gòu)建了苦瓜遺傳連鎖圖譜，但Urasaki 等［13］構(gòu)建的圖譜飽和度更高，圖譜包含的標(biāo)記數(shù)量高于Matsumura 等［12］的2 倍，圖譜長度幾乎是Matsumura 等［12］的2 倍，連鎖群的數(shù)目與苦瓜染色體數(shù)量一致。

遺傳作圖是錨定組裝序列和鑒定控制重要性狀QTLs 的基本工具。Cui 等［14］構(gòu)建了一個基于RAD-seq 的苦瓜遺傳圖譜，作圖群體來源于純雌性系“k44”和雌雄同株系“dali-11”雜交產(chǎn)生的F2群體，共包括423個個體。該遺傳圖譜共包括11個連鎖群，1009個SNP標(biāo)記，圖譜全長2 203.95 cM，標(biāo)記間的平均距離為2.18 cM（表1）。該圖譜共錨定了113個組裝序列，全長251.32 Mb，占組裝基因組序列的85.48%。連鎖群重組率的變幅為6.91～11.04 cM/Mb。此外，采用定性和定量相結(jié)合的方法，對三個重要性狀進(jìn)行了定位，包括性別表達(dá)、果實表皮結(jié)構(gòu)和未成熟果實顏色。在三個環(huán)境中鑒定了3 個與這些性狀相關(guān)的QTL 位點，其中QTL位點gy/fffn/ffn 控制純雌性、第一雌花節(jié)位和雌花數(shù)量。兩個QTL 位點，F(xiàn)wa/Wr 和w，分別控制果實表皮結(jié)構(gòu)和白色未成熟果實顏色。該遺傳圖譜的構(gòu)建促進(jìn)了苦瓜基因組的組裝，將進(jìn)一步加速相關(guān)基因的克隆。該遺傳圖譜包含的標(biāo)記數(shù)量顯著 高 于 張 長 遠(yuǎn)［8］、Wang 等［9］、米 軍 紅［10］、Kole等［11］和Matsumura 等［12］構(gòu)建的圖譜，與Urasaki等［13］構(gòu)建的圖譜標(biāo)記數(shù)量相當(dāng)。該遺傳圖譜的平均標(biāo)記密度為0.46 maker/cM，高于Matsumura等［12］（0.30 maker/cM） 和Urasaki 等［13］（0.42 maker/cM）的研究結(jié)果。該研究之所以標(biāo)記密度較高，可能與選擇的限制性酶有關(guān)。該研究采用EcoRI 消化基因組DNA 進(jìn)行RAD-seq 分析，但Matsumura 等［12］和urasaki 等［13］分別使用了PacI 和AseI。在未來，篩選使用其它限制酶或許有助于構(gòu)建飽和的苦瓜遺傳圖譜。

Gangadhara Rao 等［15］建立了苦瓜高密度、高分辨率遺傳圖譜。共開發(fā)了2013 個高質(zhì)量SNP 標(biāo)記，圖譜共包括20個連鎖群，全長2 329.2 cM，每個連鎖群的長度從LG-12 185.2 cM到LG-17 46.2 cM不等，連鎖群的平均長度為116.46 cM。每個連鎖群中的SNP 標(biāo)記的數(shù)量從LG-20 中的23 個標(biāo)記到LG-1 中的146 個標(biāo)記不等，平均每個連鎖群含有100.65 個SNP 標(biāo)記。20 個連鎖群標(biāo)記之間的平均距離為1.16 cM（表1）。每個連鎖群標(biāo)記之間的平均距離從LG-4 0.70 cM 到LG-20 2.92 cM 不等。共鑒定出與4個性狀（雌性、性別比、節(jié)位和雌花始花期）相關(guān)的22個QTLs位點，分布在20個連鎖群上。gy-1 基因位點被定位在第12 連鎖群上，兩側(cè)的標(biāo)記為TP_54865 和TP_54890，與TP_54890 的距離為3.04 cM。該遺傳圖譜包括的標(biāo)記數(shù)量顯著高于張長遠(yuǎn)［8］、Wang 等［9］、米軍紅［10］、Kole 等［11］、Matsumura 等［12］、Urasaki 等［13］和Cui 等［14］構(gòu)建的苦瓜遺傳圖譜。標(biāo)記密度（0.86 marker/cM）顯著高于Matsumura 等［12］（0.30 marker/cM）、Urasaki 等［13］（0.42 marker/cM）和Cui 等［14］（0.46 marker/cM）的研究結(jié)果。本研究構(gòu)建的遺傳圖譜共包 括20 個連 鎖群，明 顯 多于Matsumura 等［12］、Urasaki 等［13］和Cui 等［14］的研究結(jié)果，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了苦瓜單倍體染色體數(shù)目，這可能是由于F2群體過小或與作圖群體的類型有關(guān)。為了解決這些問題，可以試圖通過增加作圖群體規(guī)?；虿捎肦IL群體替換F2作圖群體進(jìn)行改善。本研究進(jìn)一步說明，在構(gòu)建苦瓜遺傳圖譜研究中，GBS 技術(shù)略優(yōu)于RAD-seq技術(shù)。

表1 苦瓜遺傳連鎖圖譜

3 結(jié)論

構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜是分析遺傳變異、基因定位、基因克隆和進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)。圖譜的飽和程度及標(biāo)記的類型是影響圖譜應(yīng)用效果的關(guān)鍵［16］。盡管苦瓜遺傳圖譜的研究工作取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足。基于一代、二代分子標(biāo)記構(gòu)建的苦瓜遺傳圖譜，標(biāo)記間的距離較大，飽和度較低，很難鑒定與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。另外，基于一代、二代和三代分子標(biāo)記構(gòu)建的苦瓜遺傳圖譜均基于F2群體，利用F2群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜進(jìn)行相關(guān)QTL 分析具有一定的局限性，很難進(jìn)行多年多點分析，由于RILs 永久作圖群體可以在不同時間和地點對性狀進(jìn)行測量，可以大大降低試驗誤差，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度［17］。因此為了提高圖譜的精確度和準(zhǔn)確度，在未來苦瓜遺傳圖譜的構(gòu)建過程中，可以構(gòu)建RILs 作圖群體，另外一方面可以比較整合現(xiàn)有遺傳圖譜，最終構(gòu)建高密度的苦瓜遺傳連鎖圖譜。

本文總結(jié)了苦瓜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的研究現(xiàn)狀，為進(jìn)一步剖析苦瓜重要性狀基因關(guān)鍵位點奠定了基礎(chǔ)。有助于開發(fā)與重要農(nóng)藝性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，開展分子輔助選擇育種，推動苦瓜分子育種的進(jìn)程。