蔡燕杰，孫曉光,桑小普，馬重陽(yáng)，翟昌明，程發(fā)峰

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)是指慢性腎臟病引起的腎小球?yàn)V過(guò)率下降及與此相關(guān)的代謝紊亂和臨床癥狀組成的綜合征[1]，其影響因素頗多，發(fā)病因素復(fù)雜，防治需多方面合作，近些年來(lái)發(fā)病率呈明顯提高的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康[2]。

近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)在CRF患者的腸道內(nèi)，有大量未知的代謝產(chǎn)物，其中有一類(lèi)是潛在的尿毒癥毒素，這些尿毒癥毒素主要分為4類(lèi)：小分子毒素、中分子毒素、與蛋白結(jié)合的小分子化合物和蛋白質(zhì)等[3]，硫酸吲哚酚(indoxyl sulfuric,IS)是目前研究較多的腸源性尿毒癥毒素之一。這些尿毒癥毒素經(jīng)過(guò)一系列途徑進(jìn)一步加重CRF的進(jìn)程和并發(fā)癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察通腑化濁涼血方對(duì)慢性腎衰竭大鼠血清中IS的清除效率，為IS的清除策略以及慢性腎臟病的治療方案提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±40)g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。

1.2 藥物與試劑

通腑化濁涼血方(組成：荊芥6 g，防風(fēng)6 g，白芷6 g，獨(dú)活6 g，生地榆10 g，赤芍10 g，丹參10 g，茜草10 g，萆薢30 g，土茯苓30 g，生大黃10 g，為北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司提供)；尿毒清顆粒(廣州康臣藥業(yè)有限公司)；硫酸吲哚酚標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)；甲醇(北京百諾威生物科技有限公司)；乙腈(德國(guó) Merck 公司)；三氟乙酸(上海鈺博生物科技有限公司)；青霉素鈉(華北制藥股份有限公司)；水合氯醛(北京百諾威生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器

Waters515型高效液相色譜儀;配717型自動(dòng)進(jìn)樣器;2475型熒光檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司);BDS HyPersil C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特);METTLER TOLEDO AL-204電子分析天平(梅特勒儀器上海有限公司);KH19A型臺(tái)式高速高性能離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);MVS-1旋渦混合器(北京金紫光科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品)。

1.4 造模與分組

慢性腎衰竭大鼠模型的建立按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法造模，建立5/6腎切除法慢性腎衰竭大鼠模型。手術(shù)組(包括模型組，通腑化濁涼血方高、中、低劑量組，尿毒清組)均在無(wú)菌條件下進(jìn)行5/6腎切除術(shù)，空白組不作任何處理。5/6腎切除術(shù)分兩次完成。第一次手術(shù)切除左腎上、下極各1/3，在一周后進(jìn)行第二次手術(shù)，切除整個(gè)右腎[4]。兩次手術(shù)在手術(shù)過(guò)程中均在腹腔內(nèi)注入注射用青霉素鈉1 mL，由內(nèi)而外縫合，術(shù)后單籠飼養(yǎng)并觀察，以確保大鼠術(shù)后生存率。

按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白組、模型組(等量生理鹽水)、通腑化濁涼血方高劑量組、通腑化濁涼血方中劑量組、通腑化濁涼血方低劑量組和尿毒清組,每組10只，于動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境要求溫度、濕度均恒定。

1.5 中藥的備制與給藥

以人的等效劑量記作中劑量，1/2倍等效劑量為低劑量，2倍為高劑量，按照人與大鼠體表面積換算公式，中藥以蒸餾水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過(guò)濾，水浴加熱蒸發(fā)濃縮至含生藥分別為0.5 g/mL、1 g/mL、2 g/mL，放在4℃冰箱中備用。中藥的每日灌胃量為0.2 mL/10 g體質(zhì)量。

從第5周開(kāi)始，開(kāi)始灌胃給藥。模型組每日給以0.2 mL/10 g體質(zhì)量生理鹽水，通腑化濁涼血方組按照高中低劑量每日大鼠每日0.2 mL/10 g體質(zhì)量湯藥，尿毒清組每日0.2 mL/10 g尿毒清顆粒溶液，至第16周結(jié)束?？瞻捉M不作任何處理。

此16周在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有大鼠進(jìn)水及飲食均不受限制。

1.6 取材時(shí)間

在第4周末，每組中隨機(jī)抽取3只大鼠，頭身部固定，局部消毒后于尾靜脈取血，檢測(cè)肌酐、尿素氮水平，數(shù)據(jù)顯示慢性腎臟病大鼠造模成功。

在第16周末采集血、尿標(biāo)本。采集尿標(biāo)本用代謝籠留取SD大鼠24 h尿標(biāo)本，同時(shí)禁食。收取后立刻送檢。采集血標(biāo)本于12 h前將各組SD大鼠禁食、禁水。大鼠稱(chēng)質(zhì)量后，以0.3 mL/100 g 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉成功后予腹主動(dòng)脈采血，保存于無(wú)肝素采血管中，靜置30 min，離心機(jī)3 000 r/min離心，用移液槍移取出血清上清液20 μL，10 min后將血清樣本送檢。

1.7 血清生化和尿蛋白檢測(cè)

生化檢測(cè)大鼠尿素氮、肌酐、尿酸以及大鼠24 h尿蛋白定量，委托北京中醫(yī)藥大學(xué)科研樓全自動(dòng)生化分析室檢測(cè)。

1.8 硫酸吲哚酚檢測(cè)

采用高效液相色譜-熒光分析法檢測(cè)血清中硫酸吲哚酚含量。用移液器精密吸取血清100 μL，加入300 μL乙腈后渦旋30 s，待二者充分混合，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心8 min。吸取200 μL上清液，進(jìn)樣時(shí)取10 μL置于自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行分析。色譜分離通過(guò)BDS HyPersil C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特)完成，流動(dòng)相為乙腈-水-三氟乙酸(15：85：0.2，V/V/V)；流速為1 mL/min；柱溫：40 ℃；激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)390 nm。IS標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0和80.0 μg/mL。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

空白組大鼠的動(dòng)作敏捷，體毛致密光滑、整齊有光澤，耳廓、口唇、眼鼻黏膜紅潤(rùn)，體質(zhì)量正常增長(zhǎng)，尿量正常，尿色淡黃，大便成形質(zhì)偏硬，飲水飲食均正常。

模型組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡的現(xiàn)象，身體多蜷縮，且反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)遲緩，口唇等黏膜蒼白無(wú)血色，皮毛無(wú)光澤，毛量偏少，食少飲多，大便溏稀，尿量多，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。

尿毒清組整體狀況較模型組相比有改善，但較通腑化濁涼血方各組差。

通腑化濁涼血方各組在毛色、口唇黏膜顏色方面較模型組明顯改善。精神狀態(tài)較活躍，體質(zhì)量增長(zhǎng)較正常。

2.2 通腑化濁涼血方給藥3個(gè)月后各組血清尿素氮與肌酐水平的變化

表1 給藥3個(gè)月后各組血清尿素氮與肌酐水平的變化

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

3個(gè)月后模型組血清尿素氮(BUN)與肌酐(SCr)水平均較兩個(gè)月上升，表明本模型慢性腎衰持續(xù)進(jìn)展，且不能自陷。與模型組相比，通腑化濁涼血方中、高劑量均可以降低模型大鼠血清BUN水平(P<0.05)，三個(gè)劑量均能夠明顯降低SCr水平(P<0.05)，證明本方具有緩解腎功能衰竭的作用。

2.3 通腑化濁涼血方給藥3個(gè)月后尿蛋白水平的變化

24 h尿蛋白定量檢測(cè)結(jié)果顯示，通腑化濁涼血方給藥3個(gè)月后，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)明顯蛋白尿(P<0.01)。與模型組比較，三個(gè)劑量通腑化濁涼血方組大鼠24 h尿蛋白均有不同程度下降(P<0.01)，提示通腑化濁涼血方對(duì)大鼠腎衰后蛋白尿具有劑量依賴(lài)性治療作用。

表2 給藥3個(gè)月后24 h尿蛋白水平的變化

注：與模型組比較，**P<0.01

2.4 各組大鼠硫酸吲哚酚測(cè)定結(jié)果比較

慢性腎衰竭大鼠3個(gè)月血清IS水平較空白組明顯上升(P<0.01)，低中高通腑化濁涼血方能夠減少大鼠血清IS含量(P<0.01)，具有劑量依賴(lài)性。

表3 給藥3個(gè)月后IS測(cè)定

注：與模型組比較，**P<0.01

愈來(lái)愈多的證據(jù)表明，在CRF的病理機(jī)制中，腸道和腎臟之間有著重要的聯(lián)系，并提出了新的理論——“腸-腎軸”(Gut-Kidney Axis)[5]，腸道與腎臟之間的密切關(guān)系表現(xiàn)為，隨著腎功能的減退,腎臟對(duì)溶質(zhì)的清除率下降，血液和組織中不斷蓄積毒性物質(zhì)——尿毒癥毒素，毒素使腸道菌群生態(tài)失調(diào)，菌群生態(tài)的改變使毒素的產(chǎn)生增加；同時(shí)，毒素造成腸道黏膜屏障功能紊亂，導(dǎo)致內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)，形成腸源性?xún)?nèi)毒素血癥；毒素還可以通過(guò)腸道動(dòng)力障礙、免疫功能異常、全身炎癥反應(yīng)等途徑進(jìn)一步加重CRF的進(jìn)程和并發(fā)癥的發(fā)生[6-8]。

現(xiàn)在慢性腎衰竭常用的治療手段是腎替代，如血液透析、腹膜透析等方法，成本均較高，且對(duì)于IS等蛋白結(jié)合型毒素清除率較低，容易對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生影響[9]。

趙紹琴教授是治療腎病的大家，通過(guò)多年的臨床總結(jié)出一整套CRF的辨證方法，趙老認(rèn)為，CRF是泌尿系統(tǒng)疾病，不能等同于中醫(yī)“腎”的概念，其基本病機(jī)為風(fēng)、濕、熱邪深入營(yíng)血，脈絡(luò)瘀阻，其病屬實(shí)非虛，多熱多瘀。彭建中教授是趙紹琴教授的學(xué)術(shù)繼承人，在秉承趙紹琴學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，對(duì)該病進(jìn)行了更為深刻認(rèn)識(shí)，通過(guò)對(duì)大量臨床病例的觀察與總結(jié)，認(rèn)為CRF不僅是泌尿系統(tǒng)的疾病，更與胃腸道消化系統(tǒng)密切相關(guān)，并將本病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)定義為“濕熱毒”，研究出通腑化濁涼血方。此方是基于兩代名中醫(yī)的學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立而成的，是彭建中教授治療慢性腎衰竭的基本方，臨床療效顯著，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證[10]。

通腑化濁涼血方的立方宗旨在于解決CRF中蓄積在腎與三焦的“濕熱毒”。其藥物組成中的生大黃苦、寒，歸脾、胃、大腸經(jīng)，通腑導(dǎo)滯，減少腸道內(nèi)腐敗物的潴留時(shí)間，改善腸道菌群的失調(diào)狀態(tài)，使毒素的產(chǎn)生來(lái)源減少；萆薢苦、平，歸腎、胃經(jīng)，土茯苓甘、淡、平，歸肝、胃經(jīng)，化濁排毒，降低體內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)生的毒素；荊芥、防風(fēng)、白芷、獨(dú)活疏風(fēng)祛濕，生地榆、赤芍、丹參、茜草涼血活血，清熱解毒，減輕毒素導(dǎo)致的毒性作用。全方共奏通腑導(dǎo)滯、化濁排毒、涼血解毒之效。大腸屬下焦，本是糟粕形成的部位，更加容易感受“濕熱毒”邪。在腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的尿毒癥毒素極有可能是中醫(yī)所說(shuō)的“濕熱毒”邪，或是通腑化濁涼血方的作用靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)證明，通腑化濁涼血方可以增加CRF模型大鼠排便次數(shù)，改善食欲，降低血中的IS含量，但對(duì)IS的干預(yù)機(jī)制目前尚未可知。研究通腑化濁涼血方對(duì)IS的干預(yù)機(jī)制或能發(fā)現(xiàn)該方治療CRF的機(jī)制之一，從而為臨床治療慢性腎臟病提供思路。

慢性腎衰竭是現(xiàn)如今臨床上一種難治的疾病，尋找有效的治療措施是亟待解決的問(wèn)題。努力挖掘中醫(yī)藥治療慢性腎衰竭的經(jīng)驗(yàn)價(jià)值，是中醫(yī)藥學(xué)者的職責(zé)。我們應(yīng)在秉承中醫(yī)傳統(tǒng)的基礎(chǔ)上，挖掘名老中醫(yī)寶貴的臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合現(xiàn)代研究進(jìn)展與先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，發(fā)揚(yáng)中醫(yī)藥在治療慢性腎衰竭方面的積極作用，為IS等類(lèi)尿毒癥毒素的清除策略和慢性腎衰竭的治療方案提供新的思路與方法。