胡兵，安紅梅，閆霞，鄭佳露，黃曉偉，李淼

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 中醫(yī)腫瘤研究所 腫瘤科，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 科技處，上海 200032)

龍葵是茄科茄屬植物龍葵SolanumnigrumL.的全草，性寒味苦，有小毒，具有清熱解毒、利水消腫功效，可以用于感冒、牙痛、慢性支氣管炎、泌尿系感染等炎性疾病的治療，現(xiàn)廣泛用于各種腫瘤的治療。龍葵可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，增強(qiáng)化療作用，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成，并可改善免疫功能[1-2]。龍葵含有糖苷生物堿、糖蛋白、多糖以及多酚等成分，澳洲茄邊堿是其中的糖苷生物堿之一[3]。本研究觀察了澳洲茄邊堿對(duì)大腸癌HCT116細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

人大腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司。胎牛血清購(gòu)自澳大利亞Ausbian公司。澳洲茄邊堿購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司。CCK-8(Cell Counting Kit-8)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為美國(guó)eBioscience公司產(chǎn)品。Casapse-3活性檢測(cè)試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

5×103對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞接種于96孔板，接種后第2天加入不同濃度澳洲茄邊堿或等體積DMSO，每組3個(gè)復(fù)孔；藥物作用24 h、48 h和72 h后加入10 μL CCK-8，37 ℃反應(yīng)4 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔OD值，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

1×103對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞接種于6孔板，接種后第2天加入不同澳洲茄邊堿或等體積DMSO，每組3個(gè)復(fù)孔，每3天換液1次；9 d后4%多聚甲醛固定細(xì)胞，Giemsa染色，計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成抑制率：克隆形成抑制率=[(對(duì)照組克隆數(shù)-實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù))/對(duì)照組克隆數(shù)]×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

5×105對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞接種于6孔板，接種后第2天加入不同澳洲茄邊堿或等體積DMSO，每組3個(gè)復(fù)孔；藥物作用48 h后收集細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)Annexin V-APC/PI標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 Caspase-3活性檢測(cè)

1×104對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞接種96孔板，接種后第2天加入不同澳洲茄邊堿或等體積DMSO，每組3個(gè)復(fù)孔；藥物作用48 h后，參考試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Caspase-3活性，結(jié)果以對(duì)照組倍數(shù)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞增殖作用

采用CCK-8法檢測(cè)澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果顯示，4～32 μmol/L澳洲茄邊堿作用48 h可以抑制HCT116細(xì)胞增殖(表1)。研究進(jìn)一步選取3個(gè)劑量，觀察了澳洲茄邊堿不同作用時(shí)間對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，6～10 μmol/L澳洲茄邊堿可以抑制HCT116細(xì)胞增殖，呈劑量與時(shí)間依賴性(見(jiàn)圖1)(P<0.01)。

表1 澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞增殖作用

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

圖1 澳洲茄邊堿不同作用時(shí)間對(duì)HCT116細(xì)胞增殖影響

2.2 澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞克隆形成作用

采用平板法檢測(cè)HCT116細(xì)胞克隆形成，結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿可以抑制HCT116細(xì)胞克隆形成，與對(duì)照組比較差異顯著(表2)(P<0.01)。

表2 澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞克隆形成作用

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.3 澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡作用

采用Annexin V-APC/PI雙色熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示澳洲茄邊堿可以促HCT116細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組比較差異顯著(表3)(P<0.01)。

表3 澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡作用

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.4 澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞Caspase-3活性影響

采用試劑盒檢測(cè)澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞Caspase-3活性影響，結(jié)果顯示澳洲茄邊堿可以顯著增強(qiáng)HCT116細(xì)胞Caspase-3活性(見(jiàn)表4)(P<0.01)。

表4 澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞Caspase-3活性影響

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

3 討論

大腸癌是全球最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，在全球男性腫瘤發(fā)病率居第三位，在全球女性中居第二位；在我國(guó)，大腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在男性和女性腫瘤發(fā)病中居第五和第四位[4-5]。中醫(yī)藥在大腸癌的治療中發(fā)揮了重要的作用[6-7]；龍葵是大腸癌臨床最常用的抗癌中藥之一，在大腸癌細(xì)胞中具有廣泛的抗癌作用；澳洲茄邊堿(Solamargine)是龍葵的主要成分之一[1-3]。

腫瘤細(xì)胞用于基因表達(dá)或功能的異常，呈現(xiàn)失控增殖，增殖異常是腫瘤細(xì)胞的基本特征之一；抑制細(xì)胞增殖和或阻滯細(xì)胞增殖周期是藥物治療腫瘤的重要策略。本研究首先觀察了澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿可以抑制HCT116細(xì)胞增殖，呈劑量與時(shí)間依賴性；澳洲茄邊堿長(zhǎng)時(shí)間作用可抑制HCT116細(xì)胞克隆形成；提示澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞有較好的抗癌作用。

細(xì)胞凋亡是相關(guān)信號(hào)作用下，細(xì)胞在內(nèi)在蛋白調(diào)控下的自主性細(xì)胞死亡，可以呈現(xiàn)凋亡小體、DNA斷裂等特征變化[8]。Annexin V/PI標(biāo)記是細(xì)胞凋亡的經(jīng)典檢測(cè)方法。在正常細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)；在凋亡細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面；Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，可與凋亡細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，通過(guò)Annexin V偶聯(lián)的熒光素可檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡。中晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性破壞，PI可以進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色熒光，從而可檢測(cè)中晚期凋亡。本研究采用，Annexin V/PI標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，澳洲茄邊堿可激發(fā)HCT116細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡受多個(gè)蛋白的調(diào)控，目前研究顯示細(xì)胞凋亡主要有外源通路(死亡受體通路)、內(nèi)源通路(線粒體通路)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路；腫瘤治療研究較多的是外源通路和內(nèi)源通路。在外源通路中，死亡配體如TNFα、FasL與對(duì)應(yīng)受體結(jié)合，相繼激活Caspase-8和3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡；在內(nèi)源通路中，凋亡相關(guān)信號(hào)促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，繼而活化Caspase-9和3，激發(fā)細(xì)胞凋亡；Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白酶[9-10]。本研究結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿作用后，HCT116細(xì)胞Caspase-3活性增強(qiáng)，提示Caspase-3參與澳洲茄邊堿對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示澳洲茄邊堿可以抑制HCT116細(xì)胞增殖和克隆形成，促HCT116細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與活化Capase-3相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。