唐濤濤， 李 江,2,3， 楊 釗， 向福亮

(1.貴州大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院， 貴州 貴陽 550025; 2.貴州大學(xué) 應(yīng)用生態(tài)研究所， 貴州 貴陽 550025；3.貴州省喀斯特環(huán)境生態(tài)工程研究中心， 貴州 貴陽 550025)

多環(huán)芳烴(PAHs)是由2個或2個以上的苯環(huán)以線性排列、彎曲連接或者聚簇狀的方式構(gòu)成的有機污染物，其水溶性和揮發(fā)性會隨相對分子質(zhì)量的增大而減小[1]。根據(jù)苯環(huán)數(shù)目，分為低相對分子質(zhì)量(2～3環(huán))PAHs和高相對分子質(zhì)量(4環(huán)及以上)PAHs；根據(jù)來源分為天然來源和人為來源，其中人為來源是環(huán)境中PAHs主要來源[2]。PAHs的生物毒性主要從兩方面表現(xiàn)：一方面是PAHs本身具有的化學(xué)結(jié)構(gòu)；另一方面是PAHs進入生物體后被細(xì)胞色素P450依賴的混合氧化酶氧化或羥基化[3]。

盡管PAHs在環(huán)境中會受到化學(xué)氧化、光解作用、生物積累、揮發(fā)和吸附，但微生物降解和轉(zhuǎn)化被視為是降解的主要過程[4-6]。細(xì)菌、古菌、真菌均能降解PAHs。它們不僅能通過釋放生物表面活性劑等方式提高PAHs的生物可利用性，而且還能通過生物轉(zhuǎn)化、礦化作用將有機物分解為一些復(fù)雜的代謝產(chǎn)物及無機物，如H2O、CO2(好氧)、CH4(厭氧)。在好氧環(huán)境下，微生物易培養(yǎng)、降解效率高，但在降解過程中會產(chǎn)生有毒中間產(chǎn)物[7]，容易對環(huán)境造成二次污染。厭氧環(huán)境對PAHs的降解會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)簡單、毒性小、分解更完全的中間產(chǎn)物，且在降解過程中會產(chǎn)生清潔能源CH4，因此厭氧降解逐漸成為降低PAHs危害的另一有效途徑[8]。

目前，關(guān)于微生物降解PAHs的研究已較為深入，主要集中于降解機理、產(chǎn)物分析、關(guān)鍵酶及相關(guān)反應(yīng)類型等方面。由于微生物生長環(huán)境不同，其代謝產(chǎn)物、代謝關(guān)鍵酶及降解轉(zhuǎn)化存在差異性，因此降解機理的研究仍是今后的研究重點。筆者通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻，總結(jié)歸納微生物在不同環(huán)境下降解PAHs的轉(zhuǎn)化機理、中間產(chǎn)物、關(guān)鍵酶及相關(guān)反應(yīng)類型，為今后深入研究PAHs的生物降解機理及途徑提供參考。

1 PAHs降解菌種

1.1 PAHs好氧降解菌

在好氧環(huán)境下，細(xì)菌和真菌對PAHs均有較好的降解效能，其中細(xì)菌發(fā)揮主要作用(見表1)。在PAHs降解菌中，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)因具有較好的降解能力備受關(guān)注，而且假單胞菌屬對高濃度PAHs也具有較好的耐受性。陳遠志[9]發(fā)現(xiàn)，Mycobacteriumsp.WY10對菲(100 mg/L)和芘(50 mg/L)的降解效率可達到100.0%和92.3%。李想等[10]發(fā)現(xiàn)，Pseudomonassp.LX2在芘質(zhì)量濃度為50 mg/L的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d后對芘的降解率達到32.1%。徐成斌等[11]發(fā)現(xiàn)，Pseudomonasotitidis對菲的最大耐受質(zhì)量濃度為2000 mg/L。

1.2 PAHs厭氧降解菌

在厭氧環(huán)境下，細(xì)菌及古菌均可降解PAHs，這些細(xì)菌大多數(shù)被識別為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[23]、厚壁菌屬(Firmicutesp.)和梭狀芽胞桿菌屬(Clostridiumsp.)[28-29]，如：梭狀芽胞桿菌屬能降解萘酸化合物[22,30]、芴及部分菲、蒽和芘[29]。有研究也發(fā)現(xiàn)，δ-變形菌和厚壁菌屬在產(chǎn)甲烷條件下能降解萘、菲等低相對分子質(zhì)量PAHs[31]，同時假單胞菌屬和微桿菌屬在特定環(huán)境下能降解苯并[a]芘[32-33]。Zhang等[34]利用穩(wěn)定同位素探針技術(shù)也發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)甲烷環(huán)境下降解蒽的主要菌種為Proteobacteria、Methylibium、Legionella及一種尚未識別的菌株Rhiszobiales。

古菌對PAHs也具有一定的降解效能，產(chǎn)甲烷菌因其能將有機物轉(zhuǎn)化為CH4而備受關(guān)注。Christensen等[35]發(fā)現(xiàn)，若氫型古菌能通過氧化PAHs去除H2，則能達到降解PAHs(萘)的目的。Berdugo-Clarijo等[36]也指出，Methanosaeta和Methanobacteria在降解低相對分子質(zhì)量PAHs中起重要作用，同時還發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌在降解萘、1-甲基萘、2,6-二甲基萘?xí)r，Methanosaeta和Methanoculleus起主要作用。Bonalis等[37]發(fā)現(xiàn)，厭氧降解PAHs的主要產(chǎn)甲烷菌為Methanoregular、Methanosarcina和Methanobacterium。而Schmidt等[38]研究也發(fā)現(xiàn)，在厭氧環(huán)境下降解PAHs及其中間產(chǎn)物時，Methanoregular是主要的產(chǎn)甲烷菌。

2 PAHs降解機理

PAHs生物降解可分為好氧降解和厭氧降解。在好氧環(huán)境下，PAHs的斷開主要靠加氧酶作用，即加氧酶能將氧原子加到C—C鍵上形成C—O鍵，隨后再通過加氫、脫水等作用使C—C鍵斷裂，使苯環(huán)數(shù)減少。而厭氧環(huán)境不同于好氧環(huán)境，PAHs開環(huán)不僅能在酶的作用下進行，還能與其它物質(zhì)相結(jié)合發(fā)生羧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、羥基化及甲基化反應(yīng)等。羧化反應(yīng)是由外源碳原子添加到PAHs的苯環(huán)上，生成相應(yīng)的脂肪酸。羥基化和甲基反應(yīng)，主要是羥基或甲基結(jié)合PAHs的苯環(huán)生成相應(yīng)的酚類物質(zhì)[4]。還原反應(yīng)主要是與H2結(jié)合實現(xiàn)PAHs的開環(huán)。

表1 PAHs的降解菌Table 1 Bacteria for PAHs degradation

Ant—Anthracene; Flu—Fluorene; PYR—Pyrene; CHR—Chrysene; FLA—Fluoranthene; BaA—Benzo[a]anthracene; DBA—Dibenzo[a,h] anthracene; Nap—Naphthalene; Phe—Phenanthrene; BaP—Benzo[a]pyrene

2.1 好氧降解機理

有研究發(fā)現(xiàn)，微生物在降解PAHs過程中主要取決于酶的活性，其中細(xì)菌產(chǎn)生雙加氧酶，真菌產(chǎn)生單加氧酶[39]。雙加氧酶是多種成分所組成的酶，通常由還原酶、鐵氧化還原蛋白和末端亞基加氧酶所組成[40]。在雙加氧酶作用下，PAHs會轉(zhuǎn)化為二氫二醇化合物，并在脫氫酶作用下生成二醇中間產(chǎn)物，隨后通過鄰位斷裂途徑或間位斷裂途徑的內(nèi)環(huán)斷裂雙加氧酶或外環(huán)斷裂雙加氧酶降解，形成中間產(chǎn)物，如鄰苯二酚，最終轉(zhuǎn)變?yōu)槿人?TCA)循環(huán)的小分子物質(zhì)[40]。而在單加氧酶作用下，可催化PAHs芳香環(huán)形成一種不穩(wěn)定芳香氧化物，芳香氧化物會進一步通過一種環(huán)氧化物酶催化反應(yīng)形成反-二氫二醇化合物[41]。

2.2 厭氧降解機理

同時，由于苯環(huán)數(shù)不同，PAHs初始反應(yīng)也不同。如萘在厭氧條件下會在β位上發(fā)生羧基化反應(yīng)[44]，而在α位上會先發(fā)生甲基化反應(yīng)生成1-甲基萘，1-甲基萘在引入延胡索酸后會進一步降解[45]。也有研究表明，在厭氧條件下，菲的最初反應(yīng)可能是羧化作用[46]或甲基化作用[47]。此外，Liang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在厭氧條件下降解苯并[a]芘，其最初反應(yīng)是甲基化作用和加氫還原作用；Qing等[33]研究發(fā)現(xiàn)，厭氧降解苯并[a]芘的主要反應(yīng)是加氫還原作用。綜上所述，在厭氧條件下不同PAHs的降解機理均不相同，因此在今后的研究中具體的厭氧降解機理還有待進一步探索。

3 PAHs降解途徑

3.1 低相對分子質(zhì)量PAHs的降解途徑

低相對分子質(zhì)量PAHs分子結(jié)構(gòu)簡單，水溶性較好，因此大多數(shù)微生物都能將其完全礦化。

3.1.1 萘的降解途徑

(1)好氧降解

在好氧環(huán)境下，萘的生物降解包括轉(zhuǎn)化為龍膽酸或鄰苯二酚2種途徑。首先，萘在多種酶的作用下轉(zhuǎn)化為水楊酸，隨后在多種酶的作用下轉(zhuǎn)化為龍膽酸和鄰苯二酚，最終實現(xiàn)降解。Narancic等[48]研究Pseudomonasp.TN301菌株時發(fā)現(xiàn)，龍膽酸及鄰苯二酚在鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶和鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶等多種酶作用下逐步分解，并最終進入TCA循環(huán)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，萘在降解過程中并不會通過龍膽酸進行降解，如PseudomonaaeruginosaPAO1降解萘?xí)r會產(chǎn)生水楊酸和鄰苯二酚等中間產(chǎn)物，而并未產(chǎn)生龍膽酸[49]。細(xì)菌降解萘的一般代謝途徑在以往的研究中有所報道[50]。

真菌對萘的降解也通過鄰苯二酚進行。研究發(fā)現(xiàn)，真菌降解萘的代謝途徑中，鄰苯二酚在粘康酸酯化酶和羧基粘康酸環(huán)化酶等多種酶作用下進入TCA循環(huán)[51]。由此可見，無論是細(xì)菌或真菌，萘均會通過鄰苯二酚途徑降解。

(2)厭氧降解

在厭氧環(huán)境下，萘通過β位發(fā)生甲基化反應(yīng)或羧化反應(yīng)逐漸實現(xiàn)降解。有研究發(fā)現(xiàn)，在厭氧環(huán)境下未被取代PAHs最初反應(yīng)機理包括羧化作用[52]、甲基化作用[53]或羥化作用[54]。Zhang等[52]通過13C對萘的降解進行示蹤，發(fā)現(xiàn)萘的降解產(chǎn)物為2-萘甲酸，證明羧化反應(yīng)是萘最初的激活反應(yīng)，同時還發(fā)現(xiàn)加氫輔酶對萘的苯環(huán)進行兩次加氫作用后逐漸變?yōu)檩^易被厭氧微生物降解利用的化合物結(jié)構(gòu)。另一種途徑是引入延胡索酸后的甲基化反應(yīng)，隨后經(jīng)過脫氫酶的多次作用轉(zhuǎn)化為2-萘甲酸，最終合并到2-萘甲酸降解途徑中。以往的研究也指出，萘在經(jīng)過甲基化反應(yīng)或羧化反應(yīng)后可通過加氫輔酶作用逐漸實現(xiàn)開環(huán)[55]，可推測還原反應(yīng)可能是萘的主要降解反應(yīng)。同時有研究已證實，2環(huán)PAHs在降解過程中，還原反應(yīng)可能會優(yōu)于環(huán)的斷裂反應(yīng)[56]。

3.1.2 菲的降解途徑

(1)好氧降解

微生物對菲的降解是通過水楊酸或鄰苯二甲酸途徑進入TCA循環(huán)，最終完全降解。鑒于水楊酸為萘的降解產(chǎn)物，因此菲的降解與萘相似。細(xì)菌降解菲的一般途徑已有所報道[1]。

菲的降解可通過1,2-位、3,4-位、9,10-位進行。其中，1,2-位、3,4-位在一系列酶的作用下轉(zhuǎn)化為1-羥基-2-萘甲酸，并通過1-羥基-2-萘甲醛羥化酶的作用轉(zhuǎn)化為1,2-二羥萘，隨后通過與萘相似的途徑進行降解。利用菲和萘作為唯一碳源生長的菌株常常通過水楊酸途徑降解，其中假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬是最常見的菌株。但近年的研究發(fā)現(xiàn)，其他菌株也可通過水楊酸途徑降解菲，劉鑫鑫等[57]發(fā)現(xiàn)Burkholderiasp.FM-2菌株降解菲通過水楊酸途徑進行。

9,10-位在雙加氧酶作用下生成9,10-二氫二醇菲，隨后在單加氧酶及其它酶催化下形成鄰苯二甲酸，并在鄰苯二甲酸雙加氧酶、鄰苯二甲酸脫羧酶等作用下轉(zhuǎn)化為原兒茶酸，最終通過氧化開環(huán)進入TCA循環(huán)。氣單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、微球菌屬、芽孢桿菌屬、分枝桿菌屬、糞產(chǎn)堿菌屬等通過鄰苯二甲酸途徑進行降解。

(2)厭氧降解

在厭氧環(huán)境下，菲的降解主要是通過在苯環(huán)上多次甲基化和羥基化逐漸實現(xiàn)開環(huán)，由3環(huán)開環(huán)至較低環(huán)數(shù)的化合物[50]。目前國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于厭氧降解菲的研究集中于由硫酸鹽還原菌(SRB)降解，其中Tsai等[58]發(fā)現(xiàn)，在SRB環(huán)境下，菲首先會轉(zhuǎn)化為甲酚，但具體轉(zhuǎn)化途徑尚不明確，其次通過羥基化作用形成對羥基苯甲醇，隨后通過脫氫酶、水合作用、脫羧反應(yīng)形成苯酚，最終轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?，直至完全分解。該研究雖證實，菲在SRB環(huán)境下會逐漸降解，但并未解釋反應(yīng)激活機理。羧化作用雖作為2環(huán)和3環(huán)PAHs最初的激活機理[59]，但不適于SRB環(huán)境，隨著研究的不斷深入，已有研究證實，羧化作用是SRB系統(tǒng)代謝菲的最初反應(yīng)[52]。

3.2 高相對分子質(zhì)量PAHs的降解途徑

高相對分子質(zhì)量PAHs是指4環(huán)及以上PAHs，其中苯并[a]芘是強致癌性物質(zhì)，具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)、較高的辛醇-水分配系數(shù)、較強的難降解特性及較低的生物可利用性，因此微生物對苯并[a]芘的降解效能不佳。鄭天凌等[60]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌對苯并[a]芘的降解率最高不超過50%。目前，對于高相對分子質(zhì)量PAHs主要采用共代謝方式降解。共代謝有助于為微生物生長提供大量碳源，增加微生物生長，從而加速關(guān)鍵酶的合成，促進高相對分子質(zhì)量PAHs降解。

共代謝是通過添加共基質(zhì)為微生物提供碳源促進生長，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生降解PAHs的關(guān)鍵酶。如添加葡萄糖以后，Armillariasp.F02降解苯并[a]芘的速率提高了2～5 倍[61]；真菌FS10-C能夠?qū)⒊跏假|(zhì)量濃度為15 mg/L的苯并[a]芘降解54.0%[62]。王鳴等[63]選擇苯酚、葡萄糖、乙酸鈉、曲拉通(Triton X-100)4種基質(zhì)及其組合作為苯并[a]芘的代謝基質(zhì)，研究不同基質(zhì)對苯并[a]芘降解的影響，同時考察4種易降解基質(zhì)分別與萘、菲、蒽、熒蒽、芘和苯并[a]芘6種混合PAHs的共基質(zhì)降解。研究表明，添加單一基質(zhì)時，乙酸鈉的促進作用最明顯，苯酚促進效果最弱，苯并[a]芘分別能被降解39.9%和27.1%。6種PAHs存在條件下，乙酸鈉的效率依然最高，萘、菲、蒽、熒蒽、芘和苯并[a]芘的降解率分別為66.1%、60.7%、43.2%、22.0%、15.5%和14.7%。綜上所述，在建立共代謝體系時，一般會選擇易被微生物分解利用的物質(zhì)及與目標(biāo)污染物結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)。因為它們不僅有利于微生物的迅速繁殖，增強微生物活性，而且選擇結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)作為共基質(zhì)還能誘導(dǎo)關(guān)鍵酶的產(chǎn)生。

3.2.1 苯并[a]芘好氧降解

環(huán)境中可降解苯并[a]芘的細(xì)菌較少，主要以假單胞菌屬、分枝桿菌屬、副球菌屬為主。李艷秋等[64]發(fā)現(xiàn)，Pseudomonassp.SL-1對5mg/L苯并[a]芘的降解率為35.7%。毛健等[65]篩選出一株副球菌也能高效降解苯并[a]芘，其降解率可達到89.7%。微生物可通過4,5-位、7,8-位、9,10-位、11,12-位實現(xiàn)對苯并[a]芘的降解。其中，7,8-位、9,10-位形成芘的酸性化合物，4,5-位形成的酸性化合物，11,12-位形成環(huán)氧化物。苯并[a]芘首先在雙加氧酶和脫氫酶作用下形成順-二醇化合物，隨后在其它酶的作用下使苯環(huán)斷裂，并轉(zhuǎn)化為芘和的酸性化合物以降低苯并[a]芘的毒性。但關(guān)于其衍生物的毒性是否強于苯并[a]芘仍有待進一步確認(rèn)。圖1 為細(xì)菌降解苯并[a]芘的一般途徑[66]。

圖1 細(xì)菌降解苯并[a]芘的一般途徑[66]Fig.1 General pathways for benzo[a]pyrene degradation by microorganism

3.2.2 苯并[a]芘厭氧降解

低相對分子質(zhì)量PAHs在降解過程中可通過還原反應(yīng)實現(xiàn)降解，而關(guān)于高相對分子質(zhì)量PAHs是否會通過還原反應(yīng)實現(xiàn)降解尚未知。近年的研究充分證明，還原反應(yīng)也可作為苯并[a]芘最初的激活反應(yīng)。Liang等[32]發(fā)現(xiàn)，在厭氧環(huán)境下，苯并[a]芘的最初反應(yīng)是甲基化反應(yīng)和還原反應(yīng)。Qing等[33]也發(fā)現(xiàn)，苯并[a]芘在厭氧降解過程產(chǎn)生的H2能使PAHs發(fā)生還原反應(yīng)。

目前關(guān)于厭氧降解苯并[a]芘菌株的研究集中于假單胞菌屬和微桿菌屬，圖2為假單胞菌菌株JP1降解苯并[a]芘的一般途徑。苯并[a]芘首先通過甲基化反應(yīng)、還原反應(yīng)使苯環(huán)斷裂，隨后在脫甲基作用下形成苯并[a]蒽和，最終經(jīng)過甲基化反應(yīng)形成蒽和菲。由于蒽的γ位比α、β位活潑，因此γ位會由于α、β位發(fā)生脫氫作用轉(zhuǎn)化為9,10-蒽醌。

圖2 假單胞菌菌株JP1厭氧降解苯并[a]芘[32]Fig.2 Proposed pathways for anaerobic degradation of benzo[a]pyrene by Pseudomonas JP1[32]

圖3為微桿菌菌株CSW3在反硝化條件下降解苯并[a]芘的一般途徑。苯并[a]芘通過還原反應(yīng)使苯環(huán)斷裂形成芘和，芘在甲基化反應(yīng)和酶的作用下形成4,5-二甲基菲、4-甲基菲和菲。在一系列酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檩?，隨后通過羥基化作用、還原反應(yīng)及酶作用下逐漸降解。

研究結(jié)果顯示，苯并[a]芘在厭氧環(huán)境下的激活反應(yīng)與降解菌并無直接聯(lián)系，都可通過還原途徑實現(xiàn)苯環(huán)斷裂，均以菲為主要中間產(chǎn)物進行降解，后續(xù)降解出現(xiàn)差異性是否與降解菌特性有關(guān)，有待進一步研究。此外，苯并[a]芘在好氧微生物作用下，其降解產(chǎn)物以芘和的酸性化合物為主。由此可推測，厭氧微生物對苯并[a]芘的降解效能優(yōu)于好氧微生物。

圖3 在反硝化條件下微桿菌菌株CSW3厭氧降解苯并[a]芘的途徑[33]Fig.3 Proposed pathways of benzo[a]pyrene degradation by Microbacterium CSW3 under nitrate-reducing condition[33]

4 結(jié)論與展望

微生物是去除環(huán)境中PAHs的最有效且廉價的手段。目前，國內(nèi)外學(xué)者對PAHs降解研究主要集中于降解機理及降解菌種等方面。但研究往往存在局限性，單一菌種只有在特定環(huán)境下對某些特定的PAHs具有較好的降解效能。其并不能有效解釋PAHs在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化途徑，因為環(huán)境中PAHs和微生物具有多樣性特點，各菌株及降解產(chǎn)物在降解過程中會呈現(xiàn)協(xié)同作用或抑制作用。雖然共代謝方式可以增加碳源促進微生物生長及關(guān)鍵酶的合成，但目前所選用的共基質(zhì)均為易分解物質(zhì)，且種類較少。因此深入分析能與高相對分子質(zhì)量PAHs進行共代謝的底物、探索PAHs降解機理、分析共代謝產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，對于指導(dǎo)共代謝降解PAHs具有重要意義。

但當(dāng)前的研究仍存在不足之處，為此今后的研究方向包括：(1)微生物修復(fù)雖能降低PAHs毒性，但修復(fù)過程中可能會產(chǎn)生毒性更強的產(chǎn)物，因此在今后的研究中應(yīng)進一步分析產(chǎn)物毒性效應(yīng)，并解釋PAHs解毒機理。(2)分析產(chǎn)甲烷菌降解PAHs的初始反應(yīng)，并以不同PAHs作為碳源，觀察產(chǎn)甲烷菌的變化，研究某些PAHs是否會對產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生抑制作用，同時通過宏基因技術(shù)確定產(chǎn)甲烷菌降解PAHs的相關(guān)功能基因，以便于鑒定產(chǎn)甲烷菌功能菌株。