楊磊，高娟桃，白映祿，尚素琴，陳斌

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

截形葉螨(Tetranychustruncatus)是我國棉花、玉米、大豆等大田作物、蔬菜及多種果樹上的主要害螨之一[1].該螨體小、繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng)，往往引起作物落葉、落花、落果，造成長勢削弱、減產(chǎn)，甚至失收或整株死亡[2].近年來，甘肅河西玉米雜交制種迅速發(fā)展，成為我國最大的雜交玉米種子的生產(chǎn)基地，但截形葉螨危害嚴(yán)重，影響了制種玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，給甘肅制種業(yè)造成很大的損失[3-4]，同時在我國北方玉米產(chǎn)區(qū)，其危害也是日趨加重，已成為制約玉米生產(chǎn)的主要因素之一[5].一般對該螨的防治大多依賴化學(xué)農(nóng)藥，除了造成對環(huán)境的不良影響外，其抗藥性日益嚴(yán)重[6-7].因此，明確其抗性機(jī)制，延長農(nóng)藥的使用壽命顯得尤為重要.

殺蟲、殺螨劑施于田間后，除了直接殺死靶標(biāo)害蟲外，在環(huán)境中的毒力會逐漸稀釋，遞減到亞致死濃度(劑量)，從而造成昆蟲生態(tài)行為的變化，包括生殖力和發(fā)育歷期的改變、產(chǎn)生抗藥性等，即亞致死效應(yīng).因此，了解藥劑的亞致死效應(yīng)是評價其藥效和評估農(nóng)藥風(fēng)險管理的關(guān)鍵[8].一般認(rèn)為谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、羧酸酯酶(CarEs)、多功能氧化酶(MFOs)是螨類體內(nèi)重要的解毒酶[8]，亞致死濃度的殺螨劑或植物次生物質(zhì)會對葉螨體內(nèi)的多種酶系產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，從而為害蟲抗藥性進(jìn)化提供持續(xù)的選擇壓力[10].

甲氧香螨酯又稱東莨菪內(nèi)酯，是一種新型植物次生代謝物質(zhì)，屬于香豆素類化合物，具有良好的殺蟲、抗菌殺菌、殺螨、化感等農(nóng)用生物活性[11].作為新型植物源農(nóng)藥，目前的研究僅有對朱砂葉螨種群生長和繁殖的影響，而對其解毒酶影響的研究還未見報道.本研究采用LC10和LC30的甲氧香螨酯處理截形葉螨，在2、4、6、12、24、36、48、60、72 h共9個時間點(diǎn)測定了其體內(nèi)谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、羧酸酯酶(CarEs)、多功能氧化酶(MFOs)活性隨時間的變化情況，旨在為截形葉螨的綜合防治及甲氧香螨酯的合理使用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

截形葉螨：2008年采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)未接觸過任何農(nóng)藥的玉米試驗(yàn)田，以四季豆在T=(25±1)℃，RH(60±5)%，光周期16 h∶8 h條件下繼代飼養(yǎng).期間未接觸任何藥劑.

1.2 供試藥劑和儀器

1.2.1 供試藥劑 甲氧香螨酯scopoletin，含量≥99%，(成都德思特生物科技有限公司)；GSTs活性測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；CarEs活性測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；MFOs活性測定試劑盒(上海江萊生物科技有限公司).

1.2.2 供試儀器 H1850R型臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，ELX800UV酶標(biāo)儀(Bio-Tek Instruments).

1.3 亞致死濃度的測定

采用葉片浸漬法[13]，選取直徑為9.5 cm，高為1.0 cm的培養(yǎng)皿，將海綿剪成直徑為9.0 cm的圓放入培養(yǎng)皿，加水至飽和，再加上濾紙后備用；根據(jù)預(yù)試驗(yàn)設(shè)置甲氧香螨酯質(zhì)量濃度為1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L 5個梯度，剪取新鮮的菜豆葉片，分別浸入事先配好的藥液中5 s，取出后晾干，背面朝上放入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿，用吸水的脫脂棉包裹葉片邊緣和葉柄，挑取截形葉螨雌成螨，每個質(zhì)量濃度梯度3個重復(fù)，對照用27.5%丙酮水 ，每個重復(fù)30頭雌成螨，挑完之后放入光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，相對濕度(65±5)%，光周期16L/8D；24、48、72 h后檢查死亡率，計算48 h時的LC10和LC30值及置信區(qū)間.用毛筆輕觸螨體，若能活動都視作存活，反之記作死亡.

1.4 酶活性測定

用LC10和LC30的甲氧香螨酯和對照(27.5%丙酮水)處理含有大量截形葉螨成螨的菜豆葉5 s后計時，期間未轉(zhuǎn)移葉螨，仍用帶藥葉片，待2、4、6、12、24、36、48、60、72 h后，每個處理分別挑取200頭存活雌成螨至1.5 mL離心管，3次生物學(xué)重復(fù)，挑完后用液氮處理存至-80 ℃?zhèn)溆?谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶測定參照試劑盒(貨號：BC0355)，粗酶液提取：按照組織質(zhì)量(g)：試劑一體積(mL)為1∶5～10的比例進(jìn)行冰浴勻漿.8 000g，4 ℃離心10 min，取上清置冰上待測.空白管：取96孔板，加入20 μL試劑一，180 μL試劑二和20 μL試劑三，迅速混勻后于340 nm測定吸光度變化，記錄10 s和310 s吸光度為A1和A2.測定管：取96孔板，加入20 μL上清液，180 μL試劑二和20 μL試劑三，迅速混勻后于340 nm測定吸光度變化，記錄10 s和310 s吸光度為A3和A4.酶活性按樣本質(zhì)量計算活性：

GST(U/g)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×106×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.46×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷W

羧酸酯酶測定參照試劑盒(貨號：BC0845)，粗酶液提?。喊凑战M織質(zhì)量(g)：試劑一體積 (mL)為 1∶5～10的比例進(jìn)行冰浴勻漿，然后12 000g，4 ℃離心 30 min，取上清，置冰上待測.試劑二置于37 ℃水浴中預(yù)熱30 min以上.空白管：取96孔板依次加入5 μL蒸餾水和200 μL試劑二，迅速混勻后于 450 nm處測定3 min內(nèi)的吸光值變化，第10秒吸光值記為A1，第190秒的吸光值記為A2.ΔA空白管=A2-A1.測定管：取96孔板依次加入5 μL上清液和200 μL試劑二，迅速混勻后于450 nm處測定3 min內(nèi)的吸光值變化，第10秒吸光值記為A3，第190秒的吸光值記為A4.ΔA測定管=A4-A3.酶活性按樣本鮮質(zhì)量計算CarE活性：

CarE酶活(U/g鮮質(zhì)量)=(ΔA測定管-ΔA空白管)×V反總×(V樣總÷V樣)÷W÷T=13.67×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷W

多功能氧化酶測定參照試劑盒，粗酶液提?。河妙A(yù)冷的 PBS (0.01 mol/L,pH=7.4)沖洗組織，稱質(zhì)量后將組織剪碎.將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1∶9的體積比)加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨.為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融.最后將勻漿液于5 000×g離心5～10 min，取上清檢測.從室溫平衡 20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔中加入待測樣本50 μL；空白孔不加；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350 μL)，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)OD值繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值，酶單位U/L.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Excel 2016和SPSS 24.0，差異性檢驗(yàn)使用Duncan氏新復(fù)極差法.

2 結(jié)果與分析

2.1 甲氧香螨酯亞致死濃度的測定

如表1所示，甲氧香螨酯對截形葉螨的亞致死濃度LC30和LC10分別為0.227、0.029 mg/L.

2.2 甲氧香螨酯亞致死濃度對截形葉螨GSTs的影響

從圖1可以看出，LC30的甲氧香螨酯處理截形葉螨后，其體內(nèi)GSTs活性在2 h就已經(jīng)上升到31.57 U/g，顯著高于LC10和對照組，48 h顯著低于2 h酶活性，但仍高于LC10和顯著高于對照組，在60 h達(dá)到最大值，72 h降至31.65 U/g仍高于LC10組和對照組；LC10組GSTs的活性在2～12 h間與對照組無明顯差異，之后其GSTs活性逐漸升高，24～60 h顯著高于對照組，至60 h達(dá)到最大，72 h降至21.99 U/g.其中除48 h外，均顯著低于LC30組；說明LC10和LC30的甲氧香螨酯對截形葉螨體內(nèi)的GSTs有誘導(dǎo)作用，LC10組在72 h降至對照組水平，LC30組對GSTs的誘導(dǎo)更持久.

表1 甲氧香螨酯對截形葉螨的毒力測定

圖中小寫字母為同一處理下不同時間解毒活性差異顯著性，大寫字母為同一時間不同處理的解毒酶活性差異顯著性(P<0.05).Lowercases indicated significantly difference in the same group (P<0.05),capital indicated significantly difference in the same time.(P<0.05).圖1 甲氧香螨酯亞致死濃度對截形葉螨GSTs的影響Figure 1 Effect of sublethal concentration of scopoletin on GSTs activity of Tetranychus truncates

2.3 甲氧香螨酯亞致死濃度對截形葉螨CarEs的影響

從圖2來看，LC30甲氧香螨酯處理截形葉螨后，其體內(nèi)CarEs酶活性在2～6 h緩慢上升，6～12 h又降低，12～48 h再次迅速上升，至48 h達(dá)到最大值589.74 U/g，之后又降低；LC10組的CarEs在2 h時顯著高于對照，之后上升又降低，至60 h達(dá)到最大，在2～72 h內(nèi)均顯著高于對照；說明LC10和LC30的甲氧香螨酯對CarEs有誘導(dǎo)作用，二者差異不顯著但均顯著高于對照.

圖中小寫字母為同一處理下不同時間解毒活性差異顯著性，大寫字母為同一時間不同處理的解毒酶活性差異顯著性(P<0.05).Lowercases indicated significantly difference in the same group (P<0.05),capital indicated significantly difference in the same time.(P<0.05).圖2 甲氧香螨酯亞致死濃度對截形葉螨CarEs的影響Figure 2 Effect of sublethal concentration of Scopoletin on CarEs activity of Tetranychus truncates

2.4 甲氧香螨酯亞致死濃度對截形葉螨MFOs的影響

由圖3可知，LC30甲氧香螨酯處理截形葉螨后，其體內(nèi)MFOs活性在2 h時顯著高于對照而低于LC10組，之后降低，至24 h達(dá)到最低，36 h時達(dá)到最大值324.34 U/L，之后降低，但72 h仍顯著高于對照；LC10組在2 h最大，顯著高于LC30和對照組，在24 h時達(dá)到最大值，之后降低，但仍高于對照；說明LC10和LC30的甲氧香螨酯都能誘導(dǎo)MFOs活性，且濃度越低，誘導(dǎo)作用越明顯；隨著時間的推移，在4～12 h截形葉螨體內(nèi)的甲氧香螨酯量增加，濃度越大，抑制作用越明顯；隨著截形葉螨體內(nèi)的甲氧香螨酯被代謝，12 h后，LC10組MFOs活性便開始上升，而LC30在24 h對MFOs的抑制作用最強(qiáng)，36 h后，LC10和LC30的MFOs活性逐漸恢復(fù)至對照水平.

圖中小寫字母為同一處理下不同時間解毒活性差異顯著性，大寫字母為同一時間不同處理的解毒酶活性差異顯著性(P<0.05).Lowercases indicated significantly difference in the same group (P<0.05),capital indicated significantly difference in the same time.(P<0.05).圖3 甲氧香螨酯亞致死濃度對截形葉螨MFOs的影響Figure 3 Effect of sublethal concentration Scopoletin on MFOs activity of Tetranychus truncates

3 討論

蜱螨與昆蟲外源化合物(藥物、殺螨劑、致癌物等)的代謝及抗藥性的產(chǎn)生與體內(nèi)解毒酶密切相關(guān)[11].昆蟲的解毒酶系活性能被各種外源化合物誘導(dǎo)，這使昆蟲在受到非常嚴(yán)重的化學(xué)環(huán)境壓力作用下能迅速作出反應(yīng)，從而存活下來[12]，在對藥劑亞致死效應(yīng)研究中，解毒酶常被作為研究的重點(diǎn)[13].本研究中，LC30濃度的甲氧香螨酯處理截形葉螨后，GSTs酶活性在2～72 h內(nèi)顯著高于對照，除48 h外顯著高于LC10處理；LC10的阿維菌素處理截形葉螨后，GSTs酶活性在24～60 h內(nèi)顯著高于對照，其他時間點(diǎn)與對照差異不明顯，表明GSTs酶活性與處理甲氧香螨酯濃度和時間有關(guān)，濃度越大，酶活性越高，與谷清義[14]用LC10和LC20的阿維菌素處理土耳其斯坦葉螨24 h后的結(jié)論一致.LC10的阿維菌素處理截形葉螨后，處理時間越長，GSTs酶活性越高.尹顯慧等[15]研究表明多殺菌素具有明顯的誘導(dǎo)作用，亞致死濃度處理后比活力呈上升趨勢，且具有一定的時間效應(yīng).但也有研究指出，亞致死濃度或者一定劑量的藥劑處理并不能使GSTs酶活性顯著升高或者無明顯差異[13].

LC30濃度的甲氧香螨酯處理截形葉螨后，CarEs酶活性2～72 h內(nèi)顯著高于對照，在24～48 h內(nèi)顯著高于LC10處理，其他時間點(diǎn)差異不顯著；LC10濃度的甲氧香螨酯處理截形葉螨后，CarEs酶活性在2～72 h內(nèi)顯著高于對照，表明CarEs酶活性與處理甲氧香螨酯濃度和時間有關(guān)，濃度越大，酶活性越高，與夏冰等[16]用阿維菌素亞致死劑量阿維菌素處理小菜蛾敏感品系的結(jié)果一致，LC30的甲氧香螨酯處理截形葉螨后，處理時間越長，CarEs酶活性越高.但也有研究指出，CarEs酶活性在用亞致死濃度的阿維菌素處理土耳其斯坦葉螨后顯著降低，并且處理濃度越大，降低越明顯[13].

LC30濃度的阿維菌素處理截形葉螨后，MFOs酶活性在2、36～48和72 h顯著高于對照，在6、24 h顯著低于對照，4、12、60 h與對照無明顯差異，在2、6、24 h顯著低于LC10處理，其他時間點(diǎn)與LC10處理無明顯差異；LC10濃度的甲氧香螨酯處理截形葉螨后，MFOs酶活性在2、24、48、72 h顯著高于對照，6 h顯著低于對照，其他時間點(diǎn)與對照無明顯差異，表明MFOs酶活性與處理濃度和時間有關(guān)，初期，截形葉螨體內(nèi)攝入的甲氧香螨酯量有限，濃度越低誘導(dǎo)作用越明顯，隨著時間的增加，甲氧香螨酯的攝入量增加，MFOs酶活性表現(xiàn)為被抑制，且濃度越大，抑制作用越明顯，截形葉螨體內(nèi)的甲氧香螨酯被代謝至較低量時，MFOs酶活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)，與谷清義[14]用亞致死劑量的阿維菌素處理土耳其斯坦葉螨后MFOs升高一致，但也有研究指出MFOs活性會被抑制[13].

亞致死濃度或者劑量的藥劑對害蟲，害螨的解毒酶系影響不盡相同.這可能與藥劑種類、濃度或者劑量和供試害蟲的品系有關(guān)[16-17].本研究中，LC10和LC30的甲氧香螨酯對GSTs和CarEs有顯著的誘導(dǎo)作用，較低濃度的甲氧香螨酯可以誘導(dǎo)MFOs，而較高濃度的甲氧香螨酯對MFOs具有抑制作用，表明：GSTs、CarEs可能參與了甲氧香螨酯的代謝，MFOs的作用還需進(jìn)一步研究.本試驗(yàn)僅以室內(nèi)種群F0代為研究對象，對于田間種群或者用甲氧香螨酯處理后的F1代甚至更多代的影響還需進(jìn)一步研究.