張義全，梁琪，趙春燕，吳晗，宋雪梅，張炎

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

牦牛乳功能性營(yíng)養(yǎng)成分(氨基酸、酪蛋白和免疫球蛋白)含量較高，是一種優(yōu)質(zhì)的乳品[1-2]，也是干酪加工的優(yōu)質(zhì)乳源[3].凝乳是干酪生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一.干酪成熟過(guò)程中伴隨著復(fù)雜的生物化學(xué)變化，酸凝與酶凝是兩種不同的促進(jìn)凝膠形成的方法[4]，會(huì)影響干酪的質(zhì)構(gòu)特性和風(fēng)味.傳統(tǒng)干酪的生產(chǎn)多是以酶凝方式為主，需要?jiǎng)游镄阅槊福缧∨０櫸该傅?，但這些酶資源短缺，價(jià)格昂貴.酸凝干酪可以不添加凝乳酶，通過(guò)直接添加酸化劑使牛乳發(fā)生凝結(jié)而制得干酪，其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本較低，風(fēng)味清新，適合中國(guó)人的口味[5].

Breene等[6]首次通過(guò)酸凝法生產(chǎn)Mozzarella干酪.Quarne等[7]研究了不同酸化劑和凝乳酶對(duì)農(nóng)家干酪的出品率、感官品質(zhì)以及蛋白質(zhì)降解的影響.Ralph[8]首次通過(guò)感官分析評(píng)價(jià)了酸凝Mozzarella干酪.馬玲等[9]和馬楊等[10]研究了酸凝干酪成熟期間理化特性的變化.綜上所述，國(guó)內(nèi)外對(duì)酸凝干酪品質(zhì)特性的研究較多，但鮮見(jiàn)酸凝牦牛乳硬質(zhì)干酪的研究報(bào)道，并且酸凝和酶凝牦牛乳硬干酪的對(duì)比性研究也較少.

本試驗(yàn)以酶凝和酸凝牦牛乳硬質(zhì)干酪為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其感官品質(zhì)、質(zhì)構(gòu)特性、理化特性以及苦味肽分子量分布的測(cè)定，揭示不同凝乳方式(酶凝和酸凝)的牦牛乳硬質(zhì)干酪在成熟過(guò)程中質(zhì)量特性差異，對(duì)影響酸凝和酶凝干酪成熟期品質(zhì)的因素進(jìn)行系統(tǒng)分析，旨為改進(jìn)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期品質(zhì)提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牦牛乳：采自甘肅省天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉(xiāng)；混合發(fā)酵劑：嗜熱發(fā)酵劑(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌)與嗜溫發(fā)酵劑(乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種)按1∶1組成，均來(lái)自丹麥丹尼斯克公司；微生物凝乳酶：酶活為1.95×104SU/g，甘肅華羚生物技術(shù)研究中心；Sephadex G-25葡聚糖凝膠(色譜純)美國(guó)GE公司；細(xì)胞色素C、抑肽酶、氰鈷胺素VB12、氧化性谷胱甘肽均為標(biāo)準(zhǔn)品.

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-ND真空冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SBS-100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器(上海青浦滬西儀器廠(chǎng))；SBS-100蛋白純化層析系統(tǒng)和組分收集器(上海青浦滬西儀器廠(chǎng))；TA.XT Express質(zhì)構(gòu)儀(美國(guó)FTC公司).

1.3 方法

1.3.1 干酪的制作 新鮮牦牛乳→過(guò)濾→檢驗(yàn)→巴氏殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻(35 ℃)→添加發(fā)酵劑(0.006 25 g/L)→添加CaCl2(0.3 g/L)→添加凝乳酶(100.9 U/mL)/添加乳酸(切割pH值達(dá)到4.6)→35 ℃凝乳→切割→45 ℃二次加熱→排乳清→攪拌、加鹽(用量為凝塊的2%)→35 ℃堆釀(30 min)→壓榨成型(4～5 h)→真空包裝→成熟[11].

1.3.2 操作要點(diǎn) 1)新鮮牦牛乳：選用理化、微生物指標(biāo)合格，無(wú)抗生素的牦牛鮮乳.2)殺菌：采用巴氏殺菌，在62～65 ℃保溫殺菌30 min.

3)添加發(fā)酵劑：將殺菌乳冷卻至35 ℃左右，添加1%食鹽水，配制成相應(yīng)濃度的發(fā)酵劑，使原料乳產(chǎn)酸.

4)添加氯化鈣：在干酪生產(chǎn)過(guò)程中添加0.3 g/L氯化鈣，可提高干酪凝塊的質(zhì)構(gòu)，并抑制原料乳中的雜菌.

5)添加凝乳酶/乳酸：加入氯化鈣10 min以后，向酶凝干酪中添加由1%的食鹽水溶解，在35 ℃活化30 min的微生物凝乳酶；向酸凝干酪中添加適宜濃度的乳酸，使pH值達(dá)到4.6，促進(jìn)凝乳.

6)凝塊切割、攪拌和加熱：凝塊達(dá)到一定硬度后，切割成立方體小塊，輕微攪拌，使凝塊顆粒懸浮在乳清中，使乳清分離，加熱可使凝塊顆粒稍微收縮，有利于乳清從凝塊中排出.

7)加鹽：待排出乳清后，向其中加入2%的食鹽.

8)堆釀：為提高干酪質(zhì)地，堆釀2 h.

9)壓榨：促使干酪中的乳清進(jìn)一步排除，并讓干酪具備一定的組織狀態(tài).

10)真空包裝：干酪成品用LDPE袋進(jìn)行真空包裝.

11)成熟：將制作的新鮮干酪在10 ℃條件下分別成熟0、30、60、90、120、150、180 d.

1.3.3 干酪感官品質(zhì)的評(píng)定 感官評(píng)定方法參照GB 5420-2010的方法并改進(jìn).隨機(jī)抽取成熟第0、30、60、90、120、150、180 d干酪樣品，在25 ℃下放置1 h后.組成經(jīng)過(guò)培訓(xùn)篩選的10人評(píng)定小組，采用100分制，從色澤(20%)、組織狀態(tài)(30%)、滋味和氣味(50%)進(jìn)行質(zhì)量感官評(píng)定.具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1.

表1 牦牛乳硬質(zhì)干酪質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4 干酪苦味值的測(cè)定 參照Emmons等[12]的方法測(cè)定.評(píng)定小組由經(jīng)培訓(xùn)篩選的18人組成(男女比例為1∶1，均為不吸煙者)，評(píng)定員用蒸餾水漱口后，取適量干酪樣品置于口中5～10 s后吐出.用不同濃度的硫酸奎寧(0，2.9×10-3，5.8×10-3，1.2×10-2和 2.4×10-2mmol/L)作為參照物.0分表示完全無(wú)苦味；0～1.0分表示非常輕微苦味(包括1分)；1.0～2.0分表示輕微苦味(包括2分)；2.0～3.0分表示中等苦味(包括3分)；3.0～4.0分表示強(qiáng)苦味(包括4分)；4.0～5.0分表示非常強(qiáng)苦味(包括5分).

1.3.5 干酪質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的測(cè)定 參照孫彩玲等[13]的方法測(cè)定.樣品制備：測(cè)試樣品的尺寸為10 mm×10 mm×10 mm，在室溫(25±2)℃下平衡1 h后進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)試.質(zhì)構(gòu)參數(shù)：探頭類(lèi)型為P/50，測(cè)試前速率為5.0 mm/s，測(cè)試中速率為1.0 mm/s，測(cè)試后速率為5.0 mm/s，下壓變形為50%，觸發(fā)力為0.2 N.

1.3.6 干酪出品率測(cè)定 參照任娟[14]的方法，將牦牛乳干酪壓榨完后稱(chēng)質(zhì)量，根據(jù)干酪原料乳質(zhì)量與干酪質(zhì)量計(jì)算干酪出品率.

為了更加準(zhǔn)確地比較2種牦牛乳硬質(zhì)干酪的出品率，將干酪的實(shí)測(cè)出品率校正到水分含量為45%時(shí)再進(jìn)行計(jì)算.

1.3.7 干酪水分含量的測(cè)定 根據(jù)GB 5009.3-2010中直接干燥法進(jìn)行水分含量測(cè)定.

1.3.8 干酪苦味肽的分離純化

1.3.8.1 干酪苦味肽的提取 參照Konstantinia等[15]的方法.將成熟120 d的酶凝和酸凝牦牛乳硬質(zhì)干酪真空凍干，分別取50 g干酪切成碎片，加入150 mL蒸餾水用小型均質(zhì)機(jī)高速攪拌2～15 s，然后通過(guò)Whatman.No 1濾紙抽真空過(guò)濾，在4 ℃下放置30 min除去脂肪.將沉淀物用100 mL和50 mL的蒸餾水兩次抽提.然后在水層中加入無(wú)水乙醇，調(diào)整其最終濃度達(dá)到60%，除去蛋白質(zhì).在4 ℃下低速攪拌1 h，在10 000 r/min離心30 min，除去不溶物.取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水和乙醇，濃縮液真空冷凍干燥備用.

1.3.8.2 干酪苦味肽的分離純化 將提取的干酪苦味肽配制成20 mg/mL，采用Sephadex G-25凝膠滲透層析分離純化.分離條件為凝膠柱1.6 cm×70 cm；上樣量1 mL；洗脫液為蒸餾水；流速為0.5 mL/min；紫外檢測(cè)儀在波長(zhǎng)280 nm處進(jìn)行檢測(cè)，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，洗脫液吸光值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線(xiàn).收集組分峰，冷凍干燥備用.

1.3.8.3 干酪苦味肽分子量分布的測(cè)定 將分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)品：氧化性谷胱甘肽(600 u)、氰鈷胺VB12(1 302 u)、抑肽酶(6 512 u)、細(xì)胞色素C(12 500 u)、卵清蛋白(43 000 u)分別溶于Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0)中，將上述真空凍干蛋白質(zhì)配制成濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.將4種標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合均勻，抽取混合樣品溶液1 mL上樣，紫外檢測(cè)儀在波長(zhǎng)280 nm處進(jìn)行檢測(cè).以標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1.

圖1 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure 1 Standard curve of molecular weight

將干酪苦味肽進(jìn)行層析分離，確定出峰時(shí)間，通過(guò)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將樣品峰的保留時(shí)間代入回歸方程y=-0.010 9x+4.652 7，計(jì)算干酪苦味肽分子量分布.用峰面積歸一化法，確定不同分子量范圍苦味肽的相對(duì)百分含量.

1.3.8.4 干酪不同分子量苦味肽苦味值測(cè)定 測(cè)定方法同1.3.4.

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)每個(gè)處理重復(fù)3次，采用Orign8.0軟件分析數(shù)據(jù)并作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 酸凝和酶凝干酪感官評(píng)分

由圖2可知，在整個(gè)成熟過(guò)程中，酶凝與酸凝干酪的感官評(píng)分均呈先升高后降低的趨勢(shì)，并且在90 d時(shí)感官品質(zhì)都達(dá)到最佳.酶凝干酪風(fēng)味濃郁，組織狀態(tài)好，苦味重；酸凝干酪由于沒(méi)有添加凝乳酶，其蛋白質(zhì)降解程度小，色澤均勻，呈乳白色，滋氣味清淡，有適宜的乳香味和乳酸味，但其組織狀態(tài)松散，凝塊無(wú)彈性易碎，因此其總體感官評(píng)分較低.

圖2 酶凝與酸凝干酪感官評(píng)定Figure 2 Sensory evaluation of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

2.2 酸凝和酶凝干酪苦味值差異

從圖3可以看出，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，酶凝與酸凝干酪的苦味值呈先升高后下降的趨勢(shì)，并且都在120 d時(shí)苦味達(dá)到最大值，分別達(dá)到3.1(強(qiáng)苦味)和1.9(輕微苦味).成熟期0 d時(shí)，兩種干酪的苦味值均為0；在成熟30 d時(shí)，酸凝干酪苦味值仍為0；隨著成熟時(shí)間的增加，在30～180 d內(nèi)，酶凝干酪的苦味值始終高于酸凝干酪，說(shuō)明凝乳酶對(duì)干酪苦味形成的影響很大.

圖3 酶凝與酸凝干酪苦味值評(píng)價(jià)Figure 3 Bitter value of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

2.3 酸凝和酶凝干酪質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的差異

2.3.1 硬度 硬度反映干酪對(duì)變形抵抗的程度.由圖4可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，酶凝和酸凝干酪的硬度呈先增大后減小的趨勢(shì)，在成熟90 d時(shí)均達(dá)到最大值，分別為13.01 N和6.28 N.在整個(gè)成熟期，酸凝干酪的硬度始終小于酶凝干酪，主要是因?yàn)樗崮衫以谀Y(jié)時(shí)本身水分含量較高，干酪蛋白質(zhì)分子中包含較多的結(jié)合水所致.90 d后干酪硬度發(fā)生下降，主要是因?yàn)槌墒熘衅诿改衫业鞍踪|(zhì)降解程度較大，使酪蛋白的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，干酪中的部分結(jié)合水進(jìn)入干酪蛋白分子中，從而使干酪的硬度逐漸減小.

2.3.2 彈性 由圖5可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，酶凝和酸凝干酪的彈性呈先增大后減小的趨勢(shì)，在成熟90 d時(shí)均達(dá)到最大值，分別為0.78和0.47.在整個(gè)成熟期，酶凝干酪的彈性值始終大于酸凝干酪.這主要是由于適宜的水解可使干酪高度交聯(lián)的酪蛋白微膠束表現(xiàn)出較高的抗變形能力，體現(xiàn)出較高的彈性.隨著干酪的進(jìn)一步水解，干酪長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)蛋白不斷變短，直至酪蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)坍陷交融，干酪的彈性減小[16].

2.3.3 黏著性 黏著性反映了咀嚼時(shí)干酪對(duì)上腭、牙齒、舌頭等接觸面的黏性大小.干酪黏著性值的負(fù)號(hào)代表測(cè)試探頭受到的作用力方向向下，與大小無(wú)關(guān).由圖6可知，在整個(gè)成熟期，兩種干酪的黏著性呈無(wú)規(guī)律的變化趨勢(shì)，在成熟中后期(即90 d以后)兩種干酪的黏著性下降，適口性較好.

圖5 酶凝與酸凝干酪的彈性Figure 5 Elasticity of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

圖6 酶凝與酸凝干酪的黏著性Figure 6 Adhesiveness of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

2.4 酸凝和酶凝干酪理化性質(zhì)的差異

2.4.1 出品率 將干酪水分調(diào)整到45%，采用校正出品率進(jìn)行比較，可忽略干酪中水分含量的影響.從表2可知，酶凝干酪校正出品率為22.87%，酸凝干酪校正出品率為19.44%.

2.4.2 水分含量 水分不僅影響干酪出品率，對(duì)干酪品質(zhì)也有顯著影響.由圖7可知，酶凝和酸凝干酪水分含量在整個(gè)成熟期均呈逐漸下降的趨勢(shì)，由于干酪采用真空包裝，因此其水分含量降低程度很小，分別下降了0.73%、1.01%.在成熟0 d時(shí)，酶凝干酪水分含量為41.44%，酸凝干酪的水分含量為46.12%，高于酶凝干酪.說(shuō)明凝乳酶在干酪生產(chǎn)過(guò)程中可促進(jìn)乳清的排出，而在成熟過(guò)程中，雖然酸凝

表2 酶凝與酸凝干酪的出品率

圖7 酶凝與酸凝干酪的水分含量Figure 7 Moisture content of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

干酪有較低的蛋白水解能力，但其較差的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致較多的水分析出.

2.5 酸凝和酶凝干酪苦味肽分子量的分布

2.5.1 酶凝干酪苦味肽的分離 由圖8可知，成熟120 d的酶凝干酪中提取的苦味肽經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析分離，得到4個(gè)大的組分峰，分別編號(hào)為A1，A2，A3，A4.由圖8可看出，在選定條件下層析分離時(shí)干酪苦味肽出峰較多且峰距適中，提取肽的分離效果較好.將4種組分的出峰保留時(shí)間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，測(cè)得相應(yīng)分子量，并分別收集各組分峰，測(cè)定酶凝干酪不同分子量苦味肽的苦味值.

圖8 酶凝干酪苦味肽葡聚糖凝膠層析譜圖Figure 8 Glucan gel chromatography spectrum diagram of rennt-coagulated cheese bitter peptide

2.5.2 酶凝干酪苦味肽分子量分布及苦味的測(cè)定 由表3可知，酶凝干酪成熟120 d時(shí)，其苦味肽分子量分布大約在428～3 908 u，其中2 466～3 908 u、1 386～2 249 u和663～1 352 u這3段苦味肽分子量范圍占到了總量的79.24%，并且表現(xiàn)出較強(qiáng)烈的苦味值，是酶凝干酪成熟120 d時(shí)苦味形成的重要貢獻(xiàn)者.低分子量肽段(428～648 u)由于苦味肽疏水性片段的進(jìn)一步降解，生成較多的游離氨基酸，因此其苦味值相對(duì)其他3種組分低.

表3 酶凝干酪苦味肽分子量分布及苦味值

2.5.3 酸凝干酪苦味肽的分離 由圖9可知，成熟120 d的酸凝干酪中提取的苦味肽經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析分離，得到4個(gè)大的組分峰，分別編號(hào)為C1，C2，C3，C4.由圖9看出，在選定條件下提取肽的分離效果較好.將4種組分的出峰保留時(shí)間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，測(cè)得相應(yīng)分子量，并分別收集各組分峰，測(cè)定酸凝干酪不同分子量苦味肽的苦味值.

圖9 酸凝干酪苦味肽葡聚糖凝膠層析譜圖Figure 9 Glucan gel chromatography spectrum diagram of acid-coagulated cheese bitter peptide

2.5.4 酸凝干酪苦味肽分子量分布及苦味值的測(cè)定 由表4可知，酸凝干酪成熟120 d時(shí)，其苦味肽分子量分布大約在1 127～9 375 u，其中4 487～5 395 u、2 249～3 564 u這兩段苦味肽分子量范圍占到了總量的65.44%.分子量2 249～3 564 u的苦味肽表現(xiàn)出一定的苦味值，是成熟120 d酸凝干酪苦味形成的重要貢獻(xiàn)者.由于酸凝干酪中沒(méi)有添加凝乳酶，使其蛋白質(zhì)降解程度和苦味值均小于酶凝干酪.

表4 酸凝干酪苦味肽分子量分布及苦味值

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，酸凝干酪產(chǎn)率低，水分含量高，滋氣味較好，苦味值低于酶凝干酪，組織狀態(tài)，硬度、彈性較差.凝乳酶是凝乳過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其主要作用是促進(jìn)牛乳的凝結(jié)，便于乳清析出，對(duì)干酪成熟過(guò)程中良好的質(zhì)地與口感形成有重要影響.然而，酶凝干酪在成熟過(guò)程中殘留的凝乳酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解依然難以控制，易降解過(guò)度，導(dǎo)致干酪產(chǎn)生苦味物質(zhì)、過(guò)于濃郁的風(fēng)味或其他不良風(fēng)味.因此，干酪加工生產(chǎn)過(guò)程中，凝乳酶添加量過(guò)高，會(huì)使干酪產(chǎn)生苦味，影響干酪風(fēng)味及質(zhì)地，這與García等[17]研究發(fā)現(xiàn)相似.

牦牛乳中干物質(zhì)含量高，凝乳性能良好，出品率可達(dá)到20%左右[18].發(fā)酵劑中乳酸菌會(huì)利用原料乳中乳糖產(chǎn)生大量乳酸，為凝乳酶創(chuàng)造較好的凝乳條件，有利于凝塊的收縮并加速乳清排出，因此干酪水分含量低，出品率高[19].只用乳酸對(duì)原料乳進(jìn)行凝固不易形成干酪優(yōu)良的蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，致使形成的凝塊也比較松散無(wú)彈性，用小刀切割過(guò)程中易破裂，排出乳清時(shí)易損失，因此酸凝干酪產(chǎn)率較低[20].試驗(yàn)中干酪采用真空包裝，成熟過(guò)程中干酪水分含量呈現(xiàn)略微降低的趨勢(shì)，這與高婉偉等[21]的研究結(jié)果一致.Topcu等[22]曾發(fā)現(xiàn)Kasar干酪中苦味肽分子量在500～4 000 u和200～700 u.本試驗(yàn)中酶凝與酸凝牦牛乳硬質(zhì)干酪產(chǎn)生的苦味主要是500～5 000 u的疏水性多肽所引起的，這與Lee等[23]關(guān)于苦味肽的分子量分布研究結(jié)果基本一致.酶凝干酪苦味肽分子量小于酸凝干酪苦味肽分子量，說(shuō)明凝乳酶對(duì)苦味肽的降解程度較大.

4 結(jié)論

1) 酸凝牦牛乳硬質(zhì)干酪組織狀態(tài)松散，質(zhì)構(gòu)欠佳，但色澤均勻，滋氣味清淡，苦味值低.

2) 酶凝牦牛乳硬質(zhì)干酪校正出品率高，水分含量較低，質(zhì)構(gòu)品質(zhì)較好，說(shuō)明凝乳酶的添加有利于凝塊的收縮并加速乳清排出，干酪產(chǎn)率較高.

3) 干酪成熟120 d時(shí)，酶凝牦牛乳硬質(zhì)干酪中酪蛋白的降解更加充分，且降解產(chǎn)生的苦味肽苦味值較強(qiáng)烈；酸凝牦牛乳硬質(zhì)干酪中苦味肽分子量較大，且苦味肽的苦味值較低.