陳曼 ，楊雅冉 ，武會(huì)娟 ，嚴(yán)江偉

（1.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100101；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100094；4.北京市基因測(cè)序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京 100094）

在法庭科學(xué)實(shí)踐中，現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境和案情的復(fù)雜性往往使得法醫(yī)DNA檢驗(yàn)面對(duì)各種疑難生物檢材，如模板DNA含量低、降解程度高、混合分型以及含有抑制物等。如何提高疑難檢材的法醫(yī)DNA分型成功率也一直是法醫(yī)學(xué)亟待解決的問(wèn)題。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，從聚丙烯酰胺膠和毛細(xì)管電泳平臺(tái)的一代測(cè)序到現(xiàn)今發(fā)展迅猛的高通量二代測(cè)序技術(shù)，再到超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的單分子三代測(cè)序，能夠?qū)Πㄗ钚∩鼏卧獑渭?xì)胞的DNA和RNA序列進(jìn)行檢測(cè)也越來(lái)越成為一種主流趨勢(shì)。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷成熟，給法醫(yī)疑難檢材的檢測(cè)提供了一些新的研究思路，本文就相關(guān)方面進(jìn)行綜述。

1 單細(xì)胞測(cè)序

單細(xì)胞測(cè)序是對(duì)生物體單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行DNA和RNA序列測(cè)定的一種技術(shù)手段，主要包括單細(xì)胞分離、全基因組擴(kuò)增、新一代測(cè)序和數(shù)據(jù)分析4個(gè)步驟。

1.1 單細(xì)胞分離

單個(gè)細(xì)胞的分離制備對(duì)下游實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。按照是否需要制備細(xì)胞懸浮液，可將單細(xì)胞分離技術(shù)分為兩大類：第一類是通過(guò)機(jī)械研磨或者酶解的方法制備懸濁液，細(xì)胞由于不同的動(dòng)力學(xué)參數(shù)被初步分離。主要有梯度稀釋[1]、機(jī)械化的顯微操控法[2]、熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）技術(shù)[3]和微流體技術(shù)[4]4種。其中梯度稀釋是最簡(jiǎn)便的方法，但是精確度和可重復(fù)性比較差。自動(dòng)的微滴顯微操控技術(shù)則比較精確、實(shí)驗(yàn)誤差小、重復(fù)度高，缺點(diǎn)是需要較大的起始細(xì)胞數(shù)目、產(chǎn)率低、對(duì)細(xì)胞有損傷。FACS是目前最經(jīng)濟(jì)快捷的分離單細(xì)胞的方法，可以通過(guò)熒光標(biāo)記的方法選擇特異的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，但是起始細(xì)胞數(shù)量大，快速流動(dòng)的液體和熒光標(biāo)記對(duì)細(xì)胞的損傷仍然是流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞分離存在的問(wèn)題。而微流體技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是只需要納升級(jí)的微滴，分辨率靈敏度高。第二類是根據(jù)細(xì)胞不同的形態(tài)和內(nèi)容物利用熒光標(biāo)記或者發(fā)光抗體直接從組織切片中分離，保留了細(xì)胞原始生活狀態(tài)下的空間位置環(huán)境信息。激光捕獲顯微切割法（laser capture microdissection，LCM）[5]是這類方法的代表，但這個(gè)技術(shù)也存在一些缺陷，如效率較低、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及激光的損傷等。

1.2 全基因組擴(kuò)增

單細(xì)胞測(cè)序的另外一個(gè)關(guān)鍵步驟是無(wú)偏好的全基因組擴(kuò)增，忠實(shí)地放大細(xì)胞中單個(gè)拷貝或者雙拷貝的基因組信號(hào)。近些年涌現(xiàn)的各種低拷貝模板全基因組擴(kuò)增技術(shù)，極大地降低了傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）過(guò)程中由于特殊序列以及結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的擴(kuò)增片段偏好性而帶來(lái)的誤差。

目前，常用的全基因組擴(kuò)增的方法主要有4種。第一種是完全依賴于簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR法（degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR），這種方法在PCR熱啟動(dòng)酶的催化下，連接一段通用序列或者利用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行單純的熱循環(huán)PCR實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA的剪切修補(bǔ)，最終用于建庫(kù)[6-7]；第二種是基于多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification，MDA）技術(shù)，在高保真聚合酶Φ29的作用下，利用溫度相同的一組隨機(jī)引物進(jìn)行多重置換擴(kuò)增[8-9]；第三種是結(jié)合PCR和等溫置換的方法，有PicoPLEX[10]和更簡(jiǎn)潔的多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）[11]2種；第四種方法是通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入的線性放大（linear amplification via transposon insertion，LIANTI）技術(shù)[12]，利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)將DNA切碎，使DNA樣本得以線性放大。MALBAC和LIANTI技術(shù)在常規(guī)的PCR之前，通過(guò)設(shè)計(jì)起始等溫?cái)U(kuò)增子成環(huán)及轉(zhuǎn)座子在基因組中廣泛分布的特點(diǎn)，有效抑制了擴(kuò)增偏好性的問(wèn)題，提高了擴(kuò)增時(shí)全基因組覆蓋程度和對(duì)單核苷酸變異（single nucleotide variant，SNV）及拷貝數(shù)變異（copy number variant，CNV）的檢測(cè)準(zhǔn)確度。

1.3 新一代測(cè)序

新一代測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，無(wú)論是在樣本準(zhǔn)備、測(cè)序通量還是測(cè)序成本方面的進(jìn)步，使得基于單個(gè)細(xì)胞基因組的測(cè)序成為可能。目前，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)中常用的新一代測(cè)序根據(jù)讀長(zhǎng)的不同主要分為兩大類：第一類是短讀長(zhǎng)的二代測(cè)序平臺(tái)，包括MiSeq FGx?法醫(yī)基因組測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）和Ion S5TMXL測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。二代測(cè)序平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)主要是通量大、成本低，但是檢測(cè)片段較短，富含重復(fù)結(jié)構(gòu)的序列拼接較困難。目前單細(xì)胞測(cè)序的相關(guān)研究均是基于二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組或者表觀遺傳組[13]。第二類是長(zhǎng)讀長(zhǎng)的單分子三代測(cè)序平臺(tái)，如美國(guó)PacBio公司的單分子實(shí)時(shí)（single-molecule real-time，SMRT）熒光測(cè)序技術(shù)[14]和英國(guó)Oxford Nanopore Technologies公司最新的牛津納米孔MinION[15]測(cè)序儀，三代測(cè)序的讀長(zhǎng)可以達(dá)到10kb以上，測(cè)序結(jié)果易于拼接，類似線粒體大小的片段能直接測(cè)通，適用于含有重復(fù)序列的片段和小基因組的測(cè)定。最新的牛津納米孔MinION測(cè)序儀體積只有口風(fēng)琴大小，在極大程度減少測(cè)序時(shí)間的同時(shí)，也大大降低了測(cè)序成本，給未來(lái)新一代測(cè)序技術(shù)的普及提供了基礎(chǔ)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步產(chǎn)生了大量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)分析提出了新的要求，能夠高效分析大規(guī)模數(shù)據(jù)的分析算法被開(kāi)發(fā)，使得單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展。不同的分析算法在測(cè)序深度、特殊位置偏好性以及每一個(gè)細(xì)胞的結(jié)果上進(jìn)行權(quán)衡，綜合考慮在全基因組擴(kuò)增過(guò)程中較難避免的偏好性帶來(lái)的誤差。單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果分析的主要難點(diǎn)是消除不同步驟中實(shí)驗(yàn)人員和儀器帶來(lái)的誤差和背景信號(hào)。目前有一些新的研究和分析方法已被開(kāi)發(fā)用于單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析，如通過(guò)單個(gè)細(xì)胞中變異與原始大樣本中的變異等位基因頻率的百分比比較和多個(gè)細(xì)胞單獨(dú)結(jié)果的相互矯正的策略來(lái)減小單細(xì)胞分離時(shí)產(chǎn)生的偏差[16]。例如：在GAWAD等[16]的研究中，他們分別應(yīng)用Picard、Samtools、VarScan2、Annovar 4種不同的軟件程序進(jìn)行原始測(cè)序數(shù)據(jù)的細(xì)胞分選、序列的比對(duì)、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）或者插入/缺失（insertion/deletion，InDel）的讀取以及命名，從而解讀單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果；基因組的重頭組裝算法SPAdes[17]和IDBA-UD[18]降低了全基因組擴(kuò)增過(guò)程中由于高度重復(fù)的片段帶來(lái)的擴(kuò)增不均衡，這兩種算法的相關(guān)軟件均可以免費(fèi)下載安裝包使用；基于最大簡(jiǎn)約性、最大似然或基于距離的方法來(lái)進(jìn)行克隆細(xì)胞遺傳物質(zhì)構(gòu)建，通過(guò)比對(duì)單個(gè)細(xì)胞之間遺傳信息的異同點(diǎn)，比對(duì)減少單細(xì)胞測(cè)序過(guò)程中的錯(cuò)誤，提高測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確度[19]。如多重系統(tǒng)發(fā)育分析的軟件[20]和代碼開(kāi)源的癌癥細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)育模型[21]的建立，均是利用不同細(xì)胞間遺傳差異建立進(jìn)化關(guān)系達(dá)到解析測(cè)序數(shù)據(jù)的目的。

1.5 單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用現(xiàn)狀

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)以獨(dú)特的研究視角給生命科學(xué)帶來(lái)了新的思潮，目前基于該技術(shù)的研究層出不窮，主要應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的3個(gè)方向。（1）腫瘤相關(guān)研究。增殖時(shí)的分化和突變的積累是腫瘤組織高度異質(zhì)性的形成原因，這也是腫瘤細(xì)胞可以逃離機(jī)體免疫細(xì)胞存活和干擾腫瘤治療的主要因素?；趩渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)的各種不同腫瘤組織異質(zhì)性的相關(guān)研究層出不窮，如乳腺癌、肺癌、腦癌、直腸癌、膀胱癌、白血病和黑色素瘤等[22]。通過(guò)將單個(gè)細(xì)胞基因組信息和關(guān)鍵功能信號(hào)通路進(jìn)行聯(lián)合解析，找到引起腫瘤組織形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的突變相關(guān)關(guān)鍵因子，這些關(guān)鍵因子將極大地提高腫瘤化學(xué)療法的效能[22]。（2）微生物學(xué)相關(guān)研究。大量存在的不能培養(yǎng)的微生物是阻礙我們理解微生物致病性、微生物分類和生物多樣性的關(guān)鍵因素[23]，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)解決了這個(gè)難題，眾多微生物的基因組均可被測(cè)定。其中與人類疾?。ㄈ缪装Y性腸病、2型糖尿?。┟芮邢嚓P(guān)的腸道菌群譜系研究有較直接的應(yīng)用價(jià)值[24]。另外，基于微生物的生活習(xí)性對(duì)于特殊生理代謝途徑的研究可能給新的化學(xué)反應(yīng)模式探索提供了途徑[13]。（3）多細(xì)胞生物遺傳鑲嵌現(xiàn)象研究。最新的研究結(jié)果[19]表明，包括人在內(nèi)的多細(xì)胞生物體遺傳鑲嵌性可能是生物體行使復(fù)雜功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，這給疾病發(fā)生發(fā)展的研究提供了思路。除上述三個(gè)主要方向外，單細(xì)胞測(cè)序近年來(lái)在免疫系統(tǒng)、試管嬰兒、產(chǎn)前診斷和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育方面也有相關(guān)應(yīng)用[13]。

2 法醫(yī)學(xué)未來(lái)應(yīng)用方向及面臨的挑戰(zhàn)

相較于在生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，單細(xì)胞測(cè)序在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用尚未被開(kāi)發(fā)。本文根據(jù)單細(xì)胞測(cè)序的特點(diǎn)，預(yù)測(cè)其在法醫(yī)學(xué)微量、混合和降解等疑難檢材方面應(yīng)用的可能性，并簡(jiǎn)單分析其在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用過(guò)程中可能面臨的挑戰(zhàn)。

2.1 單細(xì)胞測(cè)序于微量檢材

在真實(shí)案件中，微量檢材的檢測(cè)一直困擾著法醫(yī)工作者。檢材中DNA含量低給檢案工作者帶來(lái)一系列的難題，其中較為突出的是提取工作。工作人員往往通過(guò)增加檢材量、多次富集的方法提高DNA的絕對(duì)量或者通過(guò)增加PCR循環(huán)數(shù)放大初始的遺傳信息，而這些方法隨之而來(lái)的是難以避免的在多次提取過(guò)程中由于提取工具的置換導(dǎo)致的污染問(wèn)題[25]以及PCR循環(huán)數(shù)過(guò)多導(dǎo)致的擴(kuò)增不均衡、大片段丟失。另一方面的瓶頸是多數(shù)案件需要多種遺傳標(biāo)記的聯(lián)合分析而不僅僅是單一一種遺傳標(biāo)記，這對(duì)于痕量樣本更是難以實(shí)現(xiàn)。因此，目前應(yīng)用于微量樣本的解決方案往往難以獲得較理想的分型結(jié)果。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)用全基因組擴(kuò)增體系，可將單個(gè)細(xì)胞中極低拷貝數(shù)的遺傳物質(zhì)進(jìn)行真實(shí)完整的放大，再結(jié)合新一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)DNA序列進(jìn)行解析，而不需要通過(guò)對(duì)檢材多次處理或者提高PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)來(lái)擴(kuò)大DNA信息。HANSON等[26]工作者早年將全基因組擴(kuò)增與傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)相結(jié)合進(jìn)行微量（單個(gè)或者少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞）基因組DNA的短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）分型檢驗(yàn)，但受限于不成熟的全基因組擴(kuò)增技術(shù)以及檢測(cè)手段，大片段丟失，僅能獲得部分STR分型結(jié)果，不能較好地應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐?，F(xiàn)今較成熟的全基因組擴(kuò)增技術(shù)和發(fā)展迅猛的測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，回避了DNA量的問(wèn)題，使其在合適的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)目下操作。另外，最新的全基因組擴(kuò)增方法通過(guò)設(shè)計(jì)環(huán)化起始擴(kuò)增產(chǎn)物這一巧妙的擴(kuò)增方案，極大程度地降低了擴(kuò)增的不均衡性[11]。此外，高通量測(cè)序的策略可以整合多種遺傳信息，在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行多種遺傳標(biāo)記的檢測(cè)，減少了檢材DNA的消耗?？傊?，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)最大程度地解決了微量樣本的檢驗(yàn)問(wèn)題。

2.2 單細(xì)胞測(cè)序與混合檢材

混合檢材分型拆分也是一個(gè)難以攻克的問(wèn)題。目前應(yīng)用一代STR檢測(cè)方法進(jìn)行混合檢材解析時(shí)，混合個(gè)體數(shù)目的確定和分型的拆分是其中的難點(diǎn)。對(duì)于單一的STR遺傳標(biāo)記來(lái)說(shuō)，不同的混合個(gè)體不可避免地?fù)碛邢嗤姆中停绕涫窃诨旌蟼€(gè)體間有親緣關(guān)系的情況下，這樣的干擾會(huì)更加明顯；另一方面，重復(fù)序列擴(kuò)增過(guò)程中不可避免地復(fù)制滑脫峰是混合樣本分型認(rèn)定困難的主要因素，尤其是混合比例較大的樣本。目前，一些沒(méi)有復(fù)制滑脫峰的遺傳標(biāo)記，如利用微單倍型和InDel進(jìn)行混合分型的解析，在一定程度上增加了混合樣本拆分的成功率。最新的研究結(jié)果[27]表明，結(jié)合分析1204個(gè)遺傳標(biāo)記（包括常染色體的964個(gè)SNP和23個(gè)InDel、X染色體的27個(gè)SNP、Y染色體的56個(gè)SNP、5個(gè)InDel和129個(gè)線粒體SNP）的檢測(cè)方法可以進(jìn)行1%的混合比例的拆分。但是無(wú)論哪種方法均是基于混合樣本，對(duì)于混合比例相差甚遠(yuǎn)的樣本仍然無(wú)法解決。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以發(fā)揮新一代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，復(fù)合一些新的遺傳標(biāo)記（如微單倍型、InDel），可避免產(chǎn)生復(fù)制滑脫峰而干擾結(jié)果，利于結(jié)果的拆分。更重要的是，單細(xì)胞測(cè)序基于最小生命單元（細(xì)胞）進(jìn)行檢測(cè)的精度，把混合檢材在起始階段進(jìn)行分離，使混合檢材不再“混合”。

2.3 單細(xì)胞測(cè)序與降解檢材

降解檢材也是一種疑難檢材。案件現(xiàn)場(chǎng)的樣本大多存在不同程度的降解，對(duì)于降解檢材而言，DNA片段的碎片化是阻礙其完整擴(kuò)增的主要原因，在一代STR的檢測(cè)分型結(jié)果上往往表現(xiàn)為大片段丟失而不能獲得足夠的嫌疑人信息。目前用來(lái)增加降解樣本檢出率的主要方法是選擇短片段的遺傳標(biāo)記（如SNP、miniSTR），以及最新發(fā)展的轉(zhuǎn)座子遺傳標(biāo)記，擴(kuò)增子為100 bp左右，在50 pg的起始DNA狀態(tài)下能獲得95%以上的分型，對(duì)于毛干和指甲等高度角質(zhì)化的檢材檢測(cè)效果較好[28]。但是這些策略仍然只是在改善檢出率，而不能從根本上解決降解檢材存在的DNA分子碎片化的問(wèn)題。

單細(xì)胞測(cè)序不僅在檢測(cè)靈敏度上有較大的提升，其在檢測(cè)廣度上也有較大的突破。不同于傳統(tǒng)的STR與毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)合的方法，單細(xì)胞與新一代測(cè)序技術(shù)的結(jié)合，在單個(gè)細(xì)胞的層面上充分發(fā)揮新一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)片段設(shè)計(jì)靈活的優(yōu)勢(shì)，復(fù)合目標(biāo)片段小的遺傳標(biāo)記（如SNP、轉(zhuǎn)座子），減少由于基因組片段降解導(dǎo)致大片段擴(kuò)增失敗的現(xiàn)象。另外，從檢測(cè)精度上，只要檢材中存有一個(gè)完好的細(xì)胞就可以得到完整分型，使降解檢材不再“降解”。

2.4 單細(xì)胞測(cè)序應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)研究面臨的挑戰(zhàn)

首先，相對(duì)于目前最常使用的毛細(xì)管電泳平臺(tái)，單細(xì)胞測(cè)序策略的精確度相對(duì)欠缺，主要檢測(cè)環(huán)節(jié)（全基因組擴(kuò)增階段和序列測(cè)定階段）仍存在不完善的地方。全基因組擴(kuò)增階段，MALBAC技術(shù)在全基因組平均測(cè)序深度達(dá)到25×?xí)r仍然只能覆蓋93%的基因組區(qū)域[11]，LIANTI技術(shù)在平均測(cè)序深度30×?xí)r可以達(dá)到97%的覆蓋度，且每一種技術(shù)均有一定的等位基因丟失和假陰性概率[12]。序列測(cè)定階段多用二代測(cè)序技術(shù)和單分子的三代測(cè)序技術(shù)。法醫(yī)學(xué)中二代測(cè)序平臺(tái)使用最多的是MiSeq FGx?法醫(yī)基因組測(cè)序平臺(tái)和Ion S5TMXL測(cè)序平臺(tái)兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)，其中MiSeq FGx測(cè)序平臺(tái)的正向測(cè)序有0.64%的錯(cuò)誤率，而反向測(cè)序的錯(cuò)誤率稍高為1.07%[29]，產(chǎn)生錯(cuò)誤的主要原因是由于A和C以及G和T分別相同的激發(fā)光，彼此強(qiáng)烈的相關(guān)性給熒光信號(hào)的分離帶來(lái)障礙而導(dǎo)致錯(cuò)讀；簇內(nèi)測(cè)序的不同步產(chǎn)生的干擾，隨著測(cè)序的循環(huán)增加而增加[30]。對(duì)于Ion S5TMXL測(cè)序平臺(tái)而言，GC含量不均衡或者堿基連續(xù)出現(xiàn)時(shí)也容易發(fā)生讀取錯(cuò)誤[31]。三代單分子測(cè)序中，PacBio公司的SMRT技術(shù)，由于含有不同遺傳信息的相鄰納米孔信號(hào)干擾，應(yīng)用該技術(shù)對(duì)150bp片段進(jìn)行單次檢測(cè)只有83%的準(zhǔn)確度，當(dāng)測(cè)序深度加大到15×，通過(guò)不同測(cè)序結(jié)果直接的相互矯正，準(zhǔn)確度可以達(dá)到99%[32]。而牛津納米孔MinION測(cè)序儀的精確度則可以達(dá)到99.9%[33]。

其次，單細(xì)胞樣本處理問(wèn)題。伴隨單細(xì)胞超高精度而來(lái)的必然是待檢測(cè)樣本數(shù)目的急劇增加，雖然新一代測(cè)序成本降幅明顯，但是人類復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體系和超大基因組仍然需要龐大的測(cè)序花費(fèi)，得到適量且足夠用于分析的數(shù)據(jù)，平衡好待測(cè)序的細(xì)胞數(shù)目和基因組測(cè)序的深度和廣度至關(guān)重要。另外，相比實(shí)驗(yàn)室超凈間里培養(yǎng)的組織細(xì)胞，復(fù)雜的環(huán)境因素常使得法醫(yī)學(xué)檢材中含有多種微生物的污染。一個(gè)細(xì)胞單拷貝或者雙拷貝基因組進(jìn)行擴(kuò)增信號(hào)放大時(shí)，無(wú)處不在的細(xì)菌和霉菌無(wú)疑會(huì)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞基因組擴(kuò)增產(chǎn)生較大干擾。目前，大多數(shù)單細(xì)胞分離技術(shù)均是通過(guò)對(duì)組織培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞稀釋液獲得，這給常見(jiàn)的法醫(yī)接觸樣本細(xì)胞的有效獲取帶來(lái)較大挑戰(zhàn)。

最后，實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析方面的挑戰(zhàn)。在單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)操作方面，目前常規(guī)的法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)論是相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作流程還是防污染、各類儀器相匹配的硬件方面都需要完善。在數(shù)據(jù)分析方面，目前應(yīng)用的分析方法大多在測(cè)試階段，缺乏有效的檢驗(yàn)和比較方法來(lái)判斷分析方法的優(yōu)劣。沒(méi)有基于單細(xì)胞的大人群數(shù)據(jù)積累，尤其是基于中國(guó)人群的數(shù)據(jù)，以及需要使用人員有較深厚的生物信息學(xué)背景才能使用的復(fù)雜分析方法，這些也都給法醫(yī)學(xué)應(yīng)用帶來(lái)阻礙。

3 展 望

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)正在迅猛發(fā)展，終將為法醫(yī)學(xué)服務(wù)，給法醫(yī)學(xué)帶來(lái)革命性的變化。但在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域使用時(shí)，需要：開(kāi)發(fā)針對(duì)法醫(yī)學(xué)案件檢材的精準(zhǔn)目標(biāo)細(xì)胞分選技術(shù)，防止微生物污染，降低待檢測(cè)數(shù)目；篩選適用于單細(xì)胞低拷貝模板檢測(cè)并且可以達(dá)到法醫(yī)學(xué)效力的遺傳標(biāo)記；組合人與微生物特異性的遺傳標(biāo)記，甚至非法醫(yī)學(xué)的參數(shù)（如疾病診斷、健康狀態(tài)等）；在分析方面，開(kāi)發(fā)可視化簡(jiǎn)潔的操作方法，讓更多人掌握并熟練使用。相信隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)自身的進(jìn)步以及其在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中相關(guān)行業(yè)規(guī)范的建立，定會(huì)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮不可替代的作用。