李雁，王曉喜，陳琦，杜玉枝，畢宏濤，魏立新，尚靖,3

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海省藏藥藥理學(xué)與安全性評(píng)價(jià)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810000；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南京 210000)

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)是最常見的功能性胃腸疾病之一.據(jù)報(bào)道，在西方國家成年人中，其患病率達(dá)到15%[1]，而在我國，其患病率達(dá)到23.5%[2].該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，且其誘發(fā)因素龐大繁雜，其中不良飲食就是導(dǎo)致該病產(chǎn)生不可忽略的一個(gè)因素，例如營養(yǎng)成分不均、飲食模式單一、飲食不規(guī)律等都會(huì)直接或者間接的引起機(jī)體出現(xiàn)胃腸動(dòng)力障礙，導(dǎo)致胃排空速度減慢，胃排空延遲，從而出現(xiàn)消化不良癥狀[3]，基于二者之間的聯(lián)系，大量通過飲食失節(jié)建立功能性消化不良動(dòng)物模型的研究由此展開[4-5]，并且都證明飲食失節(jié)在功能性消化不良發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用.而現(xiàn)代人生活水平提高，生活方式改變，不均衡飲食、暴飲暴食、飲食不規(guī)律等飲食失節(jié)現(xiàn)象隨即大量出現(xiàn)，使得功能性消化不良發(fā)病率急劇上升，為了探究二者更精準(zhǔn)的聯(lián)系，本研究旨在利用饑飽失常法刺激SD大鼠[6]，從胃腸激素水平以及腸道菌群多樣性方面，探究該法對(duì)SD大鼠胃腸激素以及腸道菌群的影響，進(jìn)而初步評(píng)價(jià)飲食失節(jié)在功能性消化不良產(chǎn)生過程中的作用.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(220±50)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)提供，試驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SYXK(甘)2015-0005，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，光照時(shí)間12 h；動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn).

胃動(dòng)素、胃促生長素素ELISA試劑盒(上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司，批號(hào)：201808)；NO含量測定試劑盒(南京建成生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：20180823)；甲基橙(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140102)；碳酸氫鈉(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130320)；水合氯醛(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20180518)；生理鹽水(國藥準(zhǔn)字H61020014，批號(hào)：1708146B，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司)；PBS(博士德生物工程有限公司，批號(hào)：09B16B30).

酶標(biāo)儀(Enspire SJZX-40，Singapore Perkin-Elmer)；離心機(jī)(3-18ks，Gremany Sigma)；高通量組織勻漿研磨器(Scientz-48，寧波新芝)；電子天平(AL104，METTLER TOLEDO)；722分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1801，北京瑞利分析儀器公司)；超聲波清洗器(SB-5200 DTD，寧波新芝)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，常州智博瑞儀器制造有限公司)；電熱恒溫干燥箱(DHG-9140A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；自動(dòng)純水機(jī)(UPH-1-40L，四川優(yōu)普超純儀器有限公司).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 造模及分組 SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量(220±50) g，稱重后隨機(jī)分為2組，正常飲食組(A)與饑飽失常組(B)，A組大鼠正常飼養(yǎng)，B組大鼠單日正常飲食，雙日禁食，連續(xù)試驗(yàn)15 d.

1.2.2 體質(zhì)量及進(jìn)食量的測定 每日上午9∶30給予2組大鼠一定的鼠食(固體，天平稱量)，至次日上午 9∶30測定剩余量，2者差值即為該組大鼠每日進(jìn)食量，饑飽失常組大鼠測定單日進(jìn)食量即可.分別于試驗(yàn)前，試驗(yàn)7 d后，試驗(yàn)15 d后稱得大鼠體質(zhì)量，得到試驗(yàn)期間2組大鼠體質(zhì)量變化情況.

1.2.3 胃排空測定(胃內(nèi)甲基橙殘留率) 胃排空測定方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，2組大鼠于試驗(yàn)結(jié)束后禁食不禁水12 h，并給每只大鼠灌胃3 mL 0.1%甲基橙溶液，45 min后測定大鼠胃內(nèi)甲基橙殘留量，計(jì)算得到大鼠胃內(nèi)甲基橙殘留率.

1.2.4 胃動(dòng)素(MTL)、胃促生長素(Ghrelin)含量的測定 選擇乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)作為抗凝劑，將血液置于含有抗凝劑的采血管中混勻，并在4 ℃下，以3 000 r/min離心20 min，收集上清即為待測血漿.MTL、Ghrelin含量測定采用Elisa法，按試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn).

1.2.5 胃竇NO含量的測定 自大鼠胃幽門括約肌處取得適量胃竇部組織，并用蒸餾水沖洗干凈后用濾紙吸干多余水分后準(zhǔn)確稱質(zhì)量，按1∶9(M/V)的比例，加入PBS，冰水浴條件下破碎組織得到勻漿液，4 000 r/min離心15 min，取上清液，以硝酸還原酶法測定組織勻漿上清液的NO含量，試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行.

1.2.6 腸道菌群的測定 取2組大鼠新鮮糞便，送樣至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序.

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)物健康狀態(tài)的變化

試驗(yàn)之前，2組大鼠活潑好動(dòng)、毛發(fā)整潔有光澤，精神狀態(tài)上佳；試驗(yàn)7 d后，A組大鼠未見異常，B組大鼠打斗劇烈，易怒易驚，糞便增多且濕軟；試驗(yàn)15 d后，A組大鼠狀態(tài)仍未見異常，B組大鼠從剛開始的打斗劇烈容易暴怒逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榇蚨窚p弱，對(duì)環(huán)境變化敏感，抱團(tuán)蜷縮，消極對(duì)待打斗甚至停止掙扎，糞便增多導(dǎo)致便溏，肛周污穢，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9].

2.2 大鼠體質(zhì)量的增長

2組大鼠體質(zhì)量變化如表1所示，試驗(yàn)7 d后，B組大鼠體質(zhì)量小于A組，且差異顯著(P<0.05)；試驗(yàn)15 d后，B組大鼠體質(zhì)量仍顯著小于A組(P<0.01)，但2者差值明顯增加.

表1 大鼠體質(zhì)量的變化

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01).

* indicates significant difference(P<0.05)；** indicates extremely significant difference(P<0.01).

2.3 單日進(jìn)食量的變化

2組大鼠單日進(jìn)食量具有極顯著差異，結(jié)果如圖1所示，A組大鼠單日進(jìn)食量逐漸減少，減少幅度較??；B組大鼠單日進(jìn)食量大幅增加后保持較小幅度的增加；試驗(yàn)期間，與A組相比，B組大鼠進(jìn)食量顯著增加(P<0.01).

2.4 胃排空速度及胃竇NO含量的變化

本研究中，以大鼠胃內(nèi)甲基橙殘留率反應(yīng)胃排空速度，結(jié)果如表2所示，與A組相比，B組大鼠胃內(nèi)甲基橙殘留率增加41.96%，該差異極顯著(P<0.01)；大鼠胃竇組織NO含量則與胃內(nèi)甲基橙殘留率呈相反趨勢，B組大鼠胃竇組織中NO含量較A組降低57.48%，具有極顯著性差異(P<0.01).

**表示差異極顯著(P<0.01).** indicates extremely significant difference (P<0.01).圖1 試驗(yàn)期間大鼠單日進(jìn)食量(n=7)Figure 1 The food intake of rats during the experiment (n=7)

表2 大鼠胃內(nèi)甲基橙殘留率及胃竇NO的含量

** 表示差異極顯著(P<0.01).

** indicates extremely significant difference(P<0.01).

表3 大鼠血漿胃動(dòng)素、胃促生長素含量

**表示差異極顯著(P<0.01).

** indicates extremely significant difference(P<0.01).

2.5 血漿胃動(dòng)素(MTL)、胃促生長素(Ghrelin)含量的變化

如表3所示，試驗(yàn)15 d后，相比A組，B組大鼠血漿MTL含量較低，但無顯著性差異；B組大鼠血漿Ghrelin含量相比A組增加9.76%，差異顯著(P<0.5).

2.6 腸道菌群多樣性的變化

2.6.1 OUT水平腸道菌群的變化 胃腸道作為人體最重要的消化吸收器官，內(nèi)含數(shù)量龐大的腸道菌群，與胃腸道功能及疾病的發(fā)生具有緊密的聯(lián)系.計(jì)算2組共有的OUT數(shù)量，并通過Veen圖直觀呈現(xiàn)2組大鼠共有和獨(dú)有OUT數(shù)量，結(jié)果如圖2所示，在OUT水平，A組與B組共有的OUT種類具有有538種，A組大鼠單獨(dú)含有的OTU有104種，B組大鼠單獨(dú)含有的OTU有57種，2組大鼠菌群OUT數(shù)目不同，說明饑飽失常刺激會(huì)導(dǎo)致大鼠腸道菌群出現(xiàn)變化，使其紊亂，但上述差異并不具有顯著性，說明大鼠在受到饑飽失常刺激后，大鼠菌群雖然發(fā)生變化，但是菌群主體維持相對(duì)穩(wěn)定.

2.6.2 科水平腸道菌群的變化 如圖3所示，在科水平比較2組大鼠菌群相對(duì)豐度，結(jié)果顯示B組大鼠Lactobacillaceae，Bifidobacteriaceae，Enterobacteriaceae3科菌群相對(duì)豐度較A組分別增加44.26%(P<0.001)、1.33%(P<0.05)、1.16%(P<0.05)，而與A組相比，B組大鼠Bacteroidales_S24-7_group，Ruminococcaceae，Verrucomicrobiaceae3科菌群相對(duì)豐度分別降低14.65%(P<0.01)、13.17%(P<0.001)和1.74%(P<0.05)，以上差異均具有顯著性.

圖2 OTU水平的腸道菌群Veen圖Figure 2 Veen diagram of intestinal flora at OUT level

2.6.3 MTL/Ghrelin含量與腸道菌群豐度關(guān)聯(lián)分析 為了探究胃腸激素與腸道菌群之間的關(guān)聯(lián)，本研究在門水平做了RDA分析，結(jié)果如圖4所示，在門水平，Bacteroidetes(擬桿菌門)細(xì)菌相對(duì)豐度與MTL含量呈正相關(guān)，且相關(guān)性較強(qiáng)，而與Ghrelin含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；Firmitues(厚壁菌門)則相反，其相對(duì)豐度與MTL含量呈負(fù)相關(guān)，與Ghrelin含量呈現(xiàn)正相關(guān).

* 表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；*** 表示差異極顯著(P<0.01).* indicates significant difference(P<0.05)；** indicates extremely significant difference(P<0.01)；*** indicates extremely significant difference(P<0.001).圖3 科水平兩組大鼠腸道菌群的比較分析Figure 3 Comparative analysis of intestinal flora between two groups on family level

圖4 MTL/Ghrelin含量與腸道菌群豐度關(guān)聯(lián)分析Figure 4 Correlation analysis of MTL/Ghrelin contents and intestinal flora abundance

3 討論

飲食因素與機(jī)體健康緊密相關(guān)，例如，高脂飲食會(huì)使正常SD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起肥胖與高膽固醇癥的形成[10-11]，研究發(fā)現(xiàn)飲食失節(jié)與功能性消化不良的發(fā)生具有密切的聯(lián)系，它會(huì)使機(jī)體胃腸動(dòng)力出現(xiàn)障礙，引起早飽、上腹疼痛、惡心、體質(zhì)量下降，倦怠懶動(dòng)等消化不良癥狀[12-13]，但其FD發(fā)生過程中對(duì)大鼠胃腸激素與腸道菌群的影響有待研究.本研究中，通過對(duì)SD大鼠進(jìn)行饑飽失常刺激后測定大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、胃排空速度、胃腸激素水平以及腸道菌群變化來初步評(píng)估飲食失節(jié)在功能性消化不良發(fā)生中的作用.結(jié)果顯示，B組大鼠活動(dòng)明顯減少，反應(yīng)遲鈍，易受驚，扎堆蜷縮，糞便增多且濕軟，進(jìn)食量明顯增加而體質(zhì)量則增加緩慢甚至出現(xiàn)負(fù)增長[14-15]，測定2組大鼠胃排空速度，結(jié)果顯示B組大鼠胃排空速度明顯減慢(P<0.01)，即說明飲食失節(jié)會(huì)導(dǎo)致大鼠胃腸蠕動(dòng)障礙，使其功能減弱.

FD作為一種臨床上最為常見的功能性胃腸疾病，其準(zhǔn)確發(fā)病機(jī)制目前為止尚不明確.近年來，大量研究表明，胃腸動(dòng)力障礙是FD發(fā)病的主要原因，而廣泛存在于消化系統(tǒng)的胃腸激素參與了胃腸道的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)作用，有研究者發(fā)現(xiàn)，胃腸激素水平變化引起患者胃腸功能障礙，其臨床表現(xiàn)以胃排空延遲，胃排空速度減慢為主.MTL是參與調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要由十二指腸、空腸上段粘膜內(nèi)的M細(xì)胞分泌，在大多數(shù)哺乳動(dòng)物上消化道均有表達(dá)，在消化期間呈周期性釋放，作用于消化道平滑肌上的MTL受體，具有增強(qiáng)平滑肌收縮，加速胃內(nèi)容物排空速度，縮短小腸傳輸時(shí)間，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力的作用[16]，有研究者認(rèn)為，F(xiàn)D患者存在胃排空延長、胃收縮減弱及Ⅲ期收縮缺乏的癥狀均與MTL含量下降有關(guān)，F(xiàn)D患者胃排空功能障礙與MTL含量緊密相關(guān)[17].Ghrelin是由胃體X/A樣內(nèi)分泌細(xì)胞分泌，存在于胃腸道，主要是在胃中合成，能夠增強(qiáng)胃腸動(dòng)力及腺體分泌，具有保護(hù)胃粘膜的作用[18].研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可通過刺激迷走神經(jīng)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)胃酸分泌的作用，同時(shí)，Ghrelin可通過調(diào)節(jié)胃腸激素水平變化來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)胃腸功能運(yùn)動(dòng)的作用.Date等[19]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠注射Ghrelin后，小鼠體內(nèi)NO含量增加，而采用NOS抑制劑可以阻斷感覺神經(jīng)傳導(dǎo)，進(jìn)而阻斷Ghrelin對(duì)胃粘膜的保護(hù)作用.另外，也有研究顯示，Ghrelin可引起胃部不成熟的MMCⅢ相發(fā)生，并誘發(fā)胃強(qiáng)烈的收縮運(yùn)動(dòng)，從而引起MTL分泌的紊亂.NO是廣泛存在于胃腸道的非膽堿能非腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)，是對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)具有抑制作用，主要介導(dǎo)胃容受性舒張的反射活動(dòng)，還具有對(duì)抗乙酰膽堿和MTL對(duì)胃的收縮作用，影響胃的縮張，蠕動(dòng)和排空，其水平過高過低都會(huì)導(dǎo)致胃腸動(dòng)力障礙[20-21].本研究中，B組大鼠血漿MTL含量與A組無差異，但Ghrelin含量上升9.76%，差異顯著(P<0.05)，胃竇NO含量較A組減少57.48%，差異極顯著(P<0.01)，以上結(jié)果說明飲食失節(jié)對(duì)FD大鼠MTL含量變化并無影響，而能明顯增加大鼠Ghrelin含量，以增強(qiáng)胃腸動(dòng)力，改善胃腸功能紊亂狀態(tài).而在本研究中，B組大鼠胃竇組織NO水平顯著低于A組，這與之前報(bào)道FD大鼠體內(nèi)NO含量增加不符，推測可能是由于該組大鼠胃腸動(dòng)力過弱，機(jī)體不再產(chǎn)生抑制性神經(jīng)遞質(zhì)減弱胃腸運(yùn)動(dòng)引起的.

腸道菌群是指生活在腸道中的大量微生物，二者僅僅相依，維持機(jī)體腸道及其他各器官功能正常，腸易激綜合癥(IBS)[22]、克羅恩病[23]以及各種腸道疾病中[24-26]，腸道菌群平衡都會(huì)被打破，菌群紊亂，引起腸道菌群平衡紊亂的誘因復(fù)雜多樣，其中飲食是最容易接觸腸道菌群的因素.在本研究中，SD大鼠在受到饑飽失常刺激后，腸道菌群發(fā)生改變，在OTU水平，B組大鼠腸道菌群種類明顯不同于A組.雙歧桿菌在胃腸道中具有改善胃腸道功能的作用，緩解腸道炎癥和腸易激綜合征癥狀等[27]，本研究中B組大鼠腸道中雙歧桿菌相對(duì)豐度提高1.33%，推測B組大鼠胃腸功能出現(xiàn)障礙.丁酸鹽在機(jī)體內(nèi)能夠通過腸-腦神經(jīng)回路降低食欲，并且激活棕色脂肪細(xì)胞發(fā)揮功能使機(jī)體體質(zhì)量減輕[28]，本研究中B組大鼠兩種與丁酸鹽產(chǎn)生相關(guān)的菌Bacteroidales_S24-7_group和Ruminococcaceae相對(duì)豐度較A組分別降低14.65%、13.17%，推測這2種菌豐度下降導(dǎo)致該組大鼠體內(nèi)丁酸鹽產(chǎn)生減少，引起大鼠食欲增加，進(jìn)食量與體質(zhì)量增加，與上述研究結(jié)果一致.另外，B組大鼠腸道內(nèi)兩種與機(jī)體糖代謝相關(guān)的菌Lactobacillaceae，Enterobacteriaceae相對(duì)豐度也增加.基于胃腸激素水平與腸道菌群多樣性的變化，本研究在門水平對(duì)2者之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與肥胖關(guān)系緊密的厚壁菌門細(xì)菌相對(duì)豐度與Ghrelin含量呈正相關(guān)，而與MTL含量呈負(fù)相關(guān)，而擬桿菌門則正好相反.根據(jù)以上結(jié)果可得飲食失節(jié)能導(dǎo)致機(jī)體腸道菌群發(fā)生明顯變化，其原因可能是胃腸激素水平變化引起胃腸動(dòng)力減弱甚至消失，導(dǎo)致腸內(nèi)容物大量滯留，導(dǎo)致細(xì)菌過度繁殖，進(jìn)而出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象，這種改變可能進(jìn)一步促進(jìn)功能性消化不良癥的形成.

4 結(jié)論

綜上，飲食失節(jié)在一定時(shí)間內(nèi)能夠?qū)е麓笫篌w質(zhì)量減輕，進(jìn)食量增加，且出現(xiàn)胃腸道功能障礙，胃排空速度減慢，Ghrelin含量上升，NO含量下降，并使其大鼠腸道菌群多樣性發(fā)生變化，這可能是不良飲食導(dǎo)致功能性消化不良的原因之一，具體研究有待深入探索.