毛燕琴，劉敬，陳積紅，3，胡偉，王曙陽，李文建，3

(1.中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；3.甘肅省輻照誘變育種工程實驗室，甘肅 武威 733001)

果葡糖漿亦稱高果糖漿(high fructose syrup)或異構(gòu)糖漿，是以酶法糖化淀粉所得的糖化液經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將其中一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，由葡萄糖和果糖組成的一種混合糖漿[1-2].果葡糖漿甜度與蔗糖相近，且具有冷甜性、滲透壓大、易于吸收、抗結(jié)晶性強、溶解度高、抗齲齒性、保濕性好等優(yōu)良特性，被廣泛應(yīng)用到醫(yī)療保健行業(yè)與食品工業(yè)中[3-6].在果葡糖漿生產(chǎn)過程中，葡萄糖、果糖含量的變化是生產(chǎn)過程的重要參數(shù)指標(biāo)，因此快速準(zhǔn)確測定其含量變化具有重要的實際意義.

目前，糖類物質(zhì)的檢測方法有滴定法、容量法、色譜分析法[7-8]、比色法[9]、旋光法[10].如翟建云等利用分光光度法測定毛竹快速生長期莖稈不同節(jié)間果糖、葡萄糖的變化[11]，姚令文等用超高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器法測定生脈注射液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量[12].根據(jù)我國檢測食品單糖和二糖的國標(biāo)GB 5009.8-2016[13]規(guī)定，果糖、葡萄糖、蔗糖的檢出限為0.2%.高效液相色譜法很容易達到這樣的檢測指標(biāo)，但在實驗研究中，經(jīng)常需要實時檢測衡量的單糖、二糖含量.這時就需要更靈敏的檢測器.

質(zhì)譜檢測器相對于其他檢測器具有更高的靈敏度，且對樣品純度的要求更低，減少了工作量和分析時間[14].液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒別力強的特點和液相色譜分離度高的優(yōu)勢，具有高通量、靈敏度高、準(zhǔn)確性強、操作簡單等特點，是配備質(zhì)譜的實驗室可選用的最佳檢測技術(shù)[15].現(xiàn)在已有利用超高壓液相色譜-質(zhì)譜連用檢測葡萄糖、果糖及低聚糖的報道[16-17].但是鑒于單糖極性弱的缺點，在具體檢測過程中需要在流動相中加入甲酸銨以提高檢測精確度，現(xiàn)有文獻對甲酸銨濃度對液質(zhì)聯(lián)用檢測果糖、葡萄糖的影響尚無具體報道.本研究擬建立超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定果葡糖漿中葡萄糖、果糖含量的實驗方法.通過優(yōu)化質(zhì)譜條件(碰撞能量)，優(yōu)化目標(biāo)物的檢出限；通過優(yōu)化色譜條件(梯度洗脫程序、流動相的比例、甲酸銨濃度)，實現(xiàn)葡萄糖、果糖在色譜柱中的良好分離；以期建立一種準(zhǔn)確、靈敏、快速的檢測方法，為果葡糖漿生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜高粱果葡糖漿(甘肅省輻照誘變育種工程實驗室提供)、葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)品(純物質(zhì))、甲酸銨(純度≥99.0%)購自美國Sigma公司、乙腈(色譜純)購自美國Fisher公司；水(高純水)，購自屈臣氏.

1.2 儀器與設(shè)備

進樣瓶(2 mL)，甘肅海智色譜技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯針頭過濾器(13 mm，0.22 μm)，甘肅海智色譜技術(shù)有限公司；BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，美國Waters公司；TE101-L天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Qube超高壓液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜工作站，BRUKER.

1.3 試驗方法

1.3.1 質(zhì)譜條件的選擇 分別用75%乙腈配制濃度分別為3.9、13 μg/mL葡萄糖、果糖的單標(biāo)溶液，采用直接進樣方式分別注入HESI離子源中，進樣量為1 μL，流速為200 μL/min，噴霧電壓(+)為4 000 V，噴霧電壓(-)為3 500 V，加熱探針溫度為400 ℃，錐體溫度為350 ℃，在負(fù)離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到葡萄糖、果糖的分子離子，再以每種糖的準(zhǔn)分子離子峰為母離子，進行二級質(zhì)譜掃描，采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，根據(jù)碎片離子信息，選擇2種糖的最佳質(zhì)譜參數(shù).

1.3.2 色譜條件的選擇 色譜柱：BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：室溫；進樣量：1 μL；柱壓：75 bar；流速：200 μL/min；流動相：A相為甲酸銨水溶液，B相為乙腈.梯度洗脫程序見表1.

表1 梯度洗脫程序

1.3.2.1 流動相比例對檢測結(jié)果的影響 以A相20 mmol/L甲酸銨水溶液，B相乙腈為流動相，乙腈與水的比例分別為75∶25，85∶15，觀察所得到的色譜圖，選擇最適的流動相比例.樣品采用葡萄糖濃度為0.756 8 μg/mL、果糖濃度為0.801 9 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進樣量為1 μL，流速為200 μL/min.

1.3.2.2 甲酸銨濃度對檢測結(jié)果的影響 A相的甲酸銨濃度分別設(shè)計為5 mmol/L，20 mmol/L，40 mmol/L，檢測不同甲酸銨濃度對葡萄糖和果糖色譜結(jié)果的影響.樣品采用葡萄糖濃度為0.756 8 μg/mL、果糖濃度為0.801 9 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，流動相乙腈與水的比例為75∶25(V/V)，進樣量為1 μL，流速為200 μL/min.

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 分別準(zhǔn)確稱取390、1 300 μg葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)品，用75%乙腈溶液定容至1 mL，即390 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液、1 300 μg/mL果糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液.

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 用1.3.3.1配制的標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別依次配制葡萄糖質(zhì)量濃度分別為1.56、3.12、3.9、7.8、31.2 μg/mL、果糖質(zhì)量濃度分別為6.5、13、16.25、32.5、130 μg/mL的各系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液.

1.3.4 樣品處理 向甜高粱果葡糖漿樣品中添加3%活性炭，80 ℃攪拌中水浴0.5 h后，在轉(zhuǎn)速4 000 r/min條件下離心5 min，取上清液后在硅藻土助濾取上清液.吸取100 μL上清液于裝有900 μL 75%乙腈溶液的離心管中，渦旋混合均勻后即成10-1稀釋液，再按上述步驟依次稀釋到10-2、10-3稀釋液，渦旋混合均勻后用0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液作為供試樣品溶液，備用.

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

糖分分析用負(fù)離子模式質(zhì)譜響應(yīng)可達105級，而正離子模式響應(yīng)差[14]，因此本實驗采用負(fù)離子掃描方式.采用直接進樣方式分別將葡萄糖、果糖單標(biāo)溶液注入HESI離子源中，在負(fù)離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到葡萄糖、果糖的分子離子分別為179.1、179.1.分別以葡萄糖179.1、果糖179.1分子離子峰為母離子，進行二級質(zhì)譜掃描，得到碎片離子信息，然后再對二級質(zhì)譜參數(shù)如碰撞能量等進行優(yōu)化，使每種糖的定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對強度比例達到最大時為最佳，從而得到每種糖的最佳質(zhì)譜參數(shù)(表2).

表2 葡萄糖、果糖的質(zhì)譜分析條件參數(shù)

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動相比例對檢測結(jié)果的影響 按照不同流動相比例檢測樣品得到的色譜圖如圖1～2.從圖1～2可以看出，流動相乙腈與水的比例為75∶25條件下，在各峰的分離度較好的前提下保留時間也較短，所以選擇流動相乙腈與水的比例為75∶25進行樣品的檢測.因為出峰時間較短，所以本試驗的洗脫程序為先通過等度洗脫分離出果糖和葡萄糖，再進行梯度洗脫清除殘留樣品，最后恢復(fù)到進下一個樣品的AB相比例.葡萄糖和果糖為同分異構(gòu)體，不易分離，流動相中乙腈比例及其變化對化合物的保留有較大的影響，進而影響分離度及分離選擇性[18-19]，適當(dāng)增加流動相中乙腈含量有助于葡萄糖、果糖的分離[16]，本試驗結(jié)果與已有報道符合.

圖1 樣品色譜圖(乙腈∶水=85∶15)Figure 1 The chromatogram of sample(acetonitrile∶water=85∶15)

圖2 樣品色譜圖(乙腈∶水=75∶25)Figure 2 The chromatogram of sample (acetonitrile∶water = 75∶25)

2.2.2 甲酸銨濃度對檢測結(jié)果的影響 本試驗嘗試在流動相A相中加入甲酸銨，并研究不同濃度的甲酸銨對檢測結(jié)果的影響，添加不同濃度甲酸銨檢測樣品得到的色譜圖見圖3～5.從圖3～5可以看出，甲酸銨濃度對檢測結(jié)果有顯著影響，濃度過大或過小，都不能得到較好的峰形.A相用20 mmol/L的甲酸銨水溶液既能保證流動相基質(zhì)不干擾測定結(jié)果，也有效增強待測物質(zhì)的檢出信號，達到了預(yù)期效果.流動相條件的選擇主要考慮被分析物的分離、檢測的靈敏度和色譜峰形.有文獻報道流動相中加入緩沖鹽可以降低固定相與帶電荷溶質(zhì)之間的靜電作用，調(diào)節(jié)峰形及物質(zhì)的保留，不加緩沖鹽時易造成峰拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)[18].也有文獻報道[20]甲酸作為一種改性劑在一定程度上可以增強質(zhì)譜響應(yīng)，而且可以有效地改善色譜峰拖尾的現(xiàn)象.試驗結(jié)果與已有報道符合.

圖3 樣品色譜圖(甲酸銨濃度：5 mmol/L)Figure 3 The chromatogram of sample (the concentration of ammonium formate：5mmol/L)

圖4 樣品色譜圖(甲酸銨濃度：20 mmol/L)Figure 4 The chromatogram of sample (the concentration of ammonium formate:20 mmol/L)

圖5 樣品色譜圖(甲酸銨濃度：40 mmol/L)Figure 5 The chromatogram of sample (the concentration of ammonium formate:40 mmol/L)

2.2.3 工作曲線與檢出限 將1.3.3.2配制的各系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液在進樣量為1 μL，柱壓為75 bar，流速為200 μL/min，流動相：A相為20 mmol/L甲酸銨水溶液，B相為乙腈，且乙腈與水的比例為75∶25的條件下進行液質(zhì)聯(lián)用上機分析，以化合物的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按3倍RSN計算檢出限.結(jié)果表明，本方法在一定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99(表3)，檢出限明顯低于高效液相色譜法.

2.2.4 樣品檢測 將不同酶解條件的甜高粱果葡糖漿按上述1.3.4方法進行前處理，在進樣量為1 μL，柱壓為75 bar，流速為200 μL/min，流動相：A相為20 mmol/L甲酸銨水溶液，B相為乙腈，且乙腈與水的比例為75∶25的條件下進行液質(zhì)聯(lián)用上機分析.另外用分光光度法檢測所有樣品中葡萄糖、果糖含量.經(jīng)配對t檢驗，P≥0.05，2種方法檢測結(jié)果無顯著性差別，結(jié)果見表4.

表3 葡萄糖、果糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限

表4 樣品中葡萄糖和果糖含量檢測結(jié)果

3 討論

流動相條件的選擇主要考慮被分析物的分離、色譜峰形和檢測的靈敏度。葡萄糖和果糖為同分異構(gòu)體，液相色譜不易分離。在液相色譜模式中通常以高比例有機溶劑(常為乙腈)為流動相[18]，通過逐漸增大水的比例調(diào)節(jié)流動相的極性，依次洗脫出極性不同的溶質(zhì)。該色譜模式中，化合物的保留隨其極性的增大而增強，流動相中有機相的含量是控制分離的主要因素。并發(fā)現(xiàn)，流動相中乙腈比例及其變化對化合物保留的影響較大，進而影響分離選擇性及分離度[19]，適當(dāng)增加流動相中乙腈含量有助于果糖、葡萄糖的分離[16]。通過試驗發(fā)現(xiàn)，采用水-乙腈(25∶75，V/V)時，可以較好地分離樣品中果糖、葡萄糖，且保留時間也較短。單糖極性較弱，需要在流動相A相中加入一些易揮發(fā)鹽的緩沖液來提高檢測精確度，如甲酸銨、乙酸銨，也可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等。通過實驗發(fā)現(xiàn)，流動相A相用20 mmol/L的甲酸銨水溶液，在保證流動相基質(zhì)不影響檢測結(jié)果的前提下，增強了待測物質(zhì)的檢出信號。

果葡糖漿中果糖、葡萄糖含量較高，用75%乙腈多倍稀釋后可有效減小基質(zhì)效應(yīng)，因此樣品需采用75%乙腈依次稀釋1 000倍后用0.22 μm微孔濾膜過濾后才可進樣分析。

采用高效液相色譜法對糖類分析，檢測器可以采用示差檢測器，蒸發(fā)光檢測器，紫外檢測器。紫外檢測法測定響應(yīng)值低，準(zhǔn)確度差；示差折光檢測法受溫度等外界條件影響較大，方法穩(wěn)定性差、基線噪聲大[21]。本文建立的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法，作為一種通用型檢測器，對溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，靈敏度高。

4 結(jié)論

本試驗建立了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定果葡糖漿中葡萄糖、果糖含量的測定方法。利用性能可靠的BEH Amide色譜柱，參照本方法，在10 min內(nèi)即可完成果葡糖漿中的糖成分的定量分析，相較于其他檢測方法，縮短了分析時間，并且檢出限低(葡萄糖0.32 μg/mL，果糖0.74 μg/mL)，靈敏度高，是測定葡萄糖和果糖含量的一個精確方法。新建立的方法操作簡便、分析速度快、靈敏度高，更適用于分析果葡糖漿中的糖的組分。