劉雷雷，賈啟鵬，李宗帥，楊洋，李海江，趙興緒，張勇

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1)是1種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)膜蛋白[1]，在合成單不飽和脂肪酸(MUFA)棕櫚油酸和油酸的過程中具有重要作用[2]，可以將飽和脂肪酸分解為不飽和脂肪酸，這一酶促反應(yīng)在機(jī)體的不飽和脂肪酸儲(chǔ)備中起到重要作用[3].同時(shí)SCD1還能催化trans11-C18∶1(tll-C18∶1)生成cis9，trans11-共扼亞油酸(c9，t11-CLA)[4].MUFA和共扼亞油酸(CLA)具有調(diào)節(jié)血液中膽固醇含量，防止心血管疾病，提高免疫力等作用，其中CLA能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)[5].因此，通過對(duì)敲除SCD1基因動(dòng)物模型的研究，可以間接研究人類一些疾病的發(fā)病機(jī)制[6].

基于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器，是在動(dòng)物基因組中通過轉(zhuǎn)入外源性靶基因并定位表達(dá)于乳腺，利用其天然、高效分泌蛋白的能力，在動(dòng)物的乳汁中生產(chǎn)一些具有重要價(jià)值產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的總稱[7].有研究報(bào)道乳制品提供高質(zhì)量的蛋白質(zhì)和其他微量營養(yǎng)素，對(duì)人類飲食中不飽和脂肪酸有顯著貢獻(xiàn)[8]，而不飽和脂肪酸的含量與人類許多疾病有著密切關(guān)系，因此，可以使用基因編輯技術(shù)來增加動(dòng)物乳汁中不飽和脂肪酸含量，從而來改善人類的身體健康.牛乳中含有豐富的s1-酪蛋白，它是人體對(duì)乳蛋白最主要的過敏源，然而，羊奶在營養(yǎng)成分上更接近于人奶，其富含β-乳球蛋白，賦予其更高的可消化性，并降低了其易過敏性，更適合老年人和嬰幼兒等腸胃較為脆弱的人群飲用[9]，因此，可以通過基因編輯技術(shù)改良山羊品種從而提高羊奶品質(zhì).

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)結(jié)構(gòu)與一些功能相關(guān)的蛋白(CRISPR-as-sociated，Cas)組成的一種定點(diǎn)基因編輯技術(shù)，當(dāng)其被發(fā)現(xiàn)后科學(xué)家已證實(shí)該技術(shù)在細(xì)菌[10]、植物[11]、動(dòng)物[12]以及人類細(xì)胞[13]上都表現(xiàn)出強(qiáng)大的基因編輯能力.由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)擁有簡(jiǎn)單、高效的作用機(jī)制[14]，使其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)來生產(chǎn)動(dòng)物模型，研究人類疾病或改良家畜品種及其衍生產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值，必然會(huì)成為研究熱點(diǎn)[15-17].本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞SCD1基因設(shè)計(jì)并篩選出能夠高效切割的sgRNA，來證實(shí)該基因編輯技術(shù)可以應(yīng)用于奶山羊，為以后在該動(dòng)物敲入外源性基因奠定理論基礎(chǔ)；同時(shí)使用雙敲除載體共轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的方法來獲得敲除SCD1基因的GFFs，為生產(chǎn)敲除SCD1基因奶山羊動(dòng)物模型提供核供體材料.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞F2代，實(shí)驗(yàn)室保存；PX330-eGFP質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)室保存；pEASY-Blunt載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 如表1所示，使用Primer5設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物后，送金唯智公司合成.

表1 檢測(cè)引物序列信息

1.2.2 sgRNA的合成及程序性退火 通過查找奶山羊SCD1基因編碼區(qū)序列(ID：GU947654.1)，使用靶位點(diǎn)在線預(yù)測(cè)工具(http://crispr.mit.edu/)，按照“20N+NGG”原則在該基因第4外顯子和第6外顯子處設(shè)計(jì)6對(duì)sgRNA寡聚核苷酸序列(表2)，分別在有義鏈5′端添加CACC，模板鏈5′端添加AAAC酶切位點(diǎn)送金唯智公司合成之后，將單鏈sgRNA程序性退火變?yōu)楹ば阅┒说碾p鏈.

1.2.3 敲除載體的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ對(duì)PX330-eGFP質(zhì)粒進(jìn)行酶切處理后，純化回收酶切產(chǎn)物.然后，利用T4DNA連接酶將程序性退火的雙鏈sgRNA連接到酶切后純化回收的產(chǎn)物，之后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，并均勻鋪于含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)皿上37 ℃過夜培養(yǎng)，第2天挑取單菌落溶于10 μL ddH2O，以U6上游引物和各個(gè)sgRNA的oligo2為下游引物進(jìn)行菌液PCR及測(cè)序驗(yàn)證.

表2 設(shè)計(jì)的sgRNA寡聚核苷酸序列

1.2.4 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及切割效率的檢測(cè) 復(fù)蘇奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞F2代，經(jīng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待轉(zhuǎn)染48 h后使用流式細(xì)胞分選儀分選出綠色熒光細(xì)胞并提取細(xì)胞基因組DNA，之后使用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增各靶點(diǎn)上下游共計(jì)609 bp(上游引物為J4F，下游引物為J4R)及703 bp(上游引物為J6F，下游引物為J6R)的片段，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收目的片段.將目的片段連接到pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氨芐平板上37 ℃過夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落，PCR檢測(cè)(上游引物為M13F，下游引物為M13R)后送生物公司測(cè)序.

1.2.5 PX330-eGFP-sgRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞 分別選擇第4外顯子和第6外顯子處具有高效敲除效率的sgRNA兩兩組合，按照4 μg質(zhì)粒和10 μL脂質(zhì)體共同轉(zhuǎn)染到奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，48 h后使用流式細(xì)胞分選儀篩選出綠色熒光細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng).

1.2.7 Western Blot檢測(cè) 提取綠色熒光細(xì)胞總蛋白后，步驟參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[18].相應(yīng)的一抗(按1∶400 的比例溶解于5%脫脂奶粉的PBST溶液)4 ℃過夜孵育，辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)的二抗(按1∶5000 的比例溶解于5%脫脂奶粉的PBST溶液)37 ℃孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光液后，X膠片曝光進(jìn)行顯影和拍照.

M：DNA marker DL10000；1：PX330酶切；2：PX330質(zhì)粒.M：DNA marker DL10000；1：PX330 digestion；2：pX330 plasmid.圖1 PX330-eGFP酶切鑒定Figure 1 The identification results of PX330-eGFP digestion

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體的構(gòu)建

如圖1所示，PX330-eGFP經(jīng)限制性內(nèi)切酶BbsⅠ單酶切后出現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果大小相符的條帶，表明PX330-eGFP質(zhì)粒酶切成功.使用U6上游引物和各個(gè)sgRNA的oligo2為下游引物挑取陽性菌落，如圖2所示，菌落PCR瓊脂糖電泳結(jié)果與目的條帶(103 bp)大小相符.接著將條帶大小相符的菌落搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，次日提取質(zhì)粒后送生物公司測(cè)序.如圖3所示，測(cè)序峰圖表明PX330-eGFP-sgRNA敲除載體構(gòu)建成功.

M：DNA marker DL2000；1：sgRNA F1；2：sgRNA F2；3：sgRNA F3；4：sgRNA S1；5：sgRNA S2；6：sgRNA S3.M：DNA marker DL2000;1：sgRNA F1；2：sgRNA F2；3:sgRNA F3；4：sgRNA S1；5：sgRNA S2；6：sgRNA S3.圖2 Oligo退火產(chǎn)物連接至PX330-eGFP菌落PCR結(jié)果Figure 2 PCR result of the oligo plus PX330-eGFP plasmid construct

圖3 Oligo退火產(chǎn)物連接至PX330-eGFP質(zhì)粒測(cè)序峰Figure 3 Oligo annealing product is ligated to PX330-eGFP plasmid sequencing peak

2.2 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果

如圖4所示，PX330-eGFP-sgRNA載體轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞48 h后，均出現(xiàn)綠色熒光陽性細(xì)胞，表明奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功.

A-F分別是敲除載體PX330-eGFP-sgRNAF1、PX330-eGFP-sgRNAF2、PX330-eGFP-sgRNAF3、PX330-eGFP-sgRNAS1、PX330-eGFP-sgRNAS2、PX330-eGFP-sgRNAS3轉(zhuǎn)染GFFs 48 h后的結(jié)果.A-F were the result of knockout vectors PX330-eGFP-sgRNAF1,PX330-eGFP-sgRNAF2,PX330-eGFP-sgRNAF3,PX330-eGFP-sgRNAS1,PX330-eGFP-sgRNAS2,and PX330-eGFP-sgRNAS3 were transfected into GFFs for 48 h.圖4 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h熒光表達(dá)(X100)Figure 4 Fluorescent expression of fetal goat fibroblasts transfected for 48 h(X100)

圖5 熒光細(xì)胞流式分選結(jié)果(示部分)Figure 5 The results of fluorescent cell flow sorting

2.3 分選陽性細(xì)胞及其PCR檢測(cè)

使用流式細(xì)胞儀在515 nm藍(lán)光波長(zhǎng)激發(fā)下分選出熒光細(xì)胞，如圖5所示，熒光細(xì)胞轉(zhuǎn)染率可以達(dá)到14.2%.提取熒光細(xì)胞基因組DNA，使用檢測(cè)引物J4F/J4R和J6F/J6R分別對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖6所示，得到條帶大小與預(yù)期條帶大小(609、703 bp)相符合，說明陽性細(xì)胞擴(kuò)增成功.

2.4 不同靶位點(diǎn)sgRNA敲除效率的篩選

將TA克隆菌落PCR DNA片段檢測(cè)陽性的質(zhì)粒送公司測(cè)序后，使用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果和野生型(WT)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖7所示(示部分結(jié)果).根據(jù)DNAMAN比對(duì)結(jié)果對(duì)每個(gè)sgRNA在靶位點(diǎn)造成的突變、插入或刪除情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表3所示，結(jié)果表明6個(gè)sgRNA中sgRNA F1與sgRNA S3發(fā)生脫靶， sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1和sgRNA S2具有敲除作用，其效率分別為41.67%、30.77%、6.67%和28.57%.

2.5 敲除SCD1基因GFFs的制備

將試驗(yàn)組和對(duì)照組轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞，待48 h后分選熒光細(xì)胞，提取細(xì)胞中總RNA和總蛋白.使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞SCD1在mRNA水平上的變化情況.使用Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞SCD1在蛋白水平上的表達(dá).將實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果使用Tukey法比對(duì)分析后，結(jié)果表明雙載體敲除細(xì)胞的SCD1在mRNA水平上的表達(dá)與對(duì)照組相比存在顯著差異(圖8，P<0.05),sgRNA-F2-S2與sgRNA-F3-S2不存在顯著差異，說明兩種組合都可以有效降低奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞SCD1在mRNA水平上的表達(dá).Western Blot結(jié)果顯示，在雙載體轉(zhuǎn)染的陽性熒光細(xì)胞中未表達(dá)SCD1蛋白(圖9)，說明sgRNA-F2-S2與sgRNA-F3-S2 2種組合均能有效敲除奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞中SCD1基因.

M：DNA marker DL2000；1：sgRNA F1；2：sgRNA F2；3：sgRNA F3；4：sgRNA S1；5：sgRNA S2；6：sgRNA S3；NC：陰性對(duì)照.M：DNA marker DL2000；1：sgRNA F1 test result；2：sgRNA F2 test result；3：sgRNA F3 test result；4：sgRNA S1 test result；5：sgRNA S2 test result；6：sgRNA S3 test result；NC：Negative control.圖6 熒光細(xì)胞基因組DNA PCR電泳Figure 6 Agarose electrophoresis of PCR products from fluorescent cell genomic DNA

-：堿基刪除；+：堿基插入；△：堿基突變.-：Base deletion；+：Base insertion；△：Base mutation.圖7 靶位點(diǎn)PCR DNA片段TA克隆測(cè)序比對(duì)結(jié)果(示部分)Figure 7 The results of target site PCR DNA fragment TA cloning sequencing alignment genome

表3 靶位點(diǎn)sgRNA敲除效率統(tǒng)計(jì)Table 3 Knockout efficiency of sgRNA at target site

圖8 各組細(xì)胞中SCD1基因mRNA的表達(dá)Figure 8 Expression of SCD1 mRNA in each group of cells

1：轉(zhuǎn)染sgRNA-F2-S2陽性細(xì)胞總蛋白；2：GFFs總蛋白；3：轉(zhuǎn)染sgRNA-F3-S2陽性細(xì)胞總蛋白.1:Total protein transfected with sgRNA-F2-S2 positive cells;2:Total protein of GFFs;3:Total protein transfected with sgRNA-F3-S2 positive cells.圖9 Western Blot檢測(cè)SCD1蛋白表達(dá)Figure 9 Detection of SCD1 protein expression by Western Blot

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)提供了簡(jiǎn)單的，比ZFNs和TALENs更吸引人的基因編輯靶位點(diǎn)的選擇方法[19]，其核酸酶靶向編輯基因組的特異性體現(xiàn)于sgRNA中20個(gè)堿基的間隔序列(spacer)與基因組中的靶基因互補(bǔ)識(shí)別，從而介導(dǎo)Cas9核酸酶在靶點(diǎn)處切割DNA，產(chǎn)生雙鏈切口，實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)修飾[20].所以，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的SCD1基因敲除載體的構(gòu)建實(shí)質(zhì)是將20 bp靶序列DNA克隆至2段正向重復(fù)序列之間.本試驗(yàn)設(shè)通過設(shè)計(jì)2條互補(bǔ)的寡聚核苷酸直接程序性退火產(chǎn)生兩端帶有酶切位點(diǎn)靶序列DNA，然后將其克隆至含有相同酶切位點(diǎn)的PX330-eGFP載體，獲得針對(duì)敲除SCD1基因的載體，該方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)易、操作難度小以及成本低，可以實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9敲除載體的快速構(gòu)建.

脫靶現(xiàn)象幾乎是所有基因定點(diǎn)編輯技術(shù)所面臨的1個(gè)主要問題.CRISPR/Cas9技術(shù)因操作簡(jiǎn)易、高效、成本低等優(yōu)勢(shì)[21]，已被成功應(yīng)用于小鼠、斑馬魚、果蠅及大動(dòng)物等多種模式動(dòng)物，包括基因功能研究[22]、遺傳疾病治療等研究[23].然而其較高的脫靶效應(yīng)也受到了極大的關(guān)注，如若發(fā)生脫靶會(huì)造成基因組不穩(wěn)定，正?；蚬δ艿膯适?，限制了其在治療和臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[24].有研究顯示該系統(tǒng)在發(fā)揮基因編輯功能時(shí)造成脫靶效應(yīng)原因主要與sgRNA臨近PAM序列的GC含量有關(guān)[25].當(dāng)選擇1個(gè)合適的sgRNA 時(shí)，Guide序列第1個(gè)堿基處鳥嘌呤(G)是必須首選的，而胞嘧啶(C)是堅(jiān)決避免的.相反，在PAM序列附近第5個(gè)堿基處，首選的是胞嘧啶(C)，而不是鳥嘌呤(G)[26].本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了6個(gè)sgRNA，通過對(duì)陽性細(xì)胞靶位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行TA克隆和測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1及sgRNA S2切割效率分別為41.67%、30.77%、6.67%、28.57%，而sgRNA F1和sgRNA S3未發(fā)生基因編輯作用.其中sgRNA F2切割效率最高是由于設(shè)計(jì)的Guide序列第1個(gè)堿基為G，且G的含量較其它序列豐富，在體內(nèi)可以折疊形成G-四聯(lián)體，對(duì)sgRNA的穩(wěn)定性有一定的作用，但是sgRNA F1和sgRNA S3發(fā)生脫靶分析原因是由于Guide序列第1個(gè)堿基不是G，并且臨近PAM序列附近第5個(gè)堿基為G.因此，如何在提高Cas9切割效率的同時(shí)，減小脫靶效應(yīng)是CRISPR/Cas9開展應(yīng)用要進(jìn)一步研究和解決的科學(xué)問題.目前的研究主要集中在sgRNA的選擇、Cas9 的改造等減少脫靶效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面.第一，通過優(yōu)化設(shè)計(jì)sgRNA的寡聚核苷酸序列，如在其3′端減去一些核苷酸序列或者在其5′端添加個(gè)別序列，來改變sgRNA與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的序列[27].第二，通過控制轉(zhuǎn)染時(shí)sgRNA的用量，有研究表明轉(zhuǎn)染時(shí)低劑量的Cas9-sgRNA復(fù)合物濃度可以有效降低脫靶效率，但是過度降低sgRNA的用量也會(huì)導(dǎo)致其敲除效率的下降，所以需要合理的控制增加靶位點(diǎn)敲除效率與降低脫靶效應(yīng)之間的關(guān)系[28].第三，通過改造Cas9核酸酶，在Cas9的2種結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)RuvC或NHN分別插入D10A或H840A的突變，形成只切割靶位點(diǎn)1條鏈的Cas9突變酶，并應(yīng)用1對(duì)sgRNA分別在單鏈DNA上進(jìn)行切割，來降低脫靶效應(yīng)[29].第四，重新組裝無活性的Cas9與Fok I，有研究顯示將無活性的Cas9與Fok I 重新組裝形成f-Cas9復(fù)合物，其切割靶序列的特異性高出野生型140倍，并且比突變Cas9核酸酶的特異性也高出4倍[30].

由于設(shè)計(jì)的sgRNA靶向SCD1基因的編碼序列進(jìn)行切割，因此很大程度上能影響其蛋白的表達(dá).一般真核生物體內(nèi)斷裂的DNA雙鏈缺口是通過同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)2種方式來進(jìn)行修復(fù).HR修復(fù)可以將外源基因敲入到靶位點(diǎn)修復(fù)斷裂的DNA雙鏈，來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物.而NHEJ修復(fù)斷裂的DNA雙鏈，是通過引發(fā)切割位點(diǎn)DNA堿基插入、缺失或替換，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除[31].本研究就是利用NHEJ方式來修復(fù)DNA雙鏈缺口，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)各sgRNA引起靶點(diǎn)部分堿變化數(shù)大多為3的非整數(shù)倍，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是通過移碼突變?cè)斐苫蚪M蛋白無法正常被翻譯，從而來實(shí)現(xiàn)SCD1基因真正意義上的敲除[32].

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功從奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞SCD1基因第4外顯子和第6外顯子篩選出高效切割的sgRNA，其切割率最高分別為41.67%和28.57%，驗(yàn)證了該技術(shù)在奶山羊基因編輯應(yīng)用中的有效性.使用雙載體轉(zhuǎn)染方案，獲得了敲除SCD1基因的GFFs，為制備敲除SCD1基因奶山羊核供體提供了生物材料.