趙美淇，梁新強(qiáng)，劉海洲，宋慶峰，張夢(mèng)雅，毛莉莎，蔣士偲，杜江標(biāo)，曹 雪，崔 英

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)研究部,廣西 南寧530022)

研究表明，腫瘤的發(fā)生與機(jī)體免疫功能有著密切的聯(lián)系。人體的免疫細(xì)胞有很多種，其中外周血T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞起重要作用，T淋巴細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和抗腫瘤環(huán)節(jié)中，起到識(shí)別、標(biāo)記和清除腫瘤細(xì)胞的作用[1,2]，而自然殺傷細(xì)胞不僅與抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，還有可能參與自身免疫性疾病的發(fā)生。通過(guò)對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)，可以反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)[3]。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)腫瘤患者和健康人外周血 T 細(xì)胞亞群和 NK 細(xì)胞活性進(jìn)行研究,以了解機(jī)體的免疫狀態(tài)，分析其在健康人與腫瘤患者中的區(qū)別，為臨床診治提供相應(yīng)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年10月—2018年1月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的621例腫瘤患者作為腫瘤組，其中男406例，女215例，年齡16-88歲，平均年齡(54.58±12.25)歲；其中，肝癌183例，肺癌114例，胃癌168例，乳腺癌67例，鼻咽癌89例。所有患者均經(jīng)影像學(xué)、病理檢查明確診斷。選取同期到本院體檢的健康人115名為健康組，其中男76例，女39例，年齡25-69歲，平均年齡(53.97±13.08)歲。兩組患者性別構(gòu)成比、年齡等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05),可以進(jìn)行比較。

1.2 儀器與試劑

采用美國(guó)Beckman coulter公司生產(chǎn)的儀器與試劑，ABC溶血素，型號(hào)為Epics XL的流式細(xì)胞儀，型號(hào)為COULTERQ-PREP的自動(dòng)溶血儀，鼠抗人單克隆抗體CD45/CD4/CD8/CD3和鼠抗人單克隆抗體CD45/CD(16+56)/CD19/CD3。

1.3 檢測(cè)方法

被檢者分別于清晨空腹抽取5 ml肘靜脈血，將抽取的靜脈血置于含有乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)的試管中。從試管中吸取100 μl全血，與20 μl熒光素標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體 CD45/CD4/CD8/CD3、20 μl熒光素標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD45/CD(16+56)/CD19/CD3混勻，在室溫下進(jìn)行30 min避光反應(yīng)，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)前向和側(cè)向散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖，設(shè)“門(mén)”于白細(xì)胞共同抗原(CD45)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)5000個(gè)淋巴細(xì)胞，雙參數(shù)分析淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記，計(jì)算出CD3+、CD4+、CD8+、NK和CD19+細(xì)胞的百分比含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外周血淋巴細(xì)胞亞群在腫瘤組與健康組間的區(qū)別

腫瘤組外周血CD3+、CD4+、CD19+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+比值均低于健康組，NK細(xì)胞比例高于健康組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。健康組與腫瘤組間的CD8+值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 外周血淋巴細(xì)胞水平在不同類(lèi)型腫瘤患者間的區(qū)別

對(duì)鼻咽癌患者的數(shù)據(jù)分析顯示其CD3+、CD4+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+比值低于其他腫瘤患者(P<0.05)，NK細(xì)胞比例高于其他腫瘤患者(P<0.05)；乳腺癌患者的CD4+/CD8+比值低于其他腫瘤患者(P<0.05)；胃癌患者的CD3+細(xì)胞比例高于其他腫瘤患者，CD19+細(xì)胞比例低于其他腫瘤患者(P<0.05)；不同腫瘤患者間CD8+細(xì)胞比例無(wú)差異，見(jiàn)表2。

表2 腫瘤組不同腫瘤類(lèi)型患者淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

機(jī)體抵抗腫瘤的主要方式是由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，機(jī)體的免疫水平可以通過(guò)對(duì)腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)體現(xiàn)[4]。因此，對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化進(jìn)行檢測(cè)，可以快速、準(zhǔn)確的監(jiān)視機(jī)體免疫狀態(tài)。外周血T淋巴細(xì)胞亞群包含多種細(xì)胞，目前對(duì) CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的作用研究較多[5-8]。NK 細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中起到非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，NK細(xì)胞活化后通過(guò)細(xì)胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用，其機(jī)制是迅速分泌 IFN-α、IFN-γ、IL-2、GM-CSF 等細(xì)胞因子，與此同時(shí)，NK細(xì)胞可以對(duì)吞噬細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。B細(xì)胞是體內(nèi)唯一能夠產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，在B淋巴細(xì)胞表面有許多種跨膜蛋白，CD19分子是其中一種糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，它能夠調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活化、增殖，并以協(xié)同受體的形式參與B細(xì)胞的活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[10]。

本研究選擇廣西地區(qū)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤(肺癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌)[11]作為研究對(duì)象，用流式細(xì)胞儀對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤組與健康組比較，CD3+、CD4+、CD19+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+比值均低于健康組，NK細(xì)胞比例高于健康組。說(shuō)明腫瘤患者存在免疫抑制狀態(tài)，這種狀態(tài)對(duì)機(jī)體識(shí)別和殺傷突變細(xì)胞的能力產(chǎn)生了負(fù)面影響，引起免疫功能的失衡，這與國(guó)內(nèi)一些研究結(jié)果基本一致[12,13]。已有研究表明：腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中存在許多能夠抑制CD4+細(xì)胞成熟、分化的免疫抑制因子，同時(shí)CD8+細(xì)胞比例上升[14]，CD4+/ CD8+比值降低，使機(jī)體進(jìn)入免疫抑制狀態(tài)，導(dǎo)致免疫功能紊亂，腫瘤細(xì)胞無(wú)法被正常清除，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，使病情加速惡化[15]。在T淋巴細(xì)胞被抑制的同時(shí)，NK細(xì)胞比例有所升高，說(shuō)明NK細(xì)胞的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，提示腫瘤患者體內(nèi)的細(xì)胞免疫功能可能促進(jìn)并激活了NK細(xì)胞的增殖。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，患有不同腫瘤的個(gè)體外周血淋巴細(xì)胞比例有差異。其中鼻咽癌與其他腫瘤差異較大，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比例顯著低于其他腫瘤，NK細(xì)胞比例顯著高于其他腫瘤。乳腺癌的CD4+/CD8+比例低于其他腫瘤。胃癌的CD3+比例高于其他腫瘤，CD19+比例低于其他腫瘤。說(shuō)明惡性腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)、侵襲的過(guò)程中，由于組織來(lái)源、惡性程度等不同，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能也存在一定的差異[16]。這與國(guó)內(nèi)其他研究者的結(jié)果略有不同[17-20]，可能與入選腫瘤的類(lèi)別、樣本量及地域差異有很大關(guān)系。由于腫瘤來(lái)源的不同，有些腫瘤細(xì)胞如鼻咽癌細(xì)胞，其表面特異性受體的結(jié)構(gòu)與其他腫瘤有很大差異，使其自身產(chǎn)生不同于其他腫瘤的免疫逃逸機(jī)制，在識(shí)別與結(jié)合靶點(diǎn)方面，效應(yīng)性T細(xì)胞失去了應(yīng)有的準(zhǔn)確性，反饋抑制了CD4+、CD8+細(xì)胞等殺傷性淋巴細(xì)胞的增殖[21]。NK細(xì)胞比例升高可能是由于T細(xì)胞在殺傷腫瘤的過(guò)程中不斷增殖與進(jìn)化，NK細(xì)胞的非特異性殺傷功能無(wú)法識(shí)別發(fā)生變化的T細(xì)胞。因此，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，各淋巴細(xì)胞亞群的比例會(huì)隨著免疫微環(huán)境的改變而發(fā)生變化，若想及時(shí)有效地反映機(jī)體的完整免疫狀態(tài)，有必要全面的結(jié)合其他因子進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)[22]，才能更好地評(píng)估患者的病情與預(yù)后。

綜上所述，外周血中淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的變化對(duì)早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷惡性腫瘤具有一定的臨床價(jià)值。通過(guò)檢測(cè)不同淋巴細(xì)胞亞群的變化情況，可以及時(shí)了解惡性腫瘤患者的免疫狀態(tài)。