許雯，陸兆新，曹林

南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095

動脈粥樣硬化導(dǎo)致的心血管疾病是我國居民首要疾病死亡原因，居民患病率逐年持續(xù)上升[1]。在社區(qū)人群中篩查和防治心血管疾病、提高基層醫(yī)療機構(gòu)對心血管疾病的診療水平是居民健康管理的重要工作，也是改善我國心血管疾病現(xiàn)狀的重要途徑[2]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lipoproteinassociated phospholipase A2, Lp-PLA2) 是血管炎癥特異性標(biāo)志物，可以直接反映動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展進(jìn)程[3-4]，且可有效提高傳統(tǒng)動脈粥樣硬化預(yù)測模型的預(yù)測效力[5-7]。將Lp-PLA2應(yīng)用于社區(qū)人群篩查檢測，可幫助表面健康人群早期發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化潛在危險、早期防治，降低心血管疾病發(fā)病率；還可幫助動脈粥樣硬化患者判斷病情進(jìn)展、評估用藥效果等。

Lp-PLA2主要由成熟的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞合成并分泌，分子量為45 kDa[8-9]。當(dāng)血管中存在粥樣斑塊時，體內(nèi)的Lp-PLA2水平上升，且在不穩(wěn)定斑塊中強表達(dá)[3]。目前Lp-PLA2的常見檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法、膠乳增強免疫比濁法[10]，一方面這些檢測試劑依賴進(jìn)口抗體原料以及貴重檢測儀器，對檢測環(huán)境要求高，主要集中在三級醫(yī)院檢驗科，這使得Lp-PLA2的檢測無法在社區(qū)開展；另一方面，部分檢測試劑通過測定人體內(nèi)Lp-PLA2的酶活力作為判斷動脈粥樣硬化的依據(jù)，但臨床研究表明亞洲人群更適合使用免疫質(zhì)量法檢測作為判斷依據(jù)[11-13]。

因此，本研究擬通過真核細(xì)胞表達(dá)重組Lp-PLA2蛋白免疫小鼠，制備篩選高親和力、高特異性抗人Lp-PLA2單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合具有便攜式、檢測快、結(jié)果準(zhǔn)的即時檢驗(POCT) 技術(shù)[14]，初步建立Lp-PLA2量子點熒光免疫層析定量檢測方法，為臨床實現(xiàn)可社區(qū)化應(yīng)用的Lp-PLA2免疫學(xué)檢測提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Lp-PLA2血清樣本由南京鼓樓醫(yī)院提供，其中確診為動脈粥樣硬化樣本32例；BALB/c小鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；CHO-K1細(xì)胞為本實驗室保存；SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞系、CdSe/CdS/ZnS水溶性量子點、ClonExpress?ⅡOne Step試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；對比試劑購自美國diaDexus公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、抗體亞型測定試劑盒購自Sigma公司；潮霉素B、LipofectamineTM2000購自Thermo Fisher公司；其他各類試劑和培養(yǎng)液均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 Lp-PLA2重組蛋白制備

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

從NCBI上獲得Lp-PLA2的全長基因序列(NCBI Reference Sequence: NP_001161829.1)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后交蘇州金唯智生物科技有限公司合成，克隆構(gòu)建于pUC19載體。以合成的pUC19-Lp-PLA2為模板，擴增Lp-PLA2目的基因片段。設(shè)計引物 (UCOE-F: 5′-GTCGACCTGCAGGCATGCAA GCTGG-3′; UCOE-R: 5′-GGAGTTGGTCACCAGG GCCAGGGAC-3′) 線性化UCOE載體，使用ClonExpress?ⅡOne Step試劑盒構(gòu)建質(zhì)粒UCOELp-PLA2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機挑選克隆交測序公司進(jìn)行測序鑒定。測序結(jié)果正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒大提，去除內(nèi)毒素。

1.2.2 Lp-PLA2重組蛋白表達(dá)與純化

將凍存的CHO-K1細(xì)胞用CDM4CHO培養(yǎng)液(含6 mmol/L Gln) 進(jìn)行復(fù)蘇與傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞長滿80%以上。以LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑，參照轉(zhuǎn)染說明書用UCOE-Lp-PLA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，設(shè)置UCOE空載質(zhì)粒及無質(zhì)粒的對照組，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別用含0.4 mg/mL潮霉素B的培養(yǎng)液進(jìn)行加壓篩選，隔天監(jiān)測細(xì)胞狀態(tài)及活力，每4 d換液一次，培養(yǎng)2周后收集存活細(xì)胞。采用有限稀釋法輔以倍比稀釋法進(jìn)行單克隆篩選，挑選表達(dá)量大于20 μg/mL的克隆，調(diào)整初始細(xì)胞密度為3×105/mL擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞活力下降到70%時，收集細(xì)胞上清，0.45 μm超濾膜過濾后用Ni2+親和層析柱純化蛋白，目的蛋白用SDS-PAGE鑒定并用diaDexus公司Lp-PLA2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測重組蛋白反應(yīng)性。

1.3 抗人Lp-PLA2單克隆抗體的制備

將濃度為1 mg/mL的重組Lp-PLA2蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，選取6–8周齡的雌性BALB/c小鼠從跗關(guān)節(jié)處注射40 μg抗原進(jìn)行免疫。間隔1周，將濃度為1 mg/mL的重組Lp-PLA2蛋白與等量的弗氏不完全佐劑混合乳化，對小鼠進(jìn)行再次免疫，間隔1周加強免疫。3次免疫后尾靜脈采血，間接ELISA法檢測血清效價，選取效價最高的小鼠用于融合實驗。以PEG 1500作為融合劑，取對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，以1∶3的比例與免疫小鼠脾臟組織中的淋巴細(xì)胞在含有20% FBS血清的HAT-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。一周后觀察細(xì)胞融合狀態(tài)并換液，換液3 d后取細(xì)胞培養(yǎng)上清。以臨床確診為動脈粥樣硬化患者的血清為抗原，用間接ELISA法篩選陽性細(xì)胞株，選擇陽性值與細(xì)胞數(shù)比值較高的細(xì)胞進(jìn)行多次亞克隆，最終得到多株能夠穩(wěn)定分泌抗Lp-PLA2的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用小鼠腹水誘生法大量制備單克隆抗體并先后進(jìn)行飽和硫酸銨沉淀純化法、Protein A親和柱純化法純化抗體。

1.4 單克隆抗體特性鑒定

1.4.1 腹水單克隆抗體效價測定

腹水單克隆抗體的效價通過間接ELISA測定。以重組Lp-PLA2蛋白作為包被抗原，將純化的5種單克隆抗體分別按1∶1 000進(jìn)行倍比稀釋上樣，共稀釋12個梯度 (1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1 024 000、1∶2 048 000)，以SP2/0培養(yǎng)上清為陰性對照，OD450值高于陰性對照2.1倍以上判定為陽性孔，陽性結(jié)果中的最大稀釋度即為該腹水單克隆抗體的效價。

1.4.2 單克隆抗體亞型鑒定

采用抗體亞型測定試劑盒鑒定純化后單克隆抗體亞型。

1.4.3 單克隆抗體親和力測定

采用Bobrovnik等[15]的方法測定抗體親和力解離常數(shù) (Kd)，以重組Lp-PLA2蛋白為包被抗原，抗原稀釋至2.048×10–7、1.024×10–7、5.12×10–8、2.56×10–8、1.28×10–8、6.4×10–9、3.2×10–9、1.6×10–9、8×10–10、4×10–10、2×10–10、1×10–10mol/L，間接ELISA法檢測不同抗原包被濃度下抗體檢測的OD450值，按照公式 (1) 建立Ai/(A0–Ai) 與l/li的線性方程，斜率即為Kd值。

Kd為親和力解離常數(shù)；li為抗原濃度；A0為無抗原時抗體檢測OD值；Ai為抗原濃度為li時的抗體檢測OD值。

1.4.4 單克隆抗體特異性驗證

分別以Western blotting和間接ELISA法驗證獲得的5株單克隆抗體的特異性。取重組Lp-PLA2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后以純化后的5株單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，進(jìn)行Western blotting檢測。

選取濃度為23、125 ng/mL的Lp-PLA2陰性血清樣本和濃度為230、452、667 ng/mL的Lp-PLA2陽性血清樣本作為包被抗原，間接ELISA法檢測單抗特異性。

1.5 抗體配對篩選

免疫層析法檢測Lp-PLA2通過雙抗體夾心法實現(xiàn)，需要篩選一對可與抗原特異性結(jié)合且不受空間結(jié)構(gòu)影響的抗體。取親和力高的單抗采用雙抗夾心ELISA法進(jìn)行配對實驗[16]。以陽性血清樣本作為抗原，純化后單抗作為捕獲抗體包被至96孔板，再分別用HRP標(biāo)記各抗體作為檢測抗體，進(jìn)行配對初步篩選，保留一孔為陰性對照，對照孔樣品為等量陽性血清樣本，檢測各反應(yīng)孔OD450值。

1.6 免疫層析檢測方法建立

1.6.1 免疫層析檢測試劑制備

樣品墊制備：將樣品墊浸泡在包被緩沖液(0.02 mol/L HEPES，5% 海藻糖，1%酪蛋白，pH 8.0) 中5 min，室溫晾干后37 ℃烘干16 h。

標(biāo)記物墊制備：稀釋量子點原液至固含量為1%，加入終濃度分別為5 mg/mL和7.5 mg/mL的EDC、NHS水溶液，室溫孵育30 min。向體系中加入標(biāo)記抗體PLA5至終濃度為0.05 mg/mL，室溫孵育1 h。添加含有5% BSA的封閉液室溫孵育1 h。制備好的量子點-抗體標(biāo)記復(fù)合物離心后置換儲存液 (0.05 mol/L Tris-HCl，2% 蔗糖，0.2%BSA，pH 8.0)。以3.0 μL/cm的噴量在標(biāo)記物墊上噴涂量子點-抗體標(biāo)記復(fù)合物，45 ℃烘干16 h。

包被膜的制備：用蛋白固定液 (0.01 mol/L PBS，pH 7.4) 稀釋Lp-PLA2重組抗原至0.75 mg/mL作為檢測試紙條的質(zhì)控線 (C線)，稀釋包被抗體PLA1至1.0 mg/mL作為檢測試紙條的檢測線 (T線)，以0.8 μL/cm噴量在硝酸纖維素膜上分別包被兩種蛋白C線與T線之間間隔5 mm。37 ℃烘干16 h。

試劑卡組貼：按照試劑卡的結(jié)構(gòu)，包被膜位于PVC背襯板上，在整個結(jié)構(gòu)的最底層，標(biāo)記物墊與吸水棉漿紙分別組貼在包被膜兩側(cè)，樣品墊組貼于標(biāo)記物的另一側(cè)，組貼好試劑卡密封保存。

1.6.2 免疫層析檢測試劑評價

校準(zhǔn)曲線建立：稀釋重組Lp-PLA2蛋白至2 000、1 000、500、250、125、60、40、20、10 ng/mL作為校準(zhǔn)品。用制備的試紙條檢測校準(zhǔn)品各2次，計算T線與C線熒光強度的比值 (T/C值)。熒光強度檢測的激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為610 nm。以T/C值為縱坐標(biāo)，校準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線并計算線性范圍。

重復(fù)性評價：按照1.6.1中工藝制備3個批次的Lp-PLA2檢測試劑，并分別檢測Lp-PLA2濃度為175.0 ng/mL和350.5 ng/mL的臨床血清樣本，每個樣本重復(fù)檢測20次，計算批間變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV)。

臨床應(yīng)用比對：應(yīng)用自制試劑與diaDexus公司Lp-PLA2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒同時測試100例臨床血清樣本，其中陰性樣本68例，陽性樣本32例，以自制檢測系統(tǒng)為橫坐標(biāo)，diaDexus公司試劑盒檢測系統(tǒng)為縱坐標(biāo)，SPSS統(tǒng)計軟件作相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lp-PLA2目的基因擴增及質(zhì)粒鑒定

目的基因經(jīng)PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示在對應(yīng)大小處有目的條帶，且無雜帶，Lp-PLA2核酸片段大小約1 300 bp，鑒定結(jié)果如圖1所示。挑取單克隆進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果經(jīng)比對后發(fā)現(xiàn)序列完全正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 目的基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR products of target gene.

2.2 重組Lp-PLA2蛋白純化結(jié)果

重組質(zhì)粒UCOE-Lp-PLA2轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，并用潮霉素B作為篩選條件篩選可以穩(wěn)定分泌表達(dá)Lp-PLA2蛋白的細(xì)胞株。目的蛋白大小為45 kDa (圖2)，SDS-PAGE顯示細(xì)胞上清中雜蛋白較少，并且在目的蛋白分子量對應(yīng)處有明顯條帶，純化后目的蛋白純度達(dá)到90%以上，最終目的蛋白的產(chǎn)量為42.3 μg/mL。

2.3 重組蛋白反應(yīng)性評價

圖2 重組Lp-PLA2凝膠電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant Lp-PLA2.M: marker; 1: cell supernatant; 2: recombinant Lp-PLA2 protein.

重組Lp-PLA2蛋白用于小鼠的免疫以及檢測試劑校準(zhǔn)品、質(zhì)控線的制備。取純化后的重組Lp-PLA2蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，倍比稀釋至10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1 250 ng/mL、625 ng/mL、312.5 ng/mL、156.25 ng/mL，用diaDexus公司的Lp-PLA2試劑檢測蛋白稀釋液。結(jié)果見圖3，剔除因蛋白濃度過高而產(chǎn)生hook效應(yīng)的濃度點10 000 ng/mL和20 000 ng/mL后，檢測濃度和理論濃度間一致性好，R2=0.995 1，相關(guān)系數(shù)R=0.998>0.99，該重組抗原應(yīng)用于后續(xù)實驗。

2.4 單克隆抗體制備

經(jīng)細(xì)胞融合及篩選實驗后，共獲得5株能穩(wěn)定分泌抗人Lp-PLA2單克隆抗體且表達(dá)量在20 μg/mL的細(xì)胞株，分別命名為PLA1–PLA5。如圖4所示，純化后抗體經(jīng)還原SDS-PAGE分析，在50 kDa和25 kDa處有明顯的重鏈條帶和輕鏈條帶，且未見明顯雜帶，表明抗體經(jīng)純化后結(jié)構(gòu)完整并達(dá)到較高的純度，可用于后續(xù)實驗。

圖3 重組Lp-PLA2反應(yīng)性檢測結(jié)果Fig.3 Reactivity test results of recombinant Lp-PLA2.

圖4 SDS-PAGE檢測抗體純化結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified mAbs.

2.5 單克隆抗體特性鑒定

2.5.1 腹水單克隆抗體效價測定

腹水單克隆抗體通過間接ELISA測定其效價。PLA1–PLA5雜交瘤細(xì)胞制備腹水單克隆抗體后，間接ELISA測定腹水單克隆效價分別為1∶106、1∶106、1∶106、1∶105、1∶106。

2.5.2 單克隆抗體亞型鑒定

經(jīng)試劑盒鑒定，5株單克隆抗體均為IgG1型。

2.5.3 單克隆抗體親和力測定

以重組Lp-PLA2蛋白作為抗原，通過間接ELISA方法測定抗體親和力解離常數(shù)。結(jié)果表明PLA1、PLA2、PLA3、PLA4、PLA5的親和力解離常數(shù)分別為 1.8×10–9、3.4×10–8、2.0×10–8、2.7×10–6、3.1×10–8，PLA1、PLA2、PLA3、PLA5抗體親和力明顯高于PLA4，可用于后續(xù)抗體配對篩選。

2.5.4 單克隆抗體特異性驗證

通過Western blotting驗證單克隆抗體特異性，如圖5A所示，5株單克隆抗體均能與分子量為45 kDa的蛋白條帶反應(yīng)，與重組Lp-PLA2蛋白分子量相符，且反應(yīng)條帶單一，表明5株單克隆抗體均能特異性識別重組Lp-PLA2蛋白。

通過ELISA方法檢測抗體與天然抗原反應(yīng)特異性，如圖5B所示，5株單克隆抗體均與陽性血清反應(yīng)，且與血清中Lp-PLA2濃度線性相關(guān)，即說明5株單克隆抗體均能特異性識別人血中的Lp-PLA2。

2.6 抗體配對篩選

選擇PLA1、PLA2、PLA3及PLA5進(jìn)行抗體配對篩選實驗，當(dāng)檢測OD450值越高時，表明配對的效果越好。如表1所示，16種配對中PLA1、PLA2、PLA3間無法與抗原形成夾心配對，PLA5單克隆抗體與其他3株單抗均能形成良好配對，且PLA5作為檢測抗體時測試性能更佳。綜合配對及抗體鑒定結(jié)果，選擇配對良好且親和力最高的PLA1與PLA5為配對單克隆抗體進(jìn)行后續(xù)免疫層析檢測方法建立的實驗。

圖5 抗體特異性鑒定Fig.5 Identification of mAbs’ specificity.

表1 抗體配對篩選結(jié)果Table 1 Results of antibody pairing screening

2.7 免疫層析檢測方法建立

2.7.1 校準(zhǔn)曲線建立

通過計算層析試紙條檢測線 (T) 與質(zhì)控線 (C)檢測信號值的比值 (T/C) 與抗原濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖6所示，Lp-PLA2濃度在20–1 000 ng/mL之間時，T/C值與蛋白濃度線性相關(guān)，蛋白濃度越高，T/C值越高，線性擬合方程為y=0.013 2x+0.073 5，R2=0.998 3。因此本試劑的線性范圍為20–1 000 ng/mL。Lp-PLA2濃度在1 000–2 000 ng/mL時，未出現(xiàn)hook效應(yīng)，因此本試劑檢測上限為2 000 ng/mL。

2.7.2 重復(fù)性評價

用3個批次的Lp-PLA2免疫層析檢測試劑檢測濃度為175.0 ng/mL和350.5 ng/mL的臨床樣本各20次，計算每個樣本檢測結(jié)果的均值及CV。結(jié)果如表2所示，濃度為175.0 ng/mL的樣本檢測批間CV為5.88%；濃度為350.5 ng/mL的樣本檢測批間CV為4.29%，試劑批次間的變異系數(shù)均小于6%，精密性良好。

2.7.3 臨床應(yīng)用比對

圖6 Lp-PLA2量子點免疫層析試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of quantum dots-based Lp-PLA2 test strips.

表2 Lp-PLA2量子點免疫層析試劑重復(fù)性Table 2 Precision of quantum dots-based Lp-PLA2 test strips

圖7 兩種試劑盒相關(guān)性比對Fig.7 Comparison between quantum dots-based test kit and diaDexus ELISA test kit.

采用本實驗初步建立的Lp-PLA2定量檢測試劑與diaDexus公司Lp-PLA2檢測試劑進(jìn)行臨床比對，結(jié)果如圖7所示。比對實驗中采用兩種試劑平行測試100例臨床血清樣本，檢測結(jié)果經(jīng)線性回歸分析 (R2=0.981，P<0.001)，相關(guān)系數(shù)R=0.99，兩種檢測系統(tǒng)結(jié)果具有良好的相關(guān)性，兩種試劑檢測結(jié)果間無差異。

3 討論

動脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中等疾病的主要病理基礎(chǔ)[17]，通常經(jīng)過斑塊形成、斑塊破裂、形成血栓等病理過程而最終導(dǎo)致急性心血管事件，提早預(yù)防可以有效降低心血管疾病發(fā)病率。Lp-PLA2是血管炎癥獨立預(yù)測因子，與心血管疾病發(fā)生風(fēng)險呈顯著正相關(guān)，可用于心血管疾病的預(yù)測、治療和預(yù)后評估，在社區(qū)人群中進(jìn)行Lp-PLA2篩查檢測可以幫助居民進(jìn)行心血管健康管理。近年來，我國動脈粥樣硬化患病群體年齡不斷下降，未來成人疾病負(fù)擔(dān)將會不斷加重，通過提早預(yù)防來降低動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生率勢在必行。

Lp-PLA2免疫學(xué)檢測方法以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，高特異性、高親和力的單克隆抗體是決定檢測準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵性因素。Zhang等[18-19]在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)Lp-PLA2重組蛋白，其中昆蟲細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物具備蛋白活性且表達(dá)量最高，為6 μg/mL，純化后目的蛋白得率僅為2.7%，表達(dá)量較低且不易純化，在單抗制備、診斷試劑開發(fā)等多方面的應(yīng)用受到限制。李蘇亮等[20]選擇融合表達(dá)載體pBV220構(gòu)建pBV220-Lp-PLA2重組質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白，并免疫小鼠制備單克隆抗體；Huang等[21]構(gòu)建pCold TF-Lp-PLA2表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)得到帶有TF標(biāo)簽的重組Lp-PLA2蛋白，并以此作為免疫原制備得到抗Lp-PLA2兔多抗，兩種方法均采用了大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組Lp-PLA2蛋白，但是相比較于哺乳動物表達(dá)，原核系統(tǒng)缺少對重組蛋白的表達(dá)后修飾，作為免疫原會對抗體特性造成影響，Huang等[21]選擇TF標(biāo)簽增加目的蛋白可溶性，幫助重組蛋白正確翻譯折疊并提高表達(dá)水平，但是多克隆抗體的批次間制備差異不可控，因此并不適用于后續(xù)檢測方法的建立。沈鶴霄等[22]提出了在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中同時表達(dá)重組Lp-PLA2并將混合蛋白作為免疫原采用常規(guī)方法免疫小鼠制備單克隆抗體，這種方法抗原制備方法復(fù)雜，各系統(tǒng)制備所得重組Lp-PLA2的差異難以控制，以此作為免疫原制備得到的單克隆抗體特性受干擾因素較多，不適合應(yīng)用于對準(zhǔn)確度要求高的檢測試劑中。朱建安[23]通過多肽固相合成法直接合成Lp-PLA2抗原表位肽并與載體蛋白KLH連接作為免疫原制備得到對應(yīng)單克隆抗體，雖然此方法制備的抗體特異性更高，但是其與天然蛋白的親和力也因此受限，以此作為免疫檢測的關(guān)鍵材料會使得試劑檢測靈敏度受到相應(yīng)的局限。因此，本文選用CHO-K1真核表達(dá)系統(tǒng)[24-27]進(jìn)行重組Lp-PLA2蛋白的表達(dá)，一方面哺乳動物細(xì)胞翻譯后的加工修飾體系更完善，表達(dá)的外源蛋白更接近天然構(gòu)象[28]，可以免疫得到特異性、親和力更高的抗體，另一方面CHO-K1細(xì)胞通過胞外分泌的形式表達(dá)目的蛋白，雜蛋白少且易于純化，最終重組Lp-PLA2蛋白產(chǎn)量為42.3 μg/mL，經(jīng)SDS-PAGE與市售Lp-PLA2檢測試劑盒驗證，蛋白純度與反應(yīng)性均較優(yōu)。利用該重組蛋白免疫小鼠，篩選得到配對單克隆抗體PLA1和PLA5，兩株抗體親和力均達(dá)到1×10–8且能夠特異識別人血液中的Lp-PLA2。在采用雙抗夾心ELISA法進(jìn)行抗體配對評價實驗時發(fā)現(xiàn)，雖然PLA5與PLA1兩株抗體能夠兩兩配對，但是在PLA5用于檢測抗體時，OD450更高，這一現(xiàn)象同樣存在于PLA5與PLA2和PLA3配對反應(yīng)時，我們推測PLA1、PLA2、PLA3的抗原結(jié)合表位易受到標(biāo)記物的影響。因此在利用這一配對抗體進(jìn)行免疫層析方法建立時，選用PLA5抗體與示蹤物質(zhì)偶聯(lián)，以獲得更高的檢測靈敏度。

Lp-PLA2現(xiàn)有檢測技術(shù)中部分以測定酶活性為主，特異性差且檢測結(jié)果易受干擾。選用免疫質(zhì)量法檢測Lp-PLA2的方法學(xué)以ELISA和膠乳增強免疫比濁法為主，其中ELISA方法檢測準(zhǔn)確度高，但需經(jīng)過洗板、孵育等多個步驟，單次測定時間在2 h以上；膠乳增強免疫比濁法檢測快速準(zhǔn)確，但是檢測儀器對檢測環(huán)境及操作要求高，因此這兩種方法均不適合Lp-PLA2檢測在社區(qū)醫(yī)療機構(gòu)推廣應(yīng)用。本研究建立的Lp-PLA2熒光免疫層析檢測方法，選用新型熒光材料量子點作為示蹤物質(zhì)，避免了以膠體金為示蹤物質(zhì)的第一代免疫層析方法帶來的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的問題，并且提高了和抗體的生物相容性[29-30]，性能評估結(jié)果表明檢測線性范圍為20–1 000 ng/mL，批次間變異系數(shù)小于6%，重復(fù)性良好，與市售的ELISA檢測試劑進(jìn)行臨床比對，共檢測了100例血清樣本 (32例陽性樣本，68例陰性樣本)，兩種方法的檢測結(jié)果無顯著差異，本方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

本研究旨在通過抗體原料的開發(fā)，建立檢測準(zhǔn)確、操作簡便、儀器便攜、適用于社區(qū)醫(yī)療機構(gòu)的Lp-PLA2定量免疫層析檢測方法，為動脈粥樣硬化疾病防治提供切實可行的途徑。進(jìn)一步研究將對更大規(guī)模的臨床樣本 (如不同社區(qū)體檢人群的血清) 進(jìn)行檢測，并與其他檢測方法進(jìn)行比對，驗證本方法的可靠性，以期盡早獲得可以在社區(qū)醫(yī)療機構(gòu)推廣應(yīng)用的檢測試劑。