陳英，王培娟，張文君，楊丘旭，楊瑤

南京師范大學(xué) 金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097

乳酸菌 (Lactic acid bacteria，LAB) 是一類能夠利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，降低發(fā)酵產(chǎn)品的pH值，不形成芽孢的革蘭氏陽性、兼性厭氧細(xì)菌的總稱[1-2]。大多數(shù)乳酸菌無毒、無害，對(duì)人體及動(dòng)物體具有益生作用，因此被稱為益生菌[3-5]。隨著近20幾年來分子生物學(xué)的發(fā)展，以乳酸菌作為表達(dá)載體的高效基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用成為目前的研究熱點(diǎn)之一，一些外源基因也被報(bào)道在乳酸菌中表達(dá)成功[6]。例如，Renye等[7]利用在乳酸菌表達(dá)中常用的Nisin (乳酸鏈球菌素) 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)NICE生產(chǎn)片球菌素；Abdullah等[8]用乳酸菌表達(dá)菌株中常用的乳酸乳球菌NZ9000表達(dá)了大腸桿菌的熱休克蛋白DnaK。

熒光蛋白具有穩(wěn)定性強(qiáng)、無物種專一性、易于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)等特點(diǎn)[9-10]，因此，已作為標(biāo)記物而廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域[11-15]。目前，國(guó)內(nèi)已有熒光蛋白成功標(biāo)記乳酸菌的報(bào)道，但相關(guān)研究成果并不多。2009年，陳曉雷等[16]構(gòu)建了綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記穿梭表達(dá)載體pW425et-GFP，實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白GFP在嗜酸乳桿菌1.1878中的表達(dá)。2014年，徐一軻[17]成功構(gòu)建了表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白eGFP的重組乳酸乳球菌BLCC02-0018。2017年寇田田等[18]構(gòu)建了以紅色熒光蛋白基因 (dsred2) 為標(biāo)記，以α-淀粉酶(amy)為報(bào)告基因的表達(dá)載體，成功實(shí)現(xiàn)了融合基因dsred2-amy在干酪乳桿菌中的融合表達(dá)。前人報(bào)道表明不同熒光蛋白對(duì)不同宿主乳酸菌的標(biāo)記能力有強(qiáng)弱，因此，更多的熒光蛋白標(biāo)記需要被開發(fā)及應(yīng)用于更多乳酸菌宿主菌株。

近年來，紅色熒光蛋白mCherry用于熒光標(biāo)記的研究報(bào)道逐漸增多，相對(duì)其他熒光蛋白，該熒光標(biāo)記具有標(biāo)記基因小、背景低等優(yōu)點(diǎn)，且與已報(bào)道的dsred2紅色熒光基因相比，其熒光強(qiáng)度及穩(wěn)定性更好[19-25]。2015年van Zyl等[26]報(bào)道了利用mCherry熒光蛋白標(biāo)記蒙氏腸球菌ST4SA和植物乳桿菌423的研究，這是mCherry熒光蛋白標(biāo)記乳酸菌的首次報(bào)道，而國(guó)內(nèi)關(guān)于mCherry熒光蛋白標(biāo)記乳酸菌的研究尚未見報(bào)道。本文開展了mCherry熒光蛋白對(duì)植物乳桿菌的標(biāo)記研究，選用的植物乳桿菌WCFS1菌株是全基因組序列率先公布的乳酸桿菌，不僅自身具有益生和腸道中高存活率特性[27]，同時(shí)已有多個(gè)外源蛋白在該菌株中表達(dá)成功的報(bào)道[28-30]，是公認(rèn)的乳酸菌分子生物學(xué)研究中的模式菌株。膽鹽水解酶BSH是本實(shí)驗(yàn)室研究多年的乳酸菌功能性酶，近期研究報(bào)道該酶可能和乳酸菌腸道定植相關(guān)[31-32]。因此，本文通過建立以mCherry熒光蛋白為標(biāo)記、膽鹽水解酶基因bsh為報(bào)告基因的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，為更多外源活性蛋白在乳酸菌中進(jìn)行功能性研究奠定基礎(chǔ)，也為研究乳酸菌在生物體內(nèi)的定位、示蹤及益生性作用機(jī)制提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究中涉及使用的菌株和質(zhì)粒見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

大腸桿菌DH5α用LB培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)。植物乳桿菌用MRS培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)。在大腸桿菌中，氨芐青霉素、卡那霉素和紅霉素使用濃度分別為100 μg/mL、30 μg/mL和250 μg/mL。在乳酸菌中，紅霉素使用濃度為10 μg/mL，誘導(dǎo)劑SppIP使用濃度為25 ng/mL。

表1 本研究中的菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this work

1.1.3 引物

mCherry和egfp基因序列的特殊性設(shè)計(jì)共用引物如下：P1和P2，此對(duì)引物引入了NdeⅠ和XbaⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。根據(jù)質(zhì)粒pSIPH462上bsh基因序列，設(shè)計(jì)引物：bsh1和bsh2，在目標(biāo)片段兩端皆引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)。根據(jù)GenBank (登錄號(hào)為AL935263.2) 的WCFS1上ldhL基因的啟動(dòng)子序列、質(zhì)粒pMG36e上P32啟動(dòng)子序列和GenBank (登錄號(hào)為CP000416.1) 的短乳桿菌ATCC 367上slpA基因的啟動(dòng)子序列，分別設(shè)計(jì)引物對(duì)如下：PldhL1-PldhL2、P32F-P32R以及PslpA1-PslpA2，上游引物皆引入BglⅡ酶切位點(diǎn)，下游引物皆引入NcoⅠ和NdeⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。引物均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。本實(shí)驗(yàn)所需引物序列見表2。

1.1.4 主要試劑及儀器

限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ、rTaq、Ex Taq、DNA marker、PrimerStar Max和DNA切膠回收試劑盒購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素、溶菌酶、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、茚三酮等均購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；SppIP誘導(dǎo)肽 (序列：MAGNSSNFIHKIKQIFTHR) 也由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB(New England Biolabs)公司；His標(biāo)簽抗體等購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。牛磺膽酸鈉(Sodium Taurocholate，TCA) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

Personal PCR儀，AG 4309型高壓脈沖電擊轉(zhuǎn)化儀，1 mm電擊杯，CL-22M型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；HE-90型電泳儀，水平電泳槽，上海天能科技有限公司；生物樣品勻質(zhì)器，杭州奧盛儀器有限公司；IX73型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光蛋白eGFP和mCherry表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以載體pTracer-CMV3和pmCherry-C1質(zhì)粒DNA為模板，利用引物P1和P2分別擴(kuò)增egfp和mCherry基因，分別用NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切，與經(jīng)相同酶切處理的pSIPH460載體片段連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含紅霉素的LB平板上篩選。構(gòu)建獲得的處于啟動(dòng)子PsppA調(diào)控下的egfp基因和mCherry基因的誘導(dǎo)型重組載體分別命名為pSIPH471和pSIPH472。電轉(zhuǎn)化植物乳桿菌WCFS1感受態(tài)細(xì)胞后，獲得的重組菌命名為YeG471和YmC472，含空載質(zhì)粒pSIPH460的對(duì)照菌株命名為YE460。

表2 本研究中所使用的引物序列Table 2 Sequence of primers used in this study

1.2.2 熒光蛋白mCherry-BSH融合表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以本實(shí)驗(yàn)室保藏的含羅伊氏乳桿菌膽鹽水解酶bsh基因的pSIPH462質(zhì)粒為模板，利用引物對(duì)bsh1和bsh2通過PCR擴(kuò)增bsh基因，用XbaⅠ單酶處理回收片段，與經(jīng)相同酶處理的pSIPH472載體進(jìn)行連接，含紅霉素的LB平板上篩選，獲得的陽性克隆命名為pSIPH473。將pSIPH460、pSIPH462、pSIPH472和pSIPH473先后電轉(zhuǎn)化植物乳桿菌NB5462的感受態(tài)細(xì)胞中，獲得的重組菌株相應(yīng)命名為YbE460、YbB462、YbmC472和YbBmC473。

1.2.3 組成型熒光蛋白mCherry-BSH融合表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以植物乳桿菌WCFS1全基因組、質(zhì)粒pMG36e及短乳桿菌ATCC 367全基因組為模板，利用PldhL1-PldhL2、P32F-P32R和PslpA1-PslpA2引物對(duì)，分別擴(kuò)增PldhL、P32和PslpA3種啟動(dòng)子DNA片段，然后進(jìn)行TA克隆。測(cè)序正確的3種陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和BglⅡ雙酶切后，分別與經(jīng)相同酶處理的pSIPH473連接，構(gòu)建獲得的含啟動(dòng)子 PldhL、P32和 PslpA的載體分別命名為pLDHLH673、pP32H771和pSLPAH871。電轉(zhuǎn)化植物乳桿菌NB5462的感受態(tài)細(xì)胞后，獲得的重組菌株相應(yīng)命名為YbBmC673、YbBmC771和YbBmC871。

1.2.4 重組蛋白的表達(dá)及Western blotting鑒定

誘導(dǎo)型重組菌株經(jīng)25 ng/mL SppIP誘導(dǎo)表達(dá)過程按照Nguyen等所述方法進(jìn)行[28,33]。制備的粗酶液用Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，并通過調(diào)節(jié)蛋白濃度，使取液量中總蛋白量一致，12% SDS-PAGE檢測(cè)。轉(zhuǎn)PVDF膜，TBST洗滌10 min，浸于5%脫脂乳封閉液中，室溫下封閉1 h。封閉結(jié)束后，經(jīng)TBST振蕩洗滌，加入稀釋比例為1∶2 500 His標(biāo)簽抗體孵育液，孵育1 h后洗滌顯色。

1.2.5 重組蛋白表達(dá)的熒光活性觀察與檢測(cè)

將誘導(dǎo)表達(dá)或連續(xù)培養(yǎng)的菌液離心收集沉淀，用PBS洗滌2次，取10 μL滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在倒置熒光顯微鏡下分別觀察綠色和紅色熒光。

為建立生長(zhǎng)曲線和熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)線，重組菌株于100 mL培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，每隔2 h取樣，直至培養(yǎng)34 h停止。樣品經(jīng)PBS洗滌后，利用紫外分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀分別檢測(cè)樣品OD600值和熒光強(qiáng)度值，eGFP熒光蛋白于激發(fā)波長(zhǎng)EX：488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)EM：511 nm下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，mCherry熒光蛋白于激發(fā)波長(zhǎng)EX：587 nm和發(fā)射波長(zhǎng)EM：620 nm下檢測(cè)熒光強(qiáng)度[24]。

1.2.6 重組蛋白表達(dá)的膽鹽水解酶活性測(cè)定

重組蛋白表達(dá)方法見1.2.4，膽鹽水解酶BSH活性測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[34]做少許修改。培養(yǎng)后的重組菌株，經(jīng)離心，用1 mL 0.1 mol/L的PBS(pH 6.0)洗滌2次，沉淀重懸于500 μL PBS中。吸取100 μL菌懸液至1.5 mL的離心管中，反應(yīng)體系200 μL，底物?；悄懰徕c(TCA)終濃度20 mmol/L。水解反應(yīng)于37 ℃水浴1 h，加入200 μL 15%三氯乙酸終止反應(yīng)，立即12 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液與900 μL茚三酮溶液混合，沸水浴14 min，冰浴5 min后測(cè)OD570數(shù)值計(jì)算酶活。根據(jù)牛磺酸-茚三酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，得樣本中游離氨基酸濃度，計(jì)算BSH酶活。一個(gè)酶活單位(U)定義為每分鐘每毫升菌液與底物反應(yīng)后釋放出的游離氨基酸的量μmol。

2 結(jié)果與分析

2.1 eGFP和mCherry熒光蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及酶切鑒定

分別以質(zhì)粒pmCherry-C1和pTracer-CMV3的質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增egfp和mCherry兩種熒光蛋白編碼基因，目的片段均為約750 bp(圖1A)，TA克隆后測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增到的egfp和mCherry基因與質(zhì)粒公布的序列完全一致。依方法1.2.1構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，獲得預(yù)期大小片段，進(jìn)一步測(cè)序顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pSIPH471 (含egfp基因) 和pSIPH472(含mCherry基因) 構(gòu)建正確 (圖1B)。

2.2 eGFP和mCherry熒光蛋白的重組表達(dá)及熒光活性檢測(cè)

依方法1.2.4，在重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)至3 h，取破碎后上清液做Western blotting檢測(cè)，如圖2，結(jié)果顯示重組蛋白表達(dá)出與預(yù)期eGFP (28.7 kDa)和mCherry (28.3 kDa) 蛋白分子大小一致的條帶，條帶大小約為28 kDa?？蛰d對(duì)照菌株則沒有表達(dá)條帶。

圖1 eGFP和mCherry熒光蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmids containing fluorescent protein eGFP or mCherry.(A)Results of PCR amplification.M: DL2000 marker; 1:egfp gene; 2: mCherry gene.(B) Results of enzyme digestion.M: DL2000 marker; 1: egfp gene; 2: mCherry gene.

圖2 重組菌株表達(dá)蛋白的Western blotting鑒定Fig.2 Western blotting analysis of proteins expressed in recombinant strains.M: 14–191 kDa protein marker; 1:YE460 control; 2: GFP protein; 3: mCherry protein; 4:mCherry-BSH fusion protein.

將誘導(dǎo)表達(dá)3 h的重組乳酸菌YeG471和YmC472的菌懸液置于倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，在對(duì)應(yīng)的熒光激發(fā)光條件下，重組eGFP菌株YeG471檢測(cè)到綠色熒光，但是由于視野內(nèi)背景綠色熒光也很強(qiáng)，因此菌株的熒光標(biāo)記不明顯 (圖3A)。不同的是，重組mCherry菌株YmC472檢測(cè)到紅色熒光，但是由于視野內(nèi)背景沒有熒光，因此菌株的熒光標(biāo)記清晰而顯著 (圖3B)。該結(jié)果說明相比eGFP熒光標(biāo)記而言，mCherry紅色熒光蛋白更適用于標(biāo)記植物乳桿菌WCFS1，因此，本研究隨后確定了mCherry蛋白作為植物乳桿菌WCFS1的熒光標(biāo)記進(jìn)行深入研究。

2.3 誘導(dǎo)型mCherry-BSH融合表達(dá)載體的構(gòu)建、重組表達(dá)及活性鑒定

依方法1.2.2，將質(zhì)粒pSIPH462上來源于羅伊氏乳桿菌的膽鹽水解酶基因bsh克隆至pSIPH472質(zhì)粒mCherry基因的C端，構(gòu)建獲得mCherry-BSH融合表達(dá)載體，命名為pSIPH473。將質(zhì)粒pSIPH473電轉(zhuǎn)化植物乳桿菌NB5462后獲得的重組菌株命名為YbBmC473，構(gòu)建策略見圖4。重組的融合蛋白mCherry-BSH編碼基因是在啟動(dòng)子PsppA調(diào)節(jié)下表達(dá)的，由于該啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，因此，融合蛋白mCherry-BSH的重組表達(dá)方式是誘導(dǎo)型的，需要向培養(yǎng)基中添加SppIP作為誘導(dǎo)劑從而開啟基因的表達(dá)。

圖3 重組菌株的熒光觀測(cè)結(jié)果Fig.3 Fluorescence detection results of recombinant strains.(A) Green fluorescence in the recombinant strain YeG471.(B) Red fluorescence in the recombinant cells YmC472.

圖4 誘導(dǎo)型mCherry-BSH融合表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖Fig.4 Construction diagram of inducible mCherry-BSH fusion expression vectors.

依方法1.2.4，在重組菌株經(jīng)25 ng/mL SppIP誘導(dǎo)表達(dá)3 h后，取破碎后上清液進(jìn)行Western blotting檢測(cè) (圖2)，結(jié)果顯示重組蛋白表達(dá)出與預(yù)期mCherry-BSH融合蛋白 (65.3 kDa) 分子大小一致的條帶，條帶大小約為64 kDa。該結(jié)果說明了重組菌YbBmC473表達(dá)了mCherry-BSH融合蛋白。

將重組菌株YbBmC473活化轉(zhuǎn)接至相應(yīng)抗性培養(yǎng)基中，在OD600至0.3時(shí)加入誘導(dǎo)劑SppIP誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。樣品經(jīng)測(cè)定后，建立了樣品菌濃度、紅色熒光強(qiáng)度以及膽鹽水解酶BSH酶活性隨時(shí)間變化曲線 (圖5)。首先，從重組菌生長(zhǎng)情況來看 (圖5A)，2個(gè)含mCherry基因的表達(dá)菌株YbBmC473和YbmC472與對(duì)照菌株之間無明顯差別，表明mCherry熒光蛋白的表達(dá)對(duì)乳酸菌WCFS1無毒或低毒性，不影響菌株生長(zhǎng)。其次，從重組菌熒光產(chǎn)生結(jié)果 (圖5B) 來看，重組菌YbmC472和YbBmC473均檢測(cè)到熒光，2個(gè)菌株產(chǎn)生熒光的趨勢(shì)相一致，即經(jīng)SppIP誘導(dǎo)后熒光強(qiáng)度均是在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期中期 (10 h) 達(dá)到最高 (37907 RFU和33707 RFU)，隨后逐漸下降，其中，融合了BSH蛋白的重組菌YbBmC473熒光強(qiáng)度略低。該結(jié)果說明單獨(dú)表達(dá)的mCherry熒光蛋白可成功標(biāo)記植物乳酸菌WCFS1，而融合目的蛋白后仍舊表達(dá)較高熒光強(qiáng)度。最后，從重組菌膽鹽水解酶BSH活性表達(dá)情況來看 (圖5C)，融合了mCherry基因重組菌株YbBmC473檢測(cè)到了BSH酶活性，酶活的產(chǎn)生趨勢(shì)與該菌株熒光產(chǎn)生趨勢(shì)相一致，在菌株發(fā)酵對(duì)數(shù)期中期 (10 h)BSH活性最高，為0.603 U/mL，略低于bsh基因單獨(dú)表達(dá)菌株YbB462。該結(jié)果說明mCherry-BSH蛋白融合表達(dá)成功，融合后的蛋白同時(shí)具有較高的熒光強(qiáng)度和BSH酶活性。

綜上所述，本研究實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)型mCherry-BSH重組蛋白在植物乳桿菌WCFS1中的融合表達(dá)，該結(jié)果不僅成功建立了利用mCherry熒光蛋白標(biāo)記植物乳桿菌WCFS1的有效方法，同時(shí)，對(duì)目標(biāo)蛋白熒光標(biāo)記的成功，也為在以植物乳桿菌WCFS1為例的乳酸菌宿主中異源表達(dá)重組蛋白的研究提供了有利條件。

圖5 mCherry-BSH融合表達(dá)菌株活性鑒定結(jié)果Fig.5 The activity results of mCherry-BSH fusion expression recombinants.(A) The growth curve of recombinants.The strain NB5462 harboring pSIPH460,pSIPH462, pSIPH472 or pSIPH473 was cultured at 37 ℃for 34 h and induced with 25 ng/mL of SppIP inducing peptides at ~0.3 OD600, respectively.(B) The fluorescent intensity curve of recombinant strains.(C) The BSH activity curve of recombinants.All data represent the average of three biological replicates.

2.4 組成型mCherry-BSH融合表達(dá)載體的構(gòu)建、重組表達(dá)及活性鑒定

在構(gòu)建獲得的質(zhì)粒pSIPH473基礎(chǔ)上，本研究另外構(gòu)建了3種不同啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下的mCherry-BSH融合蛋白表達(dá)載體，質(zhì)粒的構(gòu)建策略見圖6。本研究選擇的另外3種啟動(dòng)子均來源于乳酸菌，且都是被報(bào)道在乳酸菌中成功表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子。與PsppA不同的是，來源于植物乳桿菌的PldhL、乳酸乳球菌的P32和短乳乳桿菌的PslpA均是組成型啟動(dòng)子，在此類啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下，重組蛋白的表達(dá)過程中無需添加誘導(dǎo)劑。

以重組菌YbBmC473為對(duì)照，首先研究了3種組成型表達(dá)重組菌熒光表達(dá)情況，見圖7。與誘導(dǎo)型重組菌YbBmC473熒光產(chǎn)生的趨勢(shì)不同，組成型重組菌的熒光強(qiáng)度在菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定期 (16 h)達(dá)到最高，且維持較長(zhǎng)時(shí)間。在3種不同的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下，重組的mCherry-BSH融合蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度也不同。其中，啟動(dòng)子PldhL調(diào)節(jié)下重組菌YbBmC673熒光強(qiáng)度最高，培養(yǎng)16 h后熒光值為23 897 RFU，啟動(dòng)子 P32調(diào)節(jié)下重組菌YbBmC771熒光強(qiáng)度較低，為13 379 RFU，而啟動(dòng)子PslpA調(diào)節(jié)下重組菌YbBmC871沒有檢測(cè)到熒光。值得注意的是，熒光強(qiáng)度最高的組成型表達(dá)重組菌YbBmC673其熒光強(qiáng)度明顯低于誘導(dǎo)型表達(dá)重組菌YbBmC473。

隨后，研究了最大熒光強(qiáng)度產(chǎn)生條件下的各個(gè)mCherry-BSH融合蛋白表達(dá)重組菌的BSH酶活性。結(jié)果顯示 (圖7)，各個(gè)菌株的膽鹽水解酶BSH活性高低與其融合的mCherry蛋白熒光強(qiáng)弱相對(duì)應(yīng)，即誘導(dǎo)型表達(dá)重組菌BSH活性最高，為0.637 U/mL (發(fā)酵10 h)，明顯高于組成型表達(dá)重組菌，且啟動(dòng)子PldhL調(diào)節(jié)下重組菌YbBmC673的BSH酶活性最高，為0.416 RFU (發(fā)酵16 h)，啟動(dòng)子P32調(diào)節(jié)下重組菌YbBmC771的BSH酶活性次之，而啟動(dòng)子PslpA調(diào)節(jié)下重組菌YbBmC871沒有檢測(cè)出BSH酶活性。

圖6 組成型表達(dá)載體構(gòu)建策略圖Fig.6 The construction strategy of constitutive expression vectors.The expression cassette was composed of three constitutive promoters (PldhL, P32 and PslpA) and the fusion protein mCherry-BSH encoding gene with the nucleotide and the corresponding amino acid sequence of the joint regions.The start codon and 4 or 8 amino acid residues from the original gene of these promoters were introduced into expressing vector.The amino acid residues marked in bold font were from the restriction enzyme recognition sites and first amino acid of the target gene.

圖7 組成型融合表達(dá)菌株活性測(cè)定結(jié)果Fig.7 The activity detection of constitutive fusion expression recombinants.(A) The growth curve of constitutive fusion expression strains.The expression of fusion protein mCherry-BSH regulated by different promoters (PldhL, P32 and PslpA) in the host strain NB5462 were independent of inducing peptide.The inducing expression strain YbBmC473 was used as a control.(B)The fluorescence intensity of recombinants containing constitutive expression vectors.(C) The BSH activity results of recombinants.The strain YbE460 was used as a negative control, containing no BSH protein.In contrast,the positive control was YbB462.The different letters represented significant differences between two strains(P<0.05); the same ones showed no significant differences.

以上結(jié)果表明，在啟動(dòng)子PldhL調(diào)節(jié)下，組成型mCherry-BSH重組蛋白在植物乳桿菌WCFS1中也成功實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)，該表達(dá)過程中無需添加誘導(dǎo)劑，簡(jiǎn)化了表達(dá)過程。

3 討論

本研究利用mCherry紅色熒光蛋白成功標(biāo)記了植物乳桿菌WCFS1，是繼2015年van Zyl等[26]報(bào)道之后mCherry熒光蛋白成功標(biāo)記乳酸菌的又一例證，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。目前，已有一些文獻(xiàn)報(bào)道了eGFP蛋白可標(biāo)記乳酸菌產(chǎn)生綠色熒光[35-37]，但是本研究結(jié)果表明，由于WCFS1菌體自身綠色熒光背景高，eGFP標(biāo)記植物乳桿菌并不合適。相反，mCherry熒光蛋白標(biāo)記植物乳桿菌則具有優(yōu)勢(shì)，由于WCFS1菌體自身無紅色熒光背景，隨著mCherry基因的誘導(dǎo)表達(dá)，重組菌檢測(cè)到明顯的紅色熒光。本研究建立的采用mCherry蛋白標(biāo)記植物乳酸菌的方法，可廣泛應(yīng)用于其他乳酸菌的熒光標(biāo)記工作中，為研究乳酸菌在生物體內(nèi)的分布、定植及存活情況從而揭示其益生功能的作用機(jī)理提供了有利條件。

目前，由于菌體自身安全、不分泌內(nèi)毒素、表達(dá)外源蛋白無需純化可直接同菌體一起進(jìn)入胃腸道以及自身具有益生功能等優(yōu)點(diǎn)，乳酸菌已然成為極具潛力的“新興”基因工程菌，具有廣闊的應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值。本研究選取的植物乳桿菌WCFS1菌株便是重要的基因工程模式菌株，已經(jīng)有細(xì)胞因子、功能蛋白以及疫苗藥物分子等在WCFS1中表達(dá)成功的報(bào)道[27-30,38-39]。本研究構(gòu)建了紅色熒光蛋白mCherry基因和乳酸桿菌降膽固醇功能關(guān)鍵酶膽鹽水解酶bsh基因的融合表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化植物乳桿菌WCFS1后，重組的融合蛋白mCherry-BSH同時(shí)檢測(cè)到紅色熒光和BSH酶活性，且兩蛋白活性表達(dá)互不影響?？梢灶A(yù)見，易于觀察、便于檢測(cè)的mCherry紅色熒光蛋白將為更多活性蛋白在乳酸菌宿主中的表達(dá)、細(xì)胞定位、功能鑒定的研究奠定基礎(chǔ)。

此外，本文還研究了3種不同組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下mCherry紅色熒光融合蛋白表達(dá)情況，相較于PslpA調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄在WCFS1中無蛋白活性，在啟動(dòng)子PldhL調(diào)節(jié)下，融合蛋白mCherry-BSH具有較高的活性，且表達(dá)過程無需添加誘導(dǎo)劑。雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示組成型融合蛋白mCherry-BSH的蛋白活性不及誘導(dǎo)型，但是，無需添加誘導(dǎo)劑簡(jiǎn)化了操作過程，特別在誘導(dǎo)劑添加困難的目的蛋白表達(dá)研究中 (如重組菌在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃腸道環(huán)境中表達(dá)蛋白) 具有優(yōu)勢(shì)。值得注意的是，本研究構(gòu)建獲得的mCherry紅色熒光融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)也可作為植物乳桿菌啟動(dòng)子探針，為啟動(dòng)子的篩選提供有效工具。