王程，耿澤男，紀朋艷，李慶華，羅軍，李妍，隋春紅

吉林醫(yī)藥學院 基礎醫(yī)學院，吉林 吉林 132013

基因工程制備的重組胰島素是糖尿病藥物治療領域的一個里程碑，應用于臨床已逾30載，具有純度高、不良反應少、用量少等優(yōu)點[1]。胰島素必須以單體分子形式與受體結合才能發(fā)揮生物活性，然而在重組胰島素的臨床應用過程中，較高的血藥濃度會促進胰島素分子發(fā)生自身締合而形成多聚體，需要經過一段時間解聚才發(fā)揮作用[2]。因此通過分子改造，設計出在血液中以單體形式存在的速效胰島素成為研究的重要方向之一[3]。目前用于臨床控制餐后血糖波動的速效胰島素主要有賴脯胰島素 (Lispro)、門冬胰島素 (Aspart)和賴谷胰島素 (Glulisine)，其結構改造均發(fā)生在胰島素B鏈羧基末端，通過在聚體形成面引入相同電荷、調整分子間疏水性、改變與金屬離子的結合力等方式使胰島素單體難以聚合[4]。2016年，美國和澳大利亞的研究人員從海洋圓錐芋螺Conus geographus的毒液中提取出一種單體形式存在的圓錐芋螺胰島素G1 (Cone snail insulin G1，cI G1) ，并發(fā)現(xiàn)其可與人胰島素受體結合，且發(fā)揮作用的速度比人胰島素 (Humaninsulin，hI) 更快，有望開發(fā)成一種超級速效胰島素[5]。本研究參照人胰島素原 (Humanproinsulin，hPI) 和圓錐芋螺胰島素G1原 (Cone snail proinsulin G1，cPI G1) 的基因，設計適于大腸桿菌 (Escherichia coli，E.coli) 表達的重組cPI G1的核苷酸序列，構建pET22b(+)-cPI G1原核表達質粒，以E.coliBL21(DE3)作為宿主進行表達，經酶切純化獲得重組cI G1；隨后以重組hI甘舒霖50R為對照，對等劑量重組cI G1作用的正常小鼠和鏈脲佐菌素 (Streptozotocin，STZ) 致糖尿病模型小鼠進行空腹血糖檢測 (Fasting blood glucose test，F(xiàn)BGT)和葡萄糖耐量測試 (Oral glucose tolerance test，OGTT) ，評估重組cI G1的降糖作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和動物

質粒pGH-cPI G1由上海捷瑞生物科技公司合成，pET22b(+) 質粒購于美國Novagen公司。E.coliBL21(DE3) 菌株購于北京天根生物科技公司。近交系C57BL雄性小鼠，體質量16–20 g，SPF級，購于長春億斯實驗動物技術公司，實驗動物生產使用許可證：SCXK (吉)-2011-0004。

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性核酸內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、核酸染料、T4 DNA連接酶購于大連寶生物公司；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購于美國OMEGA公司；β-巰基乙醇、胰蛋白酶凍干粉 (EC3.4.21.4)、鏈脲佐菌素購于美國Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、三羥甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Tricine-SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、鎳-次氮基三乙酸 (Ni-NTA)瓊脂糖凝膠6FF、Sephadex G-25凝膠、透析袋(3 500 Da) 購于北京索萊寶科技有限公司；重組人胰島素標準品 (批號140633-201104，28.3 IU/mg)購自中國藥品生物制品檢定所；甘舒霖50R混合重組人胰島素注射液 (3 mL：300 IU，國藥準字S20083008) 購于通化東寶藥業(yè)股份有限公司；0.9%氯化鈉 (NaCl) 注射液 (100 mL：0.9 g，國藥準字H22025619) 購于吉林康乃爾藥業(yè)有限公司；其他試劑均為國產或進口分析純試劑。590型血糖儀為江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司產品；LC-20AT高效液相色譜 (HPLC) 儀為日本島津公司產品。

1.2 方法

1.2.1 質粒的設計和構建

比對hI和cI G1氨基酸序列，替換cI G1序列中非編碼和可能成為胰蛋白酶水解位點的氨基酸，參照hPI和cPI基因與E.coli優(yōu)勢密碼子進行設計重組cPI G1核苷酸序列并合成pGH-cPI G1質粒。利用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pGH-cPI G1質粒和pET22b(+) 質粒。純化回收雙酶切的cPI G1目的片段和 pET-22b(+) 載體片段，連接酶連接后轉化到E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞中，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，挑選陽性菌落進行液體培養(yǎng)，單、雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組菌，并送上海捷瑞生物科技有限公司進一步測序鑒定。

1.2.2 蛋白表達和親和層析

將測序鑒定和理論序列相符的陽性重組菌按1% (V/V) 接種量在LB液態(tài)培養(yǎng)基中37 ℃搖菌培養(yǎng)，當光密度值 (OD600) 達到0.4–0.6時加入IPTG (終濃度為1 mmol/L) 誘導4 h，離心收集菌體，超純水清洗3次，重懸于5倍菌體積的裂解緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)，冰水浴超聲破碎，高速離心收集上清液。按Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF使用說明進行親和層析 (柱尺寸：Φ1.28 cm×7 cm；床體積：5 mL；流速：0.5 mL/min；檢測波長：280 nm)，純化蛋白凍干保存。采用 16.5%Tricine-SDS-PAGE鑒定目的蛋白[6]。蛋白產率(mg/g)=純化獲得的重組cPI G1質量 (mg)/所用濕菌質量 (g)。

1.2.3 蛋白酶解和分子篩層析

用蛋白質折疊緩沖液 (50 mmol/L 甘氨酸，1 mmol/L EDTA, pH 10.5，高純度氮氣除氣) 溶解重組cPI G1，按1.5倍二硫鍵摩爾濃度加入β-巰基乙醇誘導二硫鍵形成[7]，4 ℃密封孵育12 h，1 mol/L Tris-HCl調定pH 8.5，與胰蛋白酶按20∶1(W/W) 均勻混合，37 ℃酶切18 h。酶切產物進行Sephadex G-25分子篩層析 (柱尺寸：Φ1.0 cm×90 cm；床體積：65 mL；流速：1 mL/min；檢測波長：280 nm)，純化蛋白凍干保存。采用16.5%Tricine-SDS-PAGE鑒定目的蛋白。蛋白回收率(%) =酶解后獲得重組cI G1物質的量 (mol)/酶解前重組cPI G1物質的量 (mol) ×100%。

1.2.4 生物效價測定

參考《中國藥典》(2015版) HPLC測定胰島素生物活性的方法[8]，采用C18色譜柱，以0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液 (硫酸鈉28.4 g/L，磷酸2.7% (V/V)，乙醇胺調pH值至2.3，定容至1000 mL)-乙腈(74∶26) 為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，波長214 nm。以0.01 mol/L鹽酸溶液配制1 mg/mL的重組人胰島素對照品、甘舒霖50R和重組cI G1，精密量取各個樣品20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算效價。

1.2.5 動物模型建立

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，12 h禁食不禁水，按200 mg/kg腹腔注射現(xiàn)配造模劑 (40 mg/mL STZ，0.1 mol/L檸檬酸鈉，pH 4.4)，60 h后給小鼠進食，72 h后稱量小鼠體重并尾端采血檢測空腹血糖值，以體重明顯減輕且血糖值≥16.7 mmol/L確定為小鼠糖尿病模型[9]。

1.2.6 動物分組、給藥和指標測定

正常小鼠和糖尿病小鼠各隨機分為3組，每組16只，為正常對照組 (NC組)、正常重組cI G1組 (NG組)、正常重組hI組(NH組)、模型對照組(MC組)、模型重組cI G1組 (MG組)、模型重組hI組 (MH組)。NC組和MC組注射0.9% NaCl，劑量為5 mL/kg；NG組和MG組注射20 μg/mL重組cI G1，劑量為100 μg/kg (按1 IU = 0.0347 mg hI計算[10])；NH組和MH組注射0.5 IU/mL甘舒霖50R，劑量為2.5 IU/kg[11]。給藥方式均為背部皮下注射，劑量按小鼠體重計算。在禁食8 h后，各組隨機選取8只小鼠空腹給藥進行FBGT，另外8只小鼠以200 mg/mL葡萄糖灌胃，劑量為1 mg/kg，然后迅速給藥進行OGTT[12]。

1.2.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，各項指標檢測數(shù)據(jù)以平均值±標準差 (±s) 表示。

2 結果與分析

2.1 重組cPI G1氨基酸序列的設計和質粒pET22b(+)-cPI G1的構建

對比cI G1 (PDB：A chain 5JYQ_A，B chain 5JYQ_B) 和hI (GenBank：A chain AAA72170.1，B chain AAA72171.1) 的氨基酸序列，并進行必要的氨基酸替換 (圖1A)：①A4、B12位點的γ-羧基谷氨酸 (γ-carboxyglutamic acid，Gla，γ) 替換為谷氨酸 (Glutamic acid，Glu，E)；②B5位點的羥脯氨酸 (Hydroxyproline，Hyp，X) 替換為脯氨酸 (Proline，Pro，P)；③A9、B8位點的精氨酸(Arginine，Arg，R) 替換為亮氨酸 (Leucine，Leu，L)；④A18、A19、B6位點的賴氨酸 (Lysine，Lys，K) 分別替換為E、天冬酰胺 (Asparagine，Asn，N) 和谷氨酰胺 (Glutamine，Gln，Q)，使重組cI G1中均為編碼氨基酸且不影響胰蛋白酶水解。參照hPI(GenBank：AY899304.1)和cPI(UniProtKB/Swiss-Prot：A0A0B5AC95.1) 基因，按照大腸桿菌偏愛密碼子表，設計重組cPI G1核苷酸序列(圖1B)，GC含量為46.9%，其結構中包括：①兩端限制性核酸內切酶位點EcoRⅠ和Hind Ⅲ；②具有促進可溶性表達并可延長目的蛋白10倍半衰期的前導肽pelBleader；③重組cI G1 A鏈和B鏈及其之間的連接肽C-peptide；④可與二價鎳離子螯合用于親和層析的標簽肽6×His Tag；⑤4個可被胰蛋白酶識別的酶切位點。用EcoRⅠ和Hind Ⅲ單、雙酶切鑒定構建的pET22b(+)-cPI G1質粒 (圖2)，其中雙酶切后可見一條250 bp左右的條帶，和理論值大小一致，進一步測序鑒定其核苷酸序列和理論值一致，表明已成功構建表達cPI G 1的原核表達載體，可用于后續(xù)實驗。

圖1 pET22b(+)-cPI G1質粒的設計Fig.1 Design of the plasmid pET22b(+)-cPI G1.(A) Sequence comparison of hI, cPI G1 and recombinant cPI G1.γ:Gla; X: Hyp; *: C-terminal amidation; —s—s—: disulfide links.(B) Characterization of recombinant cPI G1 sequence.▼: the cleavage site of trypsin.

2.2 重組cPI G1蛋白的表達和純化

重組菌通過IPTG誘導表達 (圖3)，與未誘導的重組菌對比，IPTG誘導的重組菌在14 kDa左右有明顯的特異性條帶，與理論分子量一致(pelBleader約3.4 kDa，重組cPI G1約8.7 kDa，6×His Tag約1.5 kDa，共13.6 kDa)，表明融合蛋白已經得到可溶性表達。經Ni-NTA親和層析獲得純化重組cPI G1蛋白，蛋白產率為 (3.9±0.7) mg/g。

圖2 質粒pET22b(+)-cPI G1的酶切鑒定Fig.2 Identification of the plasmid pET22b(+)-cPI G1 by double restriction enzyme.M: DNA marker; 1:pET22b(+)-cPI G1 plasmid; 2: pET22b(+)-cPI G1 plasmid digested with EcoRⅠ; 3: pET22b(+)-cPI G1 plasmid digested with Hind Ⅲ; 4: pET22b(+)-cPI G1 plasmid digested with EcoRⅠand Hind Ⅲ.

圖3 重組cPI G1的表達及純化Fig.3 Expression and purification of recombinant cPI G1.M: ultra-low molecular weight protein marker; 1:supernatant from bacterial before induced by IPTG; 2:supernatant from bacteria induced by IPTG; 3: purified recombinant cPI G1.

2.3 重組cPI G1的酶解和重組cI G1的純化

純化的重組cPI G1蛋白經胰蛋白酶水解后用Sephadex G-25分子篩層析純化 (圖4)，重組cI G1在5 kDa左右有明顯的特異性條帶，與理論分子量一致 (重組cI G1約5.2 kDa)，表明重組cI G1水解成功并已經正確折疊，蛋白回收率為51.9%±4.5%。

圖4 重組cPI G1的胰蛋白酶水解及重組cI G1的純化Fig.4 Hydrolysis of recombinant cPI G1 by trypsin and purification of recombinant cI G1.M: ultra-low molecular weight protein marker; 1: purified recombinant cPI G1; 2: purified recombinant cI G1.

2.4 重組cI G1的效價

HPLC測定相同蛋白濃度的重組人胰島素標準品、甘舒霖50R和重組cI G1，結果顯示3種樣品的出峰時間基本一致 (圖5)，根據(jù)峰面積計算得出重組人胰島素標準品的效價為28.3 IU/mg，甘舒霖50R的效價為28.5 IU/mg，重組cI G1的效價為25.9 IU/mg。

圖5 重組人胰島素標準品、甘舒霖50R和重組cI G1的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatogram of recombinant human insulin standard, Gansulin 50R and recombinant cI G1.

2.5 重組cI G1對正常和糖尿病小鼠血糖的影響

腹腔注射STZ的小鼠72 h后體重平均減輕4.5 g，血糖值均高于16.7 mmol/L，表明小鼠糖尿病模型建模成功。FBGT結果顯示，NC組和MC組小鼠血糖值在180 min內一直保持恒定，分別為 (5.76±0.32) mmol/L和 (21.1±0.51) mmol/L；NG組和MG組小鼠在注射重組cI G1后，血糖值均在20 min時達到最低，分別為 (1.73±0.46) mmol/L和 (6.94±0.52) mmol/L，然后隨時間逐步回升，在150 min后恢復到初始水平；NH組和MH組小鼠在注射甘舒霖50R后30 min血糖值達到最低，分別為 (2.03±0.47) mmol/L和 (8.07±0.49) mmol/L，隨后血糖值一直控制在較低水平 (圖6A)。OGTT結果顯示，各組小鼠在糖負荷后20 min時達到血糖高峰 (圖6B)；糖負荷后NG組和MG組小鼠血糖值均在10 min至60 min時間段明顯降低，在20 min時降低幅度最大，分別達 (4.18±0.16) mmol/L和 (2.94±0.13) mmol/L；NH組和MH組小鼠均在20 min至180 min時間段降低，在30 min時降低幅度最大，分別達 (6.57±0.21) mmol/L和(3.48±0.15) mmol/L (圖6B)。

圖6 重組cI G1和重組hI對正常和糖尿病小鼠血糖的影響Fig.6 Effect of recombinant cI G1 and recombinant hI on blood glucose in normal and diabetic mice.(A) FBGT.(B)OGTT.

3 討論

Ⅰ型糖尿病和Ⅱ糖尿病胰島素缺乏的患者均需要胰島素治療，速效類胰島素是糖尿病治療藥物研究開發(fā)的重要方向之一[13]。本研究以單體形式存在的圓錐芋螺胰島素cI G1基因設計合成了適合原核表達的重組cPI G1核苷酸序列，與pET22b(+) 質粒連接后實現(xiàn)了重組cPI G1基因在大腸桿菌BL21(DE3) 中的成功表達，并通過親和層析成功得到了重組cPI G1蛋白。降糖活性研究發(fā)現(xiàn)，重組cI G1具有與甘舒霖50R相似的降血糖功效，且發(fā)揮作用更速效，這可能由于重組cI G1不僅與受體的結合效率高[5]，而且短時間內單體形式存在的重組cI G1會比含有多聚體成分的甘舒霖50R具有更大的血藥濃度。但重組cI G1作用持久性較差，其原因可能是重組cI G1與受體結合后迅速被胞吞[14]，血漿中胰島素降解酶也僅切割單體胰島素[15]，這使體內重組cI G1水平迅速降低而不能持久發(fā)揮作用，而甘舒霖50R中多聚體胰島素的解聚過程可延長作用時間。制備的重組cI G1的效價較甘舒霖50R略低，從降糖活性的總體效果來看重組cI G1也不如甘舒霖50R，其可能有如下方面原因：1) 為符合重組cI G1表達的要求，在設計過程中替換了部分非編碼和影響酶切的氨基酸，分子結構和長度的改變可能影響其生物學活性。2) 原核表達方法簡單、表達量高，但表達環(huán)境不利于蛋白二硫鍵的形成，且缺乏翻譯后加工修飾體系[16]，盡管采用低濃度的β-巰基乙醇促進重組cI G1空間構象的形成，仍達不到真核表達系統(tǒng)的效果。此外，與正常小鼠相比，重組cI G1和甘舒霖50R均對糖尿病模型小鼠血糖的調節(jié)更有力，這可能是由于正常小鼠對自身血糖的調節(jié)能力比糖尿病模型小鼠更強的原因。綜上所述，采用生物工程方法可制備具有明確降血糖活性的重組cI G1。然而重組cI G1在制備和儲存時的穩(wěn)定性、應用時的免疫原性以及產生胰島素抵抗效應等方面問題，還需要更加深入的研究。