左偉東，康寧，李春林，欒悅，童曉玲，代方銀，魯成

1 西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715

2 西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715

超長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶 (Elongases of very long chain fatty acid，ELOVL) 是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的微粒體酶，在催化合成長(zhǎng)鏈脂肪酸 (C16，C18) 和超長(zhǎng)鏈脂肪酸 (≥C20) 的過(guò)程中起到限速作用[1]。酵母中首次鑒定出的該酶的編碼基因ELO1參與延伸C14脂肪酸到C16，而ELO2和ELO3則分別對(duì)延伸C24和C26脂肪酸必不可少[2-3]。目前，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)有 7個(gè)家族成員被鑒定(ELOVL1–ELOVL7)。其中，ELOVL1負(fù)責(zé)延伸C20到C28的脂肪酸，并與C24鞘脂類(lèi)的合成相關(guān)[4-5]。ELOVL2控制精巢中C28:5n-6和C30:5n-6的脂肪酸合成，進(jìn)而影響小鼠的精子成熟和雄性生殖力[6]。ELOVL3參與C20–C24脂肪酸的合成，并與毛囊皮脂腺的發(fā)育以及飲食性肥胖抵抗(Diet induced obesity resistant，DIO-R) 相關(guān)[7-8]。ELOVL4參與合成C28和C30飽和脂肪酸以及C28–C38多不飽和脂肪酸，且與黃斑營(yíng)養(yǎng)不良、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)和可變性紅斑角皮癥相關(guān)[9-10]。ELOVL5能夠延伸C18和C20的多不飽和脂肪酸底物，而且和脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)以及開(kāi)角型青光眼相關(guān)[11-13]。ELOVL6延伸稍短的C12–C16脂肪酸，其基因多態(tài)性和Ⅱ型糖尿病相關(guān)聯(lián)[14-15]。ELOVL7延伸C16–C22脂肪酸，并參與前列腺癌細(xì)胞增殖和巨細(xì)胞病毒復(fù)制[16-18]。

與哺乳動(dòng)物不同，昆蟲(chóng)ELOVL基因數(shù)量較多但功能驗(yàn)證的結(jié)果較少。果蠅中第一個(gè)被鑒定的ELOVL基因elo68α在雄性生殖系統(tǒng)中特異性表達(dá)，其產(chǎn)物能夠延伸C14和C16單不飽和脂肪酸，參與雄性信息素的合成[19]。在雌性果蠅中專(zhuān)一表達(dá)的eloF基因，其產(chǎn)物能夠延伸C19-C30脂肪酸，與雌性果蠅信息素合成和求偶行為相關(guān)[20]。另外，與ELOVL6基因相似度較高的noa基因，其RNA水平的減少導(dǎo)致果蠅運(yùn)動(dòng)障礙和生存能力顯著下降，而針對(duì)精巢包囊細(xì)胞的RNAi會(huì)引起雄性不育[21]。過(guò)表達(dá)果蠅脂肪酸延長(zhǎng)酶基因Bond能使釀酒酵母elo2/elo3雙缺失致死突變菌株恢復(fù)活力，突變Bond基因影響精母細(xì)胞胞質(zhì)分裂；而且Bond基因沉默能顯著抑制雄性生育力[22-23]。此外，白紋伊蚊中脂酰輔酶A延長(zhǎng)酶 (ELO) 的表達(dá)水平是其滯育卵抗干燥能力的重要影響因素[24]。與表皮碳?xì)浠衔锷锖铣上嚓P(guān)的ELOVL基因，在歐洲蜜蜂中也采用RT-qPCR進(jìn)行了表達(dá)譜分析[25]。桔小實(shí)蠅被單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌侵染后，noa基因的表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)節(jié)Toll/Imd免疫信號(hào)傳導(dǎo)途徑[26]。在黃粉蟲(chóng)中，TmELO1主要參與C16和C20脂肪酸的合成，且能形成痕量的C22和C24脂肪酸，而TmELO2僅合成C16脂肪酸，這兩個(gè)基因的RNAi都沒(méi)有改變黃粉蟲(chóng)的脂肪酸組分，但TmELO1基因的RNAi會(huì)導(dǎo)致黃粉蟲(chóng)死亡率上升[27]。

ELOVL基因在昆蟲(chóng)中已有影響育性、抗干燥性、免疫信號(hào)傳導(dǎo)和致死等方面的功能研究，而家蠶作為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)和鱗翅目昆蟲(chóng)的典型代表，其ELOVL基因僅有信息分析方面的報(bào)道[28]。為了進(jìn)一步探索ELOVL基因在家蠶中的具體功能，本研究從家蠶幼蟲(chóng)中克隆獲得Bmelo424的基因序列，分析其組織表達(dá)特征及蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并借助釀酒酵母真核表達(dá)系統(tǒng)和GC-MS探究其基因功能，同時(shí)對(duì)重組酵母細(xì)胞的溫度脅迫響應(yīng)也作了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)

家蠶品種Dazao取自西南大學(xué)家蠶基因資源庫(kù)，幼蟲(chóng)在25 ℃室溫的自然光照條件下以新鮮桑葉飼育。在五齡三天幼蟲(chóng)期取整蠶和各組織凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 試劑耗材

DNA膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1購(gòu)自北京全式金公司；釀酒酵母INVSc1和表達(dá)載體pYES2購(gòu)自Invitrogen公司；TaqDNA 聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T載體、DNA Marker、限制性?xún)?nèi)切酶NotⅠ、BamHⅠ和T4 DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司；酵母抽提物、蛋白胨和葡萄糖等購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；酵母尿嘧啶缺陷型合成培養(yǎng)基 (SC-Ura)購(gòu)自上海哈靈公司，酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購(gòu)自北京天恩澤公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自BioTeke公司；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

將五齡三天家蠶各組織 (頭、體壁、中腸、脂肪體、前中絲、后絲、馬氏管、精巢、卵巢和血液) 及整蠶的凍存樣品取出，分別放入液氮預(yù)冷后的研缽中，快速研磨至細(xì)滑粉末狀，用無(wú)RNase槍頭取適量粉末于Trizol中裂解。通過(guò)RNA提取試劑盒獲得家蠶各組織及整蠶的總RNA，并使用分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣品的RNA濃度，之后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA模板。

1.2.2 Bmelo424基因的克隆

依據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SilkDB中的超長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶信息[28]，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Bmelo424基因 (BGIBMGA000424) 的克隆引物 (表1)。以五齡三天Dazao整蠶cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物大小。目的DNA片段經(jīng)切膠回收后，與pMD19-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 Bmelo424基因的組織表達(dá)特征

基于文獻(xiàn)報(bào)道合成Bmelo424基因的熒光定量PCR引物Q-Bmelo424和內(nèi)參引物sw22934[28]，以家蠶五齡三天不同組織的cDNA為模板，檢測(cè)其組織表達(dá)特征。反應(yīng)總體系為10 μL (SYBR Green Ⅱ 4.2 μL ，上下游引物各0.3 μL，去離子水4.2 μL，cDNA模板1 μL)。反應(yīng)程序：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，收集目的基因和內(nèi)參基因的Cq值計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

表1 文中所用引物序列Table 1 Primers used in this paper

1.2.4 Bmelo424蛋白序列和結(jié)構(gòu)分析

利用在線工具對(duì)Bmelo424的跨膜結(jié)構(gòu)域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 和磷酸化位點(diǎn) (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用Cell-PLoc 2.0[29](http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/) 進(jìn)行其亞細(xì)胞定位，通過(guò)PSIPRED v3.3 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 進(jìn)行其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.5 Bmelo424表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)Bmelo424基因的克隆序列設(shè)計(jì)分別帶有BamHⅠ和NotⅠ的上下游引物 (表1)，采用TA克隆的方式首先構(gòu)建pMD-Bmelo424重組質(zhì)粒。將pMD-Bmelo424質(zhì)粒和穿梭載體pYES2同時(shí)用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，分別切膠回收Bmelo424和pYES2目的DNA片段?；厥债a(chǎn)物用T4 DNA連接酶過(guò)夜連接，連接反應(yīng)體系為：Bmelo424片段7 μL，pYES2片段1 μL，10×T4緩沖液1 μL，T4 DNA連接酶1 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，采用菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行酶切和測(cè)序雙重驗(yàn)證。

1.2.6 pYES2-Bmelo424的誘導(dǎo)表達(dá)

依據(jù)酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒操作說(shuō)明，將pYES2-Bmelo424和pYES2分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1感受態(tài)細(xì)胞，把菌液涂布在含2%葡萄糖的SC-Ura固體選擇培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取單菌落做菌液PCR進(jìn)一步驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

分別挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化單菌落接種于10 mL含2%葡萄糖的SC-Ura液體選擇培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)并測(cè)定OD600吸光度。計(jì)算并取出相應(yīng)體積菌液 (參照酵母表達(dá)載體pYES2使用手冊(cè))，3 000 r/min離心5 min，然后將菌體重懸于50 mL含2%半乳糖和1%棉籽糖的SC-Ura液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使得初始菌液OD600為0.4，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 h后，3 000 r/min離心5 min收集菌體，無(wú)菌水洗滌菌體3次，真空冷凍干燥48 h，置于-80 ℃冰箱備用，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 重組產(chǎn)物的GC-MS分析

脂肪酸提取及甲酯化依據(jù)文獻(xiàn)略有調(diào)整[30]：稱(chēng)取50 mg釀酒酵母凍干粉于10 mL離心管，加入3 mL氫氧化鈉甲醇溶液 (1 mol/L)，振蕩混勻，80 ℃水浴20 min，水浴期間多次振蕩混勻。甲酯化：往樣品中加入3 mL鹽酸甲醇溶液 (2 mol/L)混勻，然后80 ℃水浴20 min，快速冷卻。萃取凈化：待上述溶液冷卻，加入1 mL正己烷 (含0.01%BHT)，充分振蕩萃取。離心，取1 μL正己烷層上機(jī)測(cè)定，使用儀器為安捷倫氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 (Agilent7890-5975)。

色譜條件：所用色譜柱為安捷倫HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。進(jìn)樣口溫度為280 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為20∶1，載氣為氦氣，恒線速度流速為1.5 mL/min；升溫程序：初始柱溫為120 ℃，保持1 min；以6 ℃/min的速率升到170 ℃；再以2 ℃/min的速率升到230 ℃，保持12 min；最后以10 ℃/min的速率升到285 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為200 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為260 ℃，電子轟擊能量為70 ev，采用全掃描模式，掃描范圍m/z40–550，掃描速率為2.83次/s，溶劑切除時(shí)間為4.4 min。

通過(guò)檢索NIST11譜圖庫(kù)并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜和各組分的保留時(shí)間來(lái)定性脂肪酸，再按照峰面積歸一法計(jì)算其百分含量。

1.2.8 釀酒酵母溫度脅迫處理

將1.2.6中用誘導(dǎo)培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)30 h后的菌液分別取出5 mL，調(diào)整pYES2-Bmelo424和pYES2菌液密度至OD600值相同，分別在4 ℃和40 ℃脅迫處理24 h，然后對(duì)處理后的菌液分別作10倍梯度稀釋?zhuān)詈蟾魅? μL接種在含2%葡萄糖的SC-Ura固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察釀酒酵母受溫度脅迫后的生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bmelo424基因的克隆與分析

以家蠶品種Dazao五齡三天幼蟲(chóng)整蠶的cDNA為模板，用Bmelo424基因的克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的大小采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示有600 bp左右的特異性條帶，和預(yù)期片段大小相同 (圖1A)。對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，連接轉(zhuǎn)化pMD19-T載體，篩選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，得到558 bp的開(kāi)放閱讀框 (ORF) 序列，編碼185個(gè)氨基酸，具備高度保守的組氨酸簇HXXHH (圖1B)，比對(duì)結(jié)果表明Bmelo424克隆序列和家蠶SilkDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)基因序列完全一致。

圖1 家蠶Bmelo424基因的克隆 (A) 及分析 (B)Fig.1 Cloning and analysis of Bmelo424 gene.(A) PCR amplification of the Bmelo424 gene.(B) The ORF sequence of Bmelo424 gene and its deduced amino acid, HXXHH motif was highlighted in grey.

2.2 Bmelo424蛋白序列分析

通過(guò)TMHMM Server 2.0工具在線預(yù)測(cè)Bmelo424蛋白的跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示其有4個(gè)跨膜區(qū)，預(yù)測(cè)位置分別在13–35、45–67、79–101、105–124的氨基酸區(qū)域 (圖2A)。利用NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)Bmelo424的磷酸化位點(diǎn)有：6個(gè)絲氨酸 (Serine) 磷酸化位點(diǎn) (分別在第30、43、131、133、141和204 位點(diǎn))、8個(gè)蘇氨酸 (Threonine) 磷酸化位點(diǎn) (第38、44、81、82、148、149、173和179位點(diǎn))、4個(gè)酪氨酸 (Tyrosine) 磷酸化位點(diǎn)(第61、128、132和156位點(diǎn)) (圖2B)。通過(guò)PSIPRED v3.3工具在線分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大，為53.3%，α-螺旋和β-折疊股分別占26.7%和20% (圖2C)。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Bmelo424蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

2.3 Bmelo424基因的組織表達(dá)特征

采用熒光定量PCR的方法對(duì)Bmelo424基因在五齡三天家蠶幼蟲(chóng)組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，其在精巢、卵巢、頭、體壁、脂肪體、中腸、血細(xì)胞、前中絲、后絲和馬氏管中均有表達(dá) (圖3)。其中，在頭和體壁中表達(dá)量較高，在精卵巢中表達(dá)量稍低，在血細(xì)胞中表達(dá)量最低。

2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

用帶有酶切位點(diǎn)的引物PCR擴(kuò)增Bmelo424基因 (表1)，通過(guò)TA克隆獲得pMD-Bmelo424重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒與pYES2質(zhì)粒用BamHⅠ和NotⅠ分別雙酶切后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定 (圖4)，陽(yáng)性質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)目的基因大小的片段，同時(shí)雙酶切后的載體片段與空質(zhì)粒pYES2的大小一致，而且陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果也和克隆序列相同，說(shuō)明成功構(gòu)建pYES2-Bmelo424表達(dá)載體。

圖2 Bmelo424蛋白序列分析Fig.2 Protein sequence analysis of Bmelo424. (A) Transmembrane domain prediction of Bmelo424.(B)Phosphorylation sites prediction of Bmelo424.(C) Secondary structure prediction of Bmelo424.

圖3 Bmelo424基因的組織表達(dá)譜Fig.3 Expression profiles of Bmelo424 gene in different tissues.

圖4 pYES2-Bmelo424重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.4 Restriction enzyme digestion of the recombinant pYES2-Bmelo424.M: marker; 1: pYES2; 2:pYES2-Bmelo424; 3: pYES2 plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ; 4: pYES2-Bmelo424 plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ.

2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞

釀酒酵母INVSc1屬于營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，只有在pYES2存在的情況下，才能在尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基(SC-Ura) 上生長(zhǎng)。提取構(gòu)建好的pYES2-Bmelo424重組質(zhì)粒和pYES2空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1感受態(tài)細(xì)胞，涂布培養(yǎng)后在SC-Ura培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，得到與目的基因大小相符的片段，進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化至釀酒酵母INVSc1細(xì)胞中 (圖5)。

2.6 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)物的鑒定

將含有空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的釀酒酵母分別接種SC-Ura液體培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)后收集適量菌體，再把菌體重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)30 h，離心收集菌體后冷凍干燥，并對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行脂肪酸提取和甲酯化，利用GC-MS檢測(cè)其脂肪酸組分。結(jié)果顯示，攜帶空質(zhì)粒pYES2的釀酒酵母細(xì)胞中主要含有棕櫚酸 (C16:0)、棕櫚油酸 (C16:1n-7)、硬脂酸 (C18:0) 和油酸 (C18:1n-9) 4種脂肪酸。而攜帶pYES2-Bmelo424重組質(zhì)粒的酵母細(xì)胞中，主要脂肪酸含量發(fā)生變化，除了棕櫚油酸含量顯著上升外，其余3種脂肪酸的含量都有所下降 (圖6)。

2.7 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的溫度脅迫響應(yīng)

釀酒酵母在正常溫度 (30 ℃) 培養(yǎng)時(shí)，攜帶pYES2-Bmelo424重組質(zhì)粒和pYES2空質(zhì)粒的細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)沒(méi)有明顯差別。而不同溫度脅迫處理后的兩種釀酒酵母在細(xì)胞生長(zhǎng)活性上表現(xiàn)出差異，其中，低溫 (4 ℃) 處理后，攜帶pYES2-Bmelo424重組質(zhì)粒的釀酒酵母細(xì)胞比攜帶pYES2空質(zhì)粒的釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)狀況要好，但是高溫(40 ℃) 處理后，其生長(zhǎng)狀況卻截然相反 (圖7)。

圖5 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.5 Identification of yeast transformants by PCR.M:marker; 1: pYES2; 2: pYES2-Bmelo424.

圖6 pYES2酵母細(xì)胞和pYES2-Bmelo424重組酵母細(xì)胞的脂肪酸含量比較Fig.6 Comparison of fatty acids content between pYES2 and pYES2-Bmelo424 of yeast cells.*P<0.05.

圖7 兩種酵母細(xì)胞在不同溫度脅迫處理后的生長(zhǎng)狀況比較Fig.7 Comparison of the growth of two kinds of yeast cells after different temperature stress treatments.(A)40 °C.(B) 30 °C (Control).(C) 4 °C.

3 討論

ELOVL基因突變會(huì)引起諸如魚(yú)鱗癬、黃斑退化、肌病、智力缺陷和髓鞘脫失等遺傳性疾病[31]，昆蟲(chóng)中ELOVL基因具有影響信息素合成、雄性生育力和Toll/Imd免疫信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)等功能[19,23-24]。家蠶是典型的鱗翅目經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，其ELOVL基因多達(dá)13個(gè)，但還沒(méi)有功能鑒定報(bào)道[28]。本文以家蠶五齡三天全蠶cDNA為模板克隆獲得Bmelo424基因558 bp的ORF序列，其推導(dǎo)氨基酸序列具有4個(gè)潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域，高度保守的組氨酸簇HXXHH，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，表明Bmelo424和其他延長(zhǎng)酶一樣屬于膜結(jié)合蛋白，但其主要功能發(fā)揮區(qū)域同樣局限于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[32]，另外，其具備發(fā)揮活性所必需的HXXHH基序，并且其活性位點(diǎn)和賴(lài)氨酸殘基之間的距離決定超長(zhǎng)鏈脂肪酸的碳鏈合成長(zhǎng)度[33]。Bmelo424有6個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，這些磷酸化位點(diǎn)可能對(duì)其生物學(xué)功能行使有重要影響。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示α-螺旋和β-折疊股占46.7%，二者常位于內(nèi)部且不易變形，可穩(wěn)定維持蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。Bmelo424基因在每個(gè)組織中均有表達(dá)，這與芯片數(shù)據(jù)基本一致[28]。在昆蟲(chóng)類(lèi)超長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶家族成員中，既有在各組織中廣泛表達(dá)的成員[23,26]，也有組織特異性表達(dá)的成員[19]，Bmelo424基因在家蠶各組織均有表達(dá)，而其表達(dá)水平的高低暗示該基因在不同組織中行使的功能可能有所差異。此外，鑒于昆蟲(chóng)表皮脂類(lèi)在失水屏障、影響化學(xué)農(nóng)藥吸收、阻止病原入侵以及信息素組成等方面的作用[34]，結(jié)合Bmelo424基因主要在頭和體壁高表達(dá)的結(jié)果，我們推測(cè)其可能與家蠶的環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)。

Bmelo424基因的異源表達(dá)會(huì)引起釀酒酵母細(xì)胞的脂肪酸組分含量的變化，pYES2-Bmelo424重組酵母比pYES2酵母的C16:1n-7脂肪酸含量有顯著提高，表明外源Bmelo424基因在釀酒酵母細(xì)胞中對(duì)催化生成C16:1n-7脂肪酸有積極作用。家蠶Bmelo424基因僅影響長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，值得一提的是，ELOVL參與合成不同碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸的功能在其他物種中也有報(bào)道，諸如酵母中ELO1限于延伸C14脂肪酸到C16[2]；錐蟲(chóng)中ELO1延伸C4脂肪酸到C10，ELO2延伸C10脂肪酸到C14，ELO3延伸C14脂肪酸到C18[35]；小鼠中ELOVL6參與延伸C12–C16脂肪酸[14]；果蠅中ELO68α可以合成C16和C18脂肪酸[19]；黃粉蟲(chóng)中TmELO2可以合成C16脂肪酸[27]。這些研究結(jié)果都說(shuō)明ELOVL除了主要負(fù)責(zé)超長(zhǎng)鏈脂肪酸的延伸外，也參與其他碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸延伸。同時(shí)，我們將昆蟲(chóng)中已涉及功能實(shí)驗(yàn)的ELOVL成員作了比較，發(fā)現(xiàn)Bmelo424與黃粉蟲(chóng)的TmELO2親緣關(guān)系最近，且黃粉蟲(chóng)的TmELO2也僅影響C16脂肪酸合成[27]，因此，家蠶Bmelo424與黃粉蟲(chóng)中已報(bào)道的同系物功能基本吻合。

在果蠅中，其耐冷性增強(qiáng)后會(huì)導(dǎo)致單烯酸比例增加而二烯酸比例降低，同時(shí)伴有C16脂肪酸增加而C18脂肪酸減少的現(xiàn)象[36]，Bmelo424基因引起酵母C16:1n-7脂肪酸含量提高可以增加酵母細(xì)胞的冷脅迫后的適應(yīng)能力，但對(duì)熱脅迫后的適應(yīng)能力卻明顯減弱，這也間接暗示Bmelo424基因可能影響家蠶的抗逆性。另外，白紋伊蚊中ELO表達(dá)水平的上調(diào)和滯育卵抗干燥能力的提高相關(guān)，也說(shuō)明ELOVL家族的部分基因影響其抗逆性[24]。這也提示我們可以通過(guò)改變ELOVL抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，以提高經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)適應(yīng)逆境的能力，或用類(lèi)似方式降低害蟲(chóng)適應(yīng)逆境的能力以達(dá)到控害目標(biāo)。