胡煜 欒超 練霓 郝志敏 孫玉潔 王焱 顧恒 陳敏

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病醫(yī)院江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室，南京210042

研究發(fā)現(xiàn)銀屑病與許多系統(tǒng)性疾病密切相關，包括心血管疾病、肥胖、高脂血癥、糖尿病和代謝綜合征等［1-2］。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）是一種由肝臟合成的蛋白酶，能夠與肝臟低密度脂蛋白受體（LDLR）相結合，促進LDLR 降解，從而提高血漿低密度脂蛋白（LDL）濃度［3］。靶向抑制PCSK9 活性后能夠降低血漿LDL 濃度［4-5］。而且，PCSK9 可能是動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的炎癥因子，可通過沉默PCSK9降低apoE敲除小鼠動脈粥樣硬化主動脈中腫瘤壞死因子α（TNF-α），Toll 樣受體4（TLR-4）和核因子κB（NF-κB）的表達［6］。此外，PCSK9還能夠通過誘導炎癥因子TNF-α、白細胞介素1（IL-1）和IL-6 來驅(qū)動巨噬細胞的炎癥反應［7］。為探究PCSK9在銀屑病發(fā)病機制中的作用，本研究檢測銀屑病患者外周血中PCSK9 的表達以及PCSK9 對外周血CD4+T細胞分泌細胞因子的影響。

對象與方法

一、對象

2016年2月至2017年12月于中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院門診收集30例確診的尋常性銀屑病患者，其中男16 例，女14 例，年齡18 ～66（40.20±16.20）歲，病程1 個月至15（5.62 ± 4.42）年。所有患者均處于進展期，銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）2.1 ～28.8（12.35±6.25）。所有納入患者近3個月內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、維A酸制劑及免疫抑制劑等系統(tǒng)治療，1個月內(nèi)未使用外用藥物或光療，無高血壓、糖尿病、高血脂、心血管疾病病史，無感染、腫瘤或其他嚴重系統(tǒng)疾病史，無自身免疫性疾病史，排除妊娠、哺乳期婦女。對照組30例為2016年2月至2017年12月于中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院招募的健康志愿者，其中男15 例，女15例，年齡18 ～54（36.23±13.58）歲?；颊呓M與對照組性別及年齡差異均無統(tǒng)計學意義（性別χ2=0.067，P=0.796，年齡t=-1.028，P=0.308）。本研究經(jīng)過中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院（研究所）醫(yī)學倫理委員會批準，批件號為（2016）快審第（KY019）號，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、試劑

淋巴細胞分離液LymphoprepTM為挪威Axis-Shield 公司產(chǎn)品；Trizol 試劑為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR、RT-PCR 試劑盒AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed）均來自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCSK9 Quantikine ELISA 試劑盒來自美國R&D Systems公司；BD IMagTMCD4+分離系統(tǒng)來自美國BD Biosciences 公司；人干擾素γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒及人IL-17A ELISA 試劑盒來自美國RayBiotech 公司；重組PCSK9蛋白為美國BPS Biosciences公司產(chǎn)品。

三、方法

1.外周血單個核細胞（PBMC）分離和總RNA提?。喝∈茉囌哽o脈血10 ml，1 000 r/min（離心半徑16 cm）離心10 min 分離血漿，用Ficoll 密度梯度離心法通過淋巴細胞分離液LymphoprepTM分離PBMC。Trizol 試劑提取PBMC 中總RNA，利用NanoDrop 2000C 超微量分光光度計測定在波長260、280和230 nm的吸光度，計算RNA濃度并評估純度。

2.實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測PBMC中PCSK9 表達：參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed）試劑盒說明書進行qPCR反應，內(nèi)參基因為3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。20 μl反應體系包括：10 μl AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，0.4 μl 正向引物，0.4 μl 反向引物，2 μl 模板cDNA 和7.2 μl 雙蒸水。反應條件為：95 ℃5 min 1 個循環(huán)；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，1 個循環(huán)。PCSK9 正向引物5′-AGGGGAGGACATCATTGGTG-3′，反向引物5′-CAGGTTGGGGGTCAGTACC-3′。GAPDH 正向引物5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，反向引物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。

3.ELISA 法檢測血漿中PCSK9 表達：參照PCSK9 Quantikine ELISA 試劑盒說明書操作，繪制標準曲線，檢測血漿中PCSK9的表達水平。

4.外周血CD4+T淋巴細胞分離：分離PBMC加入10倍體積1×BD磁珠緩沖液洗滌，然后每107細胞加入50 μl BD IMagTMCD4+磁珠，混勻，室溫孵育30 min 后，加入1 ml 1×BD 磁珠緩沖液，將細胞轉(zhuǎn)移至FACS管中，置于磁力架8 ～10 min。之后棄上清液，將檢測管移出磁場，用1 ml 1×BD 磁珠緩沖液沖洗并重懸附于管壁的細胞后，重新置入磁場2 ～4 min，棄上清液，移出磁場，再次重懸后置入磁場2 ～4 min，棄上清液后所得細胞用于后續(xù)實驗。

5.CD4+T淋巴細胞的刺激培養(yǎng)：將分離的外周血CD4+T淋巴細胞以4×105個/ml的濃度接種于含5%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素及L-谷氨酰胺的RPMI 1640 培養(yǎng)液的24 孔培養(yǎng)板中。每例受試者的CD4+T 淋巴細胞均分為實驗組和對照組，實驗組加入2 μg/L 重組PCSK9 蛋白、對照組不加重組PCSK9蛋白培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)基上清液。

6.ELISA法檢測培養(yǎng)基上清液細胞因子水平：參照人IFN-γ ELISA 試劑盒及人IL-17A ELISA 試劑盒說明書操作，繪制標準曲線，對培養(yǎng)基上清液中的IFN-γ和IL-17A水平進行定量檢測。

7.統(tǒng)計學分析：采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗；計量資料用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，血漿PCSK9濃度與PASI的關系采用Pearson相關性分析，P＜0.05判定為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、銀屑病患者及對照組PBMC 和血漿中PCSK9的表達水平

qRT-PCR 均未檢測到銀屑病患者和對照組PBMC中PCSK9 mRNA的表達。

ELISA檢測顯示，銀屑病組血漿PCSK9水平為（243.58±11.91）μg/L，對照組為（199.74±31.09）μg/L，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=5.761，P＜0.001）。銀屑病患者血漿PCSK9水平與PASI評分無顯著相關性（r=0.187，P=0.431）。

二、PCSK9對銀屑病患者和健康對照CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-17A的影響

銀屑病患者實驗組IFN-γ 和IL-17A 表達水平均高于銀屑病患者對照組（表1），兩組差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。健康對照實驗組和對照組均未檢測到IFN-γ和IL-17A的表達。

討論

PCSK9 是一種主要由肝細胞合成的分泌型蛋白，在機體中參與調(diào)控血脂和膽固醇代謝過程［8］。PCSK9 不僅能夠通過誘導LDLR 降解，提高血漿LDL 濃度，還可以通過與LDLR 之間的相互作用調(diào)節(jié)脂蛋白a的表達，從而參與調(diào)節(jié)膽固醇和脂類代謝［9］。此外，研究發(fā)現(xiàn)PCSK9在機體炎癥反應過程中也扮演著重要的角色。氧化的LDL 通過劑量依賴性方式影響巨噬細胞中IL-1α、IL-6 和TNF-α 的分泌，進一步上調(diào)PCSK9的表達［10］。Li等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定型冠心病患者中血漿PCSK9水平與白細胞計數(shù)呈正相關，提示血漿PCSK9表達與穩(wěn)定型冠心病患者慢性炎癥狀態(tài)存在潛在的相互作用。同樣，研究表明，在類風濕關節(jié)炎（RA）患者中，血清PCSK9 水平明顯高于對照組，且與RA 病情活動度呈正相關，提示類風濕關節(jié)炎患者全身的炎癥狀態(tài)有可能誘導RA 患者PCSK9 表達增多，PCSK9 通過參與IL-1α、IL-6 和TNFα 等炎癥因子的分泌，參與并加重RA 的炎癥反應［12］。雖然已經(jīng)明確PCSK9在代謝紊亂和免疫性疾病中起重要作用，但目前還沒有研究涉及PCSK9 與銀屑病發(fā)病機制的關系。本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者血漿PCSK9 含量明顯增高，提示PCSK9可能參與銀屑病的發(fā)病機制。

表1 ELISA法檢測PCSK9對銀屑病患者CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-17A的影響（ng/L,±s）

表1 ELISA法檢測PCSK9對銀屑病患者CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-17A的影響（ng/L,±s）

注：n=30。PCSK9：前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9；IFN-γ：干擾素γ；IL-17A：白細胞介素17A

組別實驗組（加PCSK9）對照組（未加PCSK9）t值P值IFN-γ 6 150.00±212.13 4 650.00±212.13 7.071＜0.05 IL-17A 1 532.00±11.31 698.5±266.58 4.418＜0.05

為了進一步研究PCSK9 是通過何種途徑參與銀屑病的異常炎癥免疫反應過程，我們分離培養(yǎng)了進展期銀屑病患者CD4+T 淋巴細胞，加入重組人PCSK9蛋白進行混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)PCSK9能夠誘導促炎癥細胞因子IFN-γ和IL-17A的分泌，而在健康對照人群CD4+T 淋巴細胞中未觀察到該變化，考慮可能與銀屑病患者異常的炎癥反應狀態(tài)相關。IFN-γ 作為Th1 細胞主要分泌的細胞因子，不僅在銀屑病患者血清中高表達，并且表達水平與銀屑病患者疾病嚴重程度相關［13］。IL-17A是Th17細胞的主要效應細胞因子，能夠刺激角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生趨化因子、細胞因子和其他促炎介質(zhì)，從而維持銀屑病慢性炎癥狀態(tài)［14］。因此，我們推測PCSK9可能通過誘導CD4+T 細胞分泌炎癥細胞因子，從而促進銀屑病的異常炎癥免疫反應。我們研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病組血漿中PCSK9表達水平高于對照組，但其表達水平與PASI 評分沒有相關性，推測PCSK9 可能作為CD4+T 細胞炎癥反應過程的誘導分子參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展進程，但與銀屑病嚴重程度并不相關。

本研究仍有不足之處，首先未對CD4+T 淋巴細胞亞群進行分析。在銀屑病的發(fā)病機制中，除了Th1 和Th17 細胞亞群之外，以分泌IL-22 為主的Th22 細胞也在其中發(fā)揮重要作用。因此，應進一步探究PCSK9 與CD4+T 淋巴細胞亞群之間的關系。其次，角質(zhì)形成細胞作為銀屑病另一重要靶細胞，其異常增殖、凋亡與銀屑病發(fā)病過程密切相關。接下來我們將研究PCSK9 對角質(zhì)形成細胞表型的影響來進一步揭示PCSK9在銀屑病中的作用。

綜上所述，本研究顯示，PCSK9 在銀屑病患者血漿中明顯增高，PCSK9可能通過誘導銀屑病患者CD4+T 淋巴細胞分泌IFN-γ 和IL-17A 在銀屑病的發(fā)病機制中起重要作用。