童 揚,姜 靜*,陳小華,趙 雪,夏 雪,孫莉婭

(1四川省宜賓市第二人民醫(yī)院南區(qū)婦科,宜賓 644000;2四川省宜賓市第二人民醫(yī)院研究中心;3四川省宜賓市第二人民醫(yī)病理科;4四川省宜賓市第二人民醫(yī)院婦;*通訊作者,E-mail:914016419@qq.com)

微小RNA(miRNA,miR)是一類非編碼的長約22 nt小分子RNA,通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合,調(diào)控靶基因表達,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,調(diào)節(jié)如細胞分化、增殖、凋亡和腫瘤形成等多種細胞功能。某些miR的異常表達可直接作為抑癌或促癌因素,參與人類腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[1]。有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者存在多種miR(miR-119b、miR-218、miR-119a)的表達異常現(xiàn)象,且通過調(diào)控宮頸癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)或增殖遷移能力可產(chǎn)生抑癌或促癌作用[2-4]。miR-224是miR家族的一員,被證實與胃癌、乳腺癌、卵巢癌的EMT及增殖、遷移密切相關,有研究報道m(xù)iR-224與宮頸癌的病理特征及預后密切相關[5,6],但其在宮頸癌中的具體作用及機制仍缺乏相關報道。本研究檢測了宮頸癌組織和宮頸癌細胞中miR-224表達的改變,并干擾其表達水平,以探索其對宮頸癌細胞EMT及增殖、遷移能力的影響。

1 資料與與方法

1.1 一般資料

選取于2018年1月至6月在宜賓市第二人民醫(yī)院救治的宮頸癌患者24例作為研究對象,年齡36-58歲,平均年齡(45.8± 5.6)歲。納入標準:①組織活檢確診為宮頸癌;②無其他部位惡性腫瘤;③患者及家屬均知情并同意參與該研究。排除標準:①妊娠期及哺乳期患者;②既往有慢性腎病、慢性肝病患者;③合并自身免疫系統(tǒng)疾病的患者。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.2.1 細胞株及主要試劑 人宮頸癌細胞株HCE1由宜賓市第二人民醫(yī)院實驗中心提供。兔多克隆抗體E-cadherin、N-cadherin和vimentin均購自美國Abcam公司,Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測試劑盒購自中國碧云天公司,DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司,胎牛血清購自美國Gibco公司,Trizol Reagent購自Invitrogen公司,miR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司,PCR mix購自日本Toyobo公司。

1.2.2 宮頸癌細胞的增殖培養(yǎng) 人宮頸癌細胞株HCE1常規(guī)培養(yǎng)于5%的CO2飽和溫度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基,每2-3 d用0.25%胰酶消化,以1 ∶2傳代。在HCE1細胞生長穩(wěn)定、呈對數(shù)期時用于實驗。

1.2.3 miR-224分組與瞬時轉(zhuǎn)染 miR-224的提取和反轉(zhuǎn)錄參照說明書進行,miR-224抑制劑采用miR-224成熟體的反向互補序列,并對所有堿基進行2′甲基修飾購自中國百奧邁科生物技術有限公司,轉(zhuǎn)染步驟嚴格按照說明書執(zhí)行。人宮頸癌細胞株HCE1接種于6孔板,加入含10% FBS的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),在37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),約50%-60%融合時,采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000方法瞬時轉(zhuǎn)染。共分四組:空白組,常規(guī)培養(yǎng)的宮頸癌細胞;陰性對照(negative control,NC)組,轉(zhuǎn)染miR-224 NC(100 nmol/ml)的宮頸癌細胞;miR-224抑制劑組,轉(zhuǎn)染miR-224抑制劑(100 nmol/ml)的宮頸癌細胞;miR-224模擬劑組,轉(zhuǎn)染miR-224模擬劑(100 nmol/ml)的宮頸癌細胞。嚴格按照脂質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)染,6 h內(nèi)用OMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.2.4 E-cadherin、N-cadherin和vimentin水平檢測 獲得患者癌組織及癌旁組織,以及相應細胞系樣本,均嚴格按照RNAgent Isolation System說明書,抽提總RNA。取1 μg總RNA,嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應在PE公司的GeneAmp8 5700型PCR擴增儀上進行,嚴格按照SYBR green說明書加樣,總反應體系20 μl,各樣本加cDNA 2 μl;SYBR green 10 μl;商品化引物2 μl(miR-224,上海生工,中國;GAPDH:MQP027158;Genecopoeia公司,美國);RANase Rree去離子水2 μl。按兩步法反應94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,40個循環(huán),以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照進行分析,檢測E-cadherin、N-cadherin和vimentin基因的表達水平。采用Western blot進行檢測。按不同因素處理細胞,提取蛋白,測定蛋白濃度,采用5×上樣緩沖液稀釋,使用12%分離膠電泳,轉(zhuǎn)膜90 min,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST漂洗10 min×3次,用5%TBST稀釋的BSA稀釋一抗,分別與膜接觸4 ℃孵育過夜后，用TBST漂洗10 min×3次,加二抗室溫下孵育1 h后,用TBST洗膜10 min×3次,在Gene Gnome曝光儀上曝光并拍照。

1.2.5 宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的檢測 ①采用細胞增殖實驗來檢測宮頸癌細胞增殖能力,具體操作方法如下:在96孔板中每孔接種5×103個細胞,每組設置4個復孔。將細胞剛好貼壁記為0 h,于12 h利用CCK-8檢測試劑盒檢測細胞增殖;每孔加入10 μl CCK-8溶液,空白對照孔加10 μl 0.9%生理鹽水,在細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h,然后用酶標儀在570 nm處測定各孔的吸光度(A)值。②采用細胞劃痕實驗檢測宮頸癌細胞的遷移能力,具體操作如下:細胞按每孔約5×105個細胞的密度接種到6孔板,培養(yǎng)24 h至細胞伸展,用無菌200 μl的槍頭在細胞層垂直、快速劃痕。劃痕結(jié)束后在細胞孵化箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察劃痕愈合。③采用侵襲實驗檢測宮頸癌細胞侵襲能力,具體操作方法如下:Transwell小室(Millipore,USA)底部鋪入50 μl Basement Membrane Matrix(Corning,USA,稀釋=1 ∶2),置于細胞孵箱中2 h。收獲細胞,制成每200 μl DMEM(GIBECO,USA)中含6×104個細胞懸液。Transwell上室加入200 μl DMEM細胞懸液,下室加入800 μl含10%胎牛血清DMEM,置于細胞培養(yǎng)箱中。侵襲48 h后取出小室,多聚甲醛中固定10 min,結(jié)晶紫中染色3 min。PBS洗凈結(jié)晶紫,并用棉簽輕輕擦拭Transwell小室上室底部。晾干后,將小室倒置于顯微鏡下觀察并拍照,計算細胞數(shù)目觀察各組細胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-224在宮頸癌及癌旁正常組織的表達

收集24例宮頸癌組織和24例癌旁組織,采用RT-PCR法檢測腫瘤組織以及癌旁組織中miR-224的表達情況。結(jié)果顯示,腫瘤組織miR-224的表達顯著高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(7.56±1.48vs4.28±0.65,t=3.176,P=0.002,見圖1)。

圖1 miR-224在24例宮頸癌組織和24例癌旁正常組織中的表達Figure 1 Expression of miR-224 in 24 cases of cervical cancer tissues and 24 cases of adjacent normal tissues

2.2 miR-224對HCE1細胞增殖能力的影響

采用miR-224抑制劑及模擬劑轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞株HCE1,采用CCK8法檢測細胞的增殖能力。結(jié)果顯示,不同組別之間細胞增殖能力有顯著差異(F=13.33,P=0.002)。進一步行兩兩比較顯示,miR-224抑制劑作用后,細胞增殖能力較NC組顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.659,P=0.022);而采用miR-224模擬劑作用后,細胞的增殖能力較NC組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(t=6.454,P=0.003,見圖2A)。

2.3 miR-224對HCE1細胞遷移、侵襲能力的影響

為進一步探究miR-224對宮頸癌細胞株HCE1遷移、侵襲能力的影響,采用劃痕實驗檢測細胞遷移能力、侵襲實驗檢測侵襲能力。miR-224抑制劑組、miR-224模擬劑組及NC組之間遷移能力(F=8.805,P=0.007)、侵襲能力(F=10.73,P=0.004)組間差異有統(tǒng)計學意義。進一步行兩兩比較顯示,miR-224抑制劑作用后,細胞愈合面積比例顯著低于NC組(t=4.117,P=0.015),而miR-224模擬劑組細胞愈合面積比例顯著高于NC組(t=8.672,P=0.001,見圖2B)。由此可見,抑制miR-224可以抑制宮頸癌細胞的遷移能力。miR-224抑制劑作用后,miR-224抑制劑組細胞穿膜細胞數(shù)明顯少于NC組(t=8.041,P=0.001),而miR-224模擬劑組,細胞穿膜細胞數(shù)明顯多于NC組(t=3.448,P=0.026,見圖2C)。結(jié)果提示,抑制miR-224可以抑制宮頸癌細胞的侵襲。

與NC組相比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 四組宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力比較Figure 2 Comparison of proliferation, migration and invasion ability of HCE1 cells among four groups

2.4 EMT標志物的表達水平

為進一步探究miR-224促進宮頸癌細胞株HCE1增殖、遷移和侵襲的機制,采用Western blot法檢測不同組別EMT標志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表達。三組間EMT標志物E-cadherin(F=12.66,P=0.002)、N-cadherin(F=16.79,P=0.001)和vimentin(F=13.88,P=0.002)的表達差異有統(tǒng)計學意義。進一步行兩兩比較顯示,miR-224抑制劑組上皮標記物E-cadherin的蛋白表達顯著高于NC組(t=6.148,P=0.004);而間質(zhì)標記物N-cadherin(t=7.021,P=0.002)和vimentin(t=4.569,P=0.010)的蛋白表達顯著低于NC組。但是在miR-224模擬劑組中,E-cadherin的蛋白表達顯著低于NC組(t=6.005,P=0.004);而間質(zhì)標記物N-cadherin(t=5.606,P=0.005)和vimentin(t=4.151,P=0.014)的蛋白表達顯著高NC組(見圖3,4)。由此可見,抑制miR-224可以抑制宮頸癌細胞的EMT,而過表達miR-224可以促進宮頸癌細胞的EMT。

圖3 不同組別細胞E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表達灰度Figure 3 Expression of E-cadherin, N-cadherin, and vimentin proteins in different groups by Western blot

3 討論

宮頸癌是女性常見的生殖系統(tǒng)腫瘤。近年來,發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢,更加年輕化。早期診斷及治療被認為是降低宮頸癌死亡率、提高患者生存質(zhì)量的重要措施。miR作為一種具有廣泛調(diào)節(jié)能力的信號分子,具有癌基因或抑癌基因的作用,通常促癌miRs在腫瘤中表達上調(diào),通過解除抑癌基因調(diào)控,阻止細胞的分化,調(diào)控細胞惡性轉(zhuǎn)化,還可以通過抑制細胞凋亡、促進細胞增殖等多種途徑來促進腫瘤的發(fā)展。有研究[7]證實miR在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。miR-224作為miR家族的一員,已經(jīng)被證實在髓母細胞瘤、乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮促癌效應[8,9]。陳文波等[6]研究結(jié)果顯示miR-224在宮頸癌組織中表達上調(diào),且表達越高,腫瘤分化越低,患者預后越差,Shen等[10]研究結(jié)果與陳文波等[6]研究結(jié)果具有一致性,進一步佐證了miR-224在宮頸癌組織具有促癌作用。本研究亦證實,miR-224在宮頸癌患者的組織中及宮頸癌細胞中的表達明顯增加,且過表達miR-224可以顯著增加宮頸癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力?？赡茉蛴?①miR-224可通過激活AKT信號傳導和直接靶向腫瘤抑制基因PPP2R1B促進細胞遷移和侵襲[11,12]和rho GTP酶活化蛋白ARHGAP9和ARHGAP21,其使CDC42失活[13]。②miR-224可以通過直接或間接調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶來影響侵襲和轉(zhuǎn)移,所述基質(zhì)金屬蛋白酶是癌細胞分泌的酶,其降解細胞外基質(zhì)并有助于傳播。③miR-224可能在調(diào)節(jié)EMT中起作用,EMT作為癌細胞增殖、遷移與侵襲能力增加的重要機制,在宮頸癌中發(fā)揮的相應作用近來受到越來越多學者的重視[14]。EMT的實質(zhì)是調(diào)控肌動蛋白絲的動態(tài)裝配,因此,上皮標志物(E-cadherin)的表達下調(diào),而間質(zhì)標志物(N-cadherin、vimentin)的表達上調(diào)被認為是腫瘤細胞獲得EMT的重要標志[15,16]。同時miR可以通過啟動后機制、共翻譯蛋白降解機制、啟動機制、miR介導的mRNA降解等多種途徑[17]調(diào)控細胞的EMT。本研究在宮頸癌患者蛋白水平在發(fā)現(xiàn)EMT標志物表達改變,過表達miR-224可以下調(diào)E-cadherin的表達,促進N-cadherin與vimentin的表達,進一證實了miR-224可能在宮頸癌的發(fā)病中起到促癌作用,為宮頸癌治療提供新的治療思路。但由于本次納入的樣本數(shù)較少,仍需要更大樣本的研究來進一步證實。

與NC組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖4 EMT標志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表達灰度分析Figure 4 E-cadherin, N-cadherin and vimentin protein expression in different groups

綜上所述,miR-224通過促進N-cadherin與vimentin的表達,抑制E-cadherin的表達,調(diào)控宮頸癌細胞的EMT,促進宮頸癌的增殖、侵襲和遷移。在宮頸癌中,miR-224可能發(fā)揮促癌作用,為宮頸癌治療提供新的治療思路。