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(1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,教育部北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

玉米醇溶蛋白是玉米中的主要貯藏蛋白,屬于食品級(jí)[1]醇溶性多肽。由于其疏水性以及能溶于乙醇水溶液[2]的特性,可通過(guò)調(diào)節(jié)溶劑的溶解性能,從而形成帶正電的玉米醇溶蛋白顆粒(ZCP),達(dá)到運(yùn)載生物活性成分的效果。海藻酸丙二醇酯(PGA)是一類食品級(jí)多糖[3],目前主要用作一種增加粘度、改善乳化性、包被活性成分的食品添加劑[4]。

與表面活性劑通過(guò)降低表面張力使乳液穩(wěn)定的機(jī)制不同,Pickering乳液是一種由固體顆粒制備的乳液,固體顆粒可提供致密的物理隔層,從而防止液滴聚結(jié),穩(wěn)定乳液[5]。Pickering乳液的潤(rùn)濕性、粒徑、形狀、表面性質(zhì)和濃度會(huì)受到顆粒類型的影響[6]。

由于傳統(tǒng)的單層乳液在某些條件下穩(wěn)定性較差,為了提升乳液的穩(wěn)定性,可以采用化學(xué)改性[7]、低能乳化[8]、微乳液聚合[9]、逐層靜電沉積技術(shù)(LBL)[10]等方法制備多層乳液。逐層靜電沉積技術(shù)(LBL)是一種依靠帶電聚合物之間的靜電作用力,促使電性相反的帶電聚合物逐層構(gòu)建靜電薄膜結(jié)構(gòu)的技術(shù)[11-12]。通過(guò)這種技術(shù)構(gòu)建的多層乳液,其油/水界面常由多層蛋白質(zhì)、多糖或脂質(zhì)組成[13],可以保護(hù)封裝組分免受化學(xué)降解[14],并根據(jù)特定環(huán)境觸發(fā)因素釋放封裝組分[15]。

本實(shí)驗(yàn)采用逐層靜電沉積技術(shù)(LBL),在顆粒和乳化劑的共同存在下制備了雙層乳液。該雙層乳液的油/水界面由ZCP和PGA組成,并系統(tǒng)地研究了不同濃度的PGA以及ZCP與PGA的加入順序,對(duì)雙層乳液物理穩(wěn)定性和微觀結(jié)構(gòu)的影響,并采用光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)對(duì)此新型雙層乳劑的形態(tài)特征進(jìn)行觀察,以期為這種由顆粒和乳化劑復(fù)合穩(wěn)定的新型雙層乳液提供一些新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米醇溶蛋白91.3%(w/w) Sigma-Aldrich公司(美國(guó));無(wú)水乙醇99.99%(v/v)、固體氫氧化鈉99.0%(w/w)、液體鹽酸36%(w/w) Eshowbokoo生物技術(shù)有限公司(中國(guó)北京);食品級(jí)海藻酸丙二醇酯(PGA)87.9%(w/w) 漢駿糖業(yè)有限公司(中國(guó)上海);中鏈甘油三酯(MCT)50%(w/w) Lonza Inc.(美國(guó));所有其他化學(xué)試劑 均為分析純。

Ultra Turrax model T25高速剪切機(jī) IKA公司(德國(guó));LS230?激光散射粒度儀 貝克曼公司,(美國(guó));Zetasizer NanoZS90 馬爾文激光粒度儀 Malvern公司(英國(guó));Leica DMD 108光學(xué)顯微鏡,Leica TCS SP5激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM) 徠卡公司(德國(guó));LUM 290 LUMiSize穩(wěn)定性分析儀 LUM公司(德國(guó));SPSS 18.0 for Windows IBM公司(美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ZCP和PGA溶液的制備 將4 g玉米醇溶蛋白溶于800 mL 70%(v/v)乙醇水溶液中,600 r/min攪拌3 h,然后45 ℃旋蒸30 min[16],所得液體用蒸餾水稀釋至200 mL,1000 r/min離心10 min,取上清液,用0.1 mol/L HCl溶液將所得樣品pH調(diào)節(jié)至4.0,保存于5 ℃的冰箱。

將不同質(zhì)量的PGA粉末溶解于蒸餾水中,制備不同質(zhì)量濃度(0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%)的PGA溶液,溶液于600 r/min下攪拌過(guò)夜(約12 h),然后用1 mol/L NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)至4.0。

1.2.2 ZCP和PGA雙層乳液的制備 以50%(v/v)MCT油作為分散相,制備兩種不同添加順序的雙層乳液,雙層乳液總體積為30 mL,所有乳液在室溫(25 ℃)下貯藏12 h。

1.2.2.1 ZCP/PGA雙層乳液的制備 將7.5 mL ZCP分散液(2.0%,w/v)緩慢加入15 mL MCT(油相)中并同時(shí)于12000 r/min下進(jìn)行剪切,待ZCP分散液全部加入油相后繼續(xù)剪切5 min,得到初級(jí)乳液。再在同樣的剪切速度下分別向初級(jí)乳液中緩慢加入7.5 mL不同濃度的PGA水溶液(0.01%～1.5%,w/v),待PGA水溶液全部加入初級(jí)乳液后,將混合物繼續(xù)剪切5 min,得到次級(jí)乳液。從而制備出z-0.01p,z-0.05p,z-0.1p,z-0.25p,z-0.5p,z-0.75p,z-1.0p,z-1.25p和z-1.5p的ZCP/PGA雙層乳液。

1.2.2.2 PGA/ZCP雙層乳液的制備 將7.5 mL PGA水溶液(0.01%～1.5%,w/v)緩慢加入15 mL MCT(油相)中并同時(shí)于12000 r/min下進(jìn)行剪切,待PGA水溶液全部加入油相后繼續(xù)剪切5 min,得到初級(jí)乳液。再在同樣的剪切速度下向不同濃度PGA的初級(jí)乳液中分別緩慢加入7.5 mL ZCP分散液(2.0%,w/v),待ZCP分散液全部加入初級(jí)乳液后,將混合物繼續(xù)剪切5 min,得到次級(jí)乳液。從而制備出0.01p-z,0.05p-z,0.1p-z,0.25p-z,0.5p-z,0.75p-z,1.0p-z,1.25p-z和1.5p-z的PGA/ZCP雙層乳液。

1.2.2.3 對(duì)照組的制備 將15 mL ZCP分散液(2.0%,w/v)緩慢加入15 mL MCT(油相)中并同時(shí)于12000 r/min的速度下進(jìn)行剪切,待ZCP分散液全部加入油相后,將混合物繼續(xù)剪切5 min,作為對(duì)照,得到初級(jí)乳液,命名為“zein”。

1.2.3 乳液類型鑒別 取一滴乳液(約0.02 mL)分別加入到純MCT和純水(約10 mL)中,如果乳滴在水中迅速分散而在MCT中保持聚集,則認(rèn)為是水包油(o/w)型乳液,否則為油包水(w/o)型乳液[17]。

1.2.4 粒徑和電位測(cè)定 粒徑測(cè)定:使用激光散射粒度分析儀,測(cè)量乳液的平均液滴粒徑和粒徑分布。MCT和水的折射率分別為1.52和1.33。計(jì)算體積面積(D3,2)以衡量乳液液滴大小,計(jì)算公式如下:

式中：ni是直徑為di的顆粒數(shù)量。

電位測(cè)定:使用馬爾文激光粒度儀測(cè)定雙層乳液的Zeta(ζ)電位。用pH4.0的去離子水稀釋乳液至0.005wt%。設(shè)定平衡120 s,所有數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)量三次。

1.2.5 物理穩(wěn)定性分析

1.2.5.1 離心穩(wěn)定性分析 使用LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀,測(cè)量乳液的離心穩(wěn)定性。在2 mL離心管中加入1.8 mL乳液,設(shè)定轉(zhuǎn)速3000 r/min,離心時(shí)間3600 s,溫度25 ℃[18],測(cè)量不同離心時(shí)間下乳液透光率大小。

1.2.5.2 貯藏穩(wěn)定性分析 測(cè)量貯藏1、7、14、21、28 d后乳液的液滴粒徑和ζ電位,并通過(guò)拍照記錄觀察乳液表觀特征的變化。

1.2.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察

1.2.6.1 光學(xué)顯微鏡觀察 用pH4.0去離子水將乳液稀釋10倍,用光學(xué)顯微鏡觀察稀釋后乳液的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.6.2 激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)觀察 用尼羅藍(lán)(0.1%)和尼羅紅(0.1%)混合熒光染料溶液對(duì)乳液進(jìn)行染色,ZCP被尼羅藍(lán)染成藍(lán)色,MCT被尼羅紅染成紅色。用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)進(jìn)一步觀察染色乳液的界面結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有獲得的數(shù)據(jù)均取三次測(cè)定的平均值,并用SPSS進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異通過(guò)單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗(yàn)來(lái)確定,p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙層乳液的表觀特征分析

由實(shí)驗(yàn)1.2.3可知,將zein和雙層乳液滴在MCT和純水中,它們?cè)谒嘀械姆稚⑺俣让黠@快于在MCT相中的分散速度,表明它們是水包油型乳液。圖1顯示在室溫(25 ℃)下貯藏12 h后,zein乳液、不同濃度PGA和不同添加順序?qū)﹄p層乳液的外觀和物理穩(wěn)定性的影響。由ZCP單獨(dú)穩(wěn)定的zein乳液不穩(wěn)定,乳液的上相有大量油相釋放,并有明顯分層現(xiàn)象,這可能是由于ZCP的潤(rùn)濕性不足[2,16],不能很好地穩(wěn)定在油水界面,從乳滴表面脫離,從而導(dǎo)致乳液分層。低濃度PGA(≤0.1%)形成的的Z/P雙層乳液(圖1A、C),表觀特征與zein相似,均在上相很快釋放出油相,并有明顯分層現(xiàn)象,說(shuō)明低濃度PGA基本上不能覆蓋zein乳液的液滴,導(dǎo)致乳液液滴聚結(jié)。而且,帶負(fù)電的PGA的加入降低了ζ電勢(shì),使其不能提供足夠的靜電排斥,以保持乳液穩(wěn)定。隨著PGA濃度的升高(0.01%～0.5%),Z/P雙層乳液的乳化相體積不斷增加。當(dāng)PGA濃度達(dá)到0.5%以上時(shí),乳液均一穩(wěn)定,沒(méi)有明顯的油析或分層現(xiàn)象。添加順序不同時(shí),與Z/P雙層乳液相比,使用P/Z雙層乳液均呈乳白色,而Z/P雙層乳液則由淡黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨?。該現(xiàn)象的出現(xiàn)可能有兩個(gè)原因:一是PGA為兩親性多糖,具有比ZCP更快的界面吸收速度和更強(qiáng)的液滴乳化能力,所以當(dāng)先加入PGA時(shí),乳液可以形成更均勻和小粒徑的液滴。二是PGA的充分覆蓋改善了液滴的穩(wěn)定性,從而改變了乳液的外觀。

圖1 zein乳液(E),Z/P(A、B)和P/Z(C、D)雙層乳液的表觀特征Fig.1 Visual appearance of zein-based emulsion,ZCP/PGA and PGA/ZCP bilayer emulsions

2.2 粒徑分布和ζ電位測(cè)定結(jié)果

圖2A和圖2C給出了ZCP和PGA不同添加順序形成的雙層乳液的平均液滴粒徑和ζ電位值,圖2B和2D顯示了相應(yīng)的液滴粒徑分布?？梢园l(fā)現(xiàn),大部分雙層乳液的平均液滴小于80 μm(除了0.01p-z)。與果膠和玉米醇溶蛋白穩(wěn)定的Pickering乳液[16]相比,液滴粒徑相對(duì)較小,證明PGA具有比果膠更好的乳化性。就Z/P雙層乳液而言,當(dāng)?shù)蜐舛鹊腜GA(0.01%和0.05%)加入到由ZCP穩(wěn)定的Pickering乳液中時(shí),液滴粒徑增加。同時(shí),Z/P雙層乳液的Zeta電位值由正電荷(41.3±3.9) mV降至負(fù)電荷(-9.53±2.66) mV和(-10.25±2.98) mV,說(shuō)明PGA中和了液滴表面上的相反電荷,而要達(dá)到靜電穩(wěn)定,ζ電位值的絕對(duì)值必須超過(guò)30 mV,并且在絕對(duì)值5～15 mV之間,發(fā)生耗盡絮凝[19]。因此,當(dāng)PGA濃度較低時(shí),液滴間由于靜電排斥力不足,不具有足夠的穩(wěn)定性來(lái)防止聚結(jié)和分層。這與在添加低濃度PGA的Z/P雙層乳液中觀察到的分層和油相釋放表觀特征相一致(圖1A)。

圖2 不同濃度及添加順序的ZCP與PGA形成乳液的液滴大小、Zeta電位(A、C)和粒徑分布(B、D)Fig.2 Droplet size,zeta-potential(A,C)and size distribution(B,D)of zein-based Pickering emulsion and bilayer emulsions with two different adding sequences at various mass ratios of ZCP to PGA

而當(dāng)PGA的濃度從0.1%升高至1.0%時(shí),液滴的平均粒徑從(36.58±0.64) μm逐漸減小至最小值(12.46±0.03) μm。同時(shí),液滴的ζ電位從(-14.1±2.69) mV降低至最小值(-29.63±1.19) mV。當(dāng)PGA濃度大于1.0%時(shí),液滴粒徑和ζ電位均未出現(xiàn)明顯波動(dòng),表明此含量的PGA已提供了足夠的靜電排斥和機(jī)械阻隔,以穩(wěn)定乳液防止液滴聚集。此外,吸附在液滴上的PGA分子提高了乳化效率,使得液滴粒徑逐漸減小。但由于一些PGA分子可能與ZCP存在界面競(jìng)爭(zhēng)吸附,并隨后通過(guò)降低界面的表面張力來(lái)減小液滴粒徑,所以當(dāng)PGA濃度高于1.0%時(shí),由于連續(xù)相中存在過(guò)量的游離PGA而促進(jìn)液滴聚集,液滴粒徑略微增加。此結(jié)果表明,1.0%的PGA可能是完全覆蓋油/水界面和穩(wěn)定Z/P雙層乳液所需的最低濃度。

在P/Z雙層乳液中發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律。在低濃度PGA(0.01%)下,與Z/P雙層乳液相比,P/Z雙層乳液((155.2±2.5) μm)的液滴粒徑顯著增加(p<0.05),這表明乳液中發(fā)生了液滴聚集現(xiàn)象。這些乳液的PGA濃度太低,無(wú)法使油相大量乳化,并且PGA分子的負(fù)電荷被ZCP中和,靜電排斥作用降低。而當(dāng)PGA濃度升至0.05%時(shí),P/Z雙層乳液的液滴粒徑迅速降至(73.93±0.47) μm,表明PGA具有較好的乳化性,能夠更有效地降低雙層乳液的液滴粒徑。隨著PGA濃度的升高(0.05%～0.5%),液滴粒徑從(73.93±0.47) μm降低至(19.74±0.03) μm(p<0.05)。當(dāng)PGA濃度高于0.5%時(shí),液滴粒徑下降至最小值(12.23±0.04) μm,這說(shuō)明PGA完全被液滴表面吸附。如表1所示,zein乳液和兩種類型雙層乳液的D3,2顯著受PGA水平的影響(p<0.05)。不同添加順序并未影響平均液滴粒徑的變化趨勢(shì),但它們的D3,2遠(yuǎn)小于其各自的液滴的平均粒徑。

表1 不同濃度的玉米醇溶蛋白與PGA雙層乳液的D3,2Table 1 D3,2 of bilayer emulsions with two different adding sequences at different mass ratios of zein and PGA

圖2B和圖2D中分別顯示了Z/P和P/Z雙層乳液的液滴粒徑分布。zein乳液表現(xiàn)出較寬的粒徑分布單峰,這表明單獨(dú)用ZCP穩(wěn)定的Pickering乳液,粒徑不均勻。當(dāng)添加較低濃度PGA時(shí)(0.01%和0.05%),Z/P雙層乳液表現(xiàn)出大致均勻的粒徑分布和窄峰,這可能是由于在pH4.0時(shí),帶負(fù)電的PGA分子會(huì)與鄰近的帶正電荷的液滴相互作用,引起絮凝。隨著PGA濃度的升高,液滴的粒徑分布從窄單峰模式變?yōu)殡p峰模式,并且在0.1%和0.25%的PGA水平可以清楚地觀察到兩個(gè)疊加峰。這可能是由于PGA分子逐漸被液滴表面吸附,但仍不足以完全覆蓋液滴表面,從而產(chǎn)生不均勻粒徑的液滴。當(dāng)PGA濃度大于0.5%時(shí),液滴粒徑分布從雙峰再次變?yōu)閱畏?峰值逐漸下降。就P/Z雙層乳液而言,粒徑分布較為均勻,在低PGA濃度(0.01%和0.05%)下具有窄峰。在PGA存在下,雙層乳液中出現(xiàn)寬雙峰模式(0.1%)和兩個(gè)重疊峰(0.25%),隨著PGA含量增加到0.5%以上,液滴粒徑分布變?yōu)榻鼏畏?峰縱坐標(biāo)值逐漸減小。

2.3 雙層乳液的物理穩(wěn)定性分析

2.3.1 離心穩(wěn)定性分析 雙層乳液的離心穩(wěn)定性隨離心時(shí)間變化如圖3所示。如圖3A所示,zein乳液的離心過(guò)程中透光率呈不斷上升的趨勢(shì),且最終乳液透光率最大,乳液非常不穩(wěn)定。在低濃度PGA下,由于PGA不能完全覆蓋液滴,PGA的加入反而導(dǎo)致靜電斥力的下降而使液滴間絮凝。隨著PGA濃度的增加,穩(wěn)定性增強(qiáng),說(shuō)明吸附在液滴表面的PGA不斷增加,雖然0.5%PGA的Z/P雙層乳液的穩(wěn)定性仍然比zein乳液的穩(wěn)定性差,但當(dāng)PGA水平為0.75%時(shí),Z/P雙層乳液的穩(wěn)定性高于zein乳液,并且隨著PGA濃度的繼續(xù)升高,透光率的波動(dòng)逐漸平緩,說(shuō)明雙層乳液的物理穩(wěn)定性隨著PGA濃度的上升而不斷提高,這可能是由于Z/P雙層乳液液滴外層PGA的分子結(jié)構(gòu)更加靈活,可以滲透界面空隙中,提供靜電斥力和空間位阻,在大豆可溶性多糖和甜菜果膠對(duì)乳鐵蛋白包覆橙油雙層乳液實(shí)驗(yàn)[20]中也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。當(dāng)PGA濃度高于1.0%時(shí),分層速率有所降低但不顯著,說(shuō)明ZCP穩(wěn)定的液滴已經(jīng)完全被PGA分子覆蓋,并且由于水相中過(guò)量的PGA分子提高了相粘度,從而改善了Z/P雙層乳液的物理穩(wěn)定性,所以幾乎不會(huì)發(fā)生液滴的絮凝。

如圖3B所示,在相同PGA水平下,相比于Z/P雙層乳液,P/Z雙層乳液的透光率較小,乳液的乳化速率明顯增大,加入的陽(yáng)離子顆粒會(huì)與多個(gè)陰離子液滴結(jié)合,導(dǎo)致液滴絮凝。而當(dāng)PGA濃度升高至0.5%時(shí),P/Z雙層乳液比zein乳液和Z/P雙層乳液表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。并且隨著PGA濃度的逐漸增大,波動(dòng)極小的透光率可以反映出雙層乳液良好的物理穩(wěn)定性,說(shuō)明高濃度PGA的添加會(huì)降低初級(jí)乳液的液滴粒徑。在液滴表面被完全覆蓋之后,水相中過(guò)量的PGA分子將增加雙層乳液的粘度,由斯托克斯定律可知,乳液的物理穩(wěn)定性與乳液的粘度正相關(guān),穩(wěn)定性的提升可能是粘度升高的原因[21]。

圖3 不同濃度的Z/P雙層乳液(A)和P/Z雙層乳液(B)的透光率變化曲線Fig.3 Transmission profiles of ZCP/PGA bilayer emulsion(A) and PGA/ZCP bilayer emulsion(B) at different mass ratios of zein to PGA

2.3.2 貯藏穩(wěn)定性分析 圖4表示在25 ℃下貯藏一段時(shí)間后,zein乳液和與雙層乳液的粒徑和ζ電位變化。如圖4A所示,貯藏時(shí)間對(duì)不同PGA濃度的Z/P雙層乳液的液滴粒徑和ζ電位具有不同的影響。zein乳液液滴的粒徑和ζ電位變化最大,說(shuō)明僅由ZCP穩(wěn)定的Pickering乳液并不穩(wěn)定。而且zein乳液液滴粒徑和ζ電位的大幅波動(dòng),也表明ZCP在液滴表面發(fā)生反復(fù)的吸附和解吸,這可能是ZCP在界面的潤(rùn)濕性較差。低濃度PGA的Z/P雙層乳液,由于乳液的不穩(wěn)定性以及液滴的變形,從而導(dǎo)致液滴粒徑比zein乳液還要略微增加,ζ電位也有明顯波動(dòng)。隨著PGA濃度的不斷升高,Z/P雙層乳液的貯藏穩(wěn)定性顯著提高(p<0.05),并且由于稠化界面和高粘度連續(xù)相的存在,乳液液滴遷移率降低,貯藏不穩(wěn)定性下降[22]。

圖4 ZCP/PGA雙層乳液(A)和PGA/ZCP雙層乳液(B)在不同貯藏時(shí)間后的液滴粒徑和ζ電位Fig.4 Droplet size and Zeta-potential of ZCP/PGA bilayer emulsion(A)and PGA/ZCP bilayer emulsion(B)after different storage times

如圖4B所示,貯藏時(shí)間對(duì)不同PGA濃度的P/Z雙層乳液的液滴粒徑和ζ電位也有不同的影響。當(dāng)PGA濃度較低時(shí),雙層乳液并不穩(wěn)定,貯藏過(guò)程中液滴粒徑和ζ電位有明顯變化,削弱的靜電斥力促進(jìn)了乳液的絮凝。而當(dāng)PGA濃度逐漸增加,PGA分子可以完全覆蓋液滴表面并作為內(nèi)層穩(wěn)定雙層乳液,同時(shí),存在于連續(xù)相中的PGA分子,可以提高乳液的黏度,并在一定程度上相互交聯(lián)形成致密的雙層膜,從而提高乳液的貯藏穩(wěn)定性[23]。

貯藏時(shí)間對(duì)zein乳液和雙層乳液的外觀影響如圖5所示。25 ℃貯藏7 d后,zein乳液出現(xiàn)明顯的分層和油相釋放,這可能是由于乳液在貯藏期間因重力分離作用,ZCP從液滴界面分離導(dǎo)致了ZCP的明顯沉降。PGA濃度較低時(shí)(≤0.05%),貯藏7 d后,兩類雙層乳液均逐漸發(fā)生解離分層,并出現(xiàn)油相釋放現(xiàn)象,這是由于顆粒間斥力不足從而導(dǎo)致了液滴的聚結(jié)。隨著PGA含量的逐漸增加,水層厚度與乳液總高度的比值不斷降低。當(dāng)PGA濃度達(dá)到1.0%時(shí),ZCP和PGA共同穩(wěn)定的雙層乳液相對(duì)穩(wěn)定,沒(méi)有分層現(xiàn)象出現(xiàn),PGA濃度的增加改善了雙層乳液的貯藏穩(wěn)定性[23]。

圖5 不同貯藏時(shí)間對(duì)zein乳液、ZCP/PGA雙層乳液和PGA/ZCP雙層乳液外觀的影響Fig.5 Effect of different storage times on visual appearance of zein-based Pickering emulsion, ZCP/PGA bilayer emulsion and PGA/ZCP bilayer emulsion

貯藏28 d后,低濃度PGA的雙層乳液中出現(xiàn)更加明顯的液滴聚集,具有較少PGA分子附著的界面不能提供足夠的靜電斥力來(lái)保證乳液的長(zhǎng)期貯藏穩(wěn)定性。此外,重力作用和粒子的布朗運(yùn)動(dòng)也導(dǎo)致了乳液的聚結(jié),從而導(dǎo)致雙層乳液的水層厚度與乳液總高度的比值均升高。隨著PGA的濃度升高,雙層乳液的水層厚度逐漸降低,這說(shuō)明高濃度的PGA為雙層乳液液滴提供了充足的靜電斥力和穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu),提高了乳液的長(zhǎng)期貯藏穩(wěn)定性[23]。

2.4 雙層乳液的空間形態(tài)觀察

2.4.1 光學(xué)顯微鏡觀察 圖6顯示了不同類型乳液的光學(xué)顯微鏡照片。可以觀察到zein乳液并不穩(wěn)定,并在幾分鐘快速聚結(jié),這可能是由于ZCP顆粒間的疏水吸引[24]。加入PGA后,乳液的物理穩(wěn)定性大大提高,且PGA濃度越高,液滴粒徑越小,乳液越均勻。所以,由于先加入ZCP的Pickering乳液中的液滴易于聚結(jié),所以可以通過(guò)LBL技術(shù)對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定。

圖6 ZCP和PGA共穩(wěn)定的雙層乳液和zein乳液的光學(xué)顯微鏡圖像Fig.6 Optical microscope images of zein-based Pickering emulsion and bilayer emulsions co-stabilized by ZCP and PGA

當(dāng)PGA濃度從0.1%增加到1.5%,雙層乳液液滴的粒徑減小,并且逐漸形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),說(shuō)明具有較高濃度PGA的雙層乳液中PGA所占體積分?jǐn)?shù)也較大,因此乳液液滴彼此非常緊密并且具備較高的彈性模量[25]。乳化層中液滴的緊密堆積以及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成,導(dǎo)致了凝膠狀流變特性的體現(xiàn)[26]。

2.4.2 CLSM觀察 使用CLSM來(lái)觀察由ZCP和PGA穩(wěn)定的雙層乳液的界面結(jié)構(gòu),如圖7所示,MCT為紅色,ZCP為藍(lán)色。圖7A顯示了zein乳液的微觀結(jié)構(gòu),液滴不均勻且較大,液滴有明顯的聚結(jié)現(xiàn)象,這種現(xiàn)象是由于玉米醇溶蛋白的潤(rùn)濕性不足,以及ZCP之間的疏水效應(yīng)而導(dǎo)致了液滴的聚結(jié),說(shuō)明了zein乳液的不穩(wěn)定性。相反,可以在圖7B在觀察到Z/P雙層乳液中均勻的液滴和外層蛋白網(wǎng)絡(luò)。說(shuō)明外層PGA的添加促進(jìn)了更加緊密的界面的形成。就P/Z雙層乳液而言,雖然其液滴大小也較為均勻,但并沒(méi)有形成連續(xù)的蛋白網(wǎng)絡(luò)(圖7C)。PGA作為內(nèi)層,雖然減小了液滴的粒徑,但也增加了比表面積,導(dǎo)致ZCP外層的不完全覆蓋。

圖7 由zein(A)、ZCP/PGA雙層乳液(B)(1.5% w/v)和PGA/ZCP雙層乳液(C)(1.5%,w/v)穩(wěn)定的Pickering乳液的CLSM圖像Fig.7 CLSM image of Pickering emulsion stabilized by zein(A),ZCP/PGA double emulsion(B) (1.5% w/v)and PGA/ZCP double emulsion(C)(1.5%,w/v)

3 結(jié)論

在本研究中,采用LBL靜電沉積技術(shù)制備了ZCP和PGA穩(wěn)定的新型雙層乳液。與僅由zein穩(wěn)定的Pickering乳液相比,雙層乳液因其獨(dú)特的顆粒-多糖雙層結(jié)構(gòu)而具有更好的穩(wěn)定性,不易分層和聚結(jié)。隨液滴表面PGA的濃度的增大,雙層乳液液滴的粒徑逐漸減小,形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),雙層乳液的穩(wěn)定性不斷提高。不同的加入順序?qū)﹄p層乳液的微觀結(jié)構(gòu)有重要影響,PGA具有更好的乳化性,隨PGA濃度的升高,先加入PGA的雙層乳液具有更小的液滴粒徑。但是,ZCP和PGA在液滴界面中的共存,阻礙了雙層乳液的穩(wěn)定和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成,從而使雙層乳液具有凝膠性質(zhì)。本文將界面工程技術(shù)、Pickering乳液和雙層乳液三者結(jié)合,設(shè)計(jì)了由ZCP和PGA穩(wěn)定的雙層乳液?？梢灶A(yù)想,這種由顆粒和乳化劑共同穩(wěn)定的新型雙層乳液會(huì)因其較好的穩(wěn)定性和可控的界面性質(zhì)在生物活性組分的遞送方面展現(xiàn)出巨大的優(yōu)越性。