張莉敏,陳宇峰,戰(zhàn) 瑩,武曉丹,周玉虹

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院，上海 200050；2.原沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016；3.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

高血壓可分為原發(fā)性高血壓及繼發(fā)性高血壓兩大類。原發(fā)性高血壓占高血壓患者的95%以上，其病因尚未闡明，目前認(rèn)為是在一定的遺傳背景下由于多種后天環(huán)境因素作用使正常血壓調(diào)節(jié)機(jī)制失代償所致。長期高血壓可成為多種心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，并影響重要臟器如心、腦、腎的功能，最終可導(dǎo)致這些器官功能衰竭[1]。腸道微菌群在維持腸道和全身免疫系統(tǒng)的功能中起到重要作用。最近有研究表明腸道菌群失調(diào)與肥胖、糖尿病、冠心病和代謝綜合征相關(guān)。本課題前期應(yīng)用自發(fā)性高血壓大鼠模型(SHR)進(jìn)行的合生元對(duì)血壓影響的相關(guān)研究認(rèn)為，與模型組相比，合生元可顯著降低治療組第4～7周SHR的收縮壓(SBP)；撤出合生元后，治療組SHR的SBP迅速反彈，并且逐漸與模型組的SBP相當(dāng)；然而，在重新給予合生元后，SBP開始逐漸減低，由此可發(fā)現(xiàn)給予自發(fā)性高血壓大鼠合生元制劑能夠有效降低SBP，但對(duì)其降壓機(jī)制尚不清楚。本研究應(yīng)用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)研究不同血壓狀態(tài)的大鼠回腸段代謝物的差異，揭示高血壓狀態(tài)的相關(guān)代謝標(biāo)志物，從表觀水平探索調(diào)節(jié)腸道菌群可使血壓下降的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取14只6周齡雄性SHR和7只Wistar Kyoto大鼠(WKY)，均購自北京維通利華有限公司，體重(160±20)g，環(huán)境溫度(21±1)℃，建立12 h光照/ 12 h黑暗周期，動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物制備和實(shí)驗(yàn)分組

所有大鼠被隨機(jī)分為3組：WKY對(duì)照組(n=7)，SHR模型組(n=7)和SHR治療組(n=7)。 SHR治療組口服冷凍干燥的合生元制劑，劑量為2.5 g/kg，其中包含2.5×109CFU乳酸雙歧桿菌、2.5×109CFU嗜酸乳桿菌(上海潤盈生物工程有限公司)、0.3 g低聚木糖和適量麥芽糖糊精。 WKY對(duì)照組和SHR模型組口服相同劑量麥芽糊精(山東龍力生物科技有限公司)。所有大鼠每日服用2次，連續(xù)服用7周。

2 方法

2.1 組織提取

第7周給藥后24 h，所有大鼠用7.5%水合氯醛(0.3 ml/100 g)進(jìn)行腹腔麻醉，碘伏消毒后打開腹腔，分離大鼠的回腸部分，在無菌PBS(0.1 mmol/L，pH7.2)中分離并輕輕除去腸道內(nèi)容物后，稱重約50 mg的回腸組織，置于凍存管內(nèi)，用液氮迅速冷凍。

2.2 代謝組學(xué)分析

將組織置于1 ml甲醇中，以70 Hz勻漿2 min。然后，混合物在4 ℃以13 000 r/min離心15 min。將200 μl上清液加入樣品瓶中，用于基于UHPLC-Q-TOF / MS平臺(tái)的代謝組學(xué)分析。LC-MS分析使用Agilent 1290 Infinity LC系統(tǒng)與Agilent 6538 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) 質(zhì)譜儀(Agilent,USA)偶聯(lián)。使用Waters XSelect HSS T3分析柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm，Waters，Milford，MA)在25℃下進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A)和0.1%甲酸(B)改性的乙腈。流速為0.4 ml/min。優(yōu)化的梯度洗脫條件：0～2 min：5%B，2～13 min：5%～95%B，13～15 min：95%B。質(zhì)譜以正離子和負(fù)離子2種模式運(yùn)行。優(yōu)化的毛細(xì)管電壓參數(shù)：正極模式下4 kV，負(fù)極模式下3.5 kV。干燥氣流速：10 L/min。干燥氣溫度：325 ℃。噴霧氣壓：20 psig。破裂電壓：120 V。擋熱電壓：45 V。數(shù)據(jù)采集范圍質(zhì)荷比：100～1 100 m/z。正離子模式中的參考離子：121.050 9～922.009 8，負(fù)離子模式的參考離子：112.985 6～1033.988 1。

2.3 數(shù)據(jù)處理

使用Agilent MassHunter分析軟件將LC-MS原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為通用數(shù)據(jù)格式(.mzdata)文件。使用XCMS軟件包(http://bioconductor.org/biocLite.R)進(jìn)行峰值提取，比對(duì)和整合，以在R平臺(tái)中生成可視數(shù)據(jù)矩陣。然后，將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P程序(Umetrics，瑞典)進(jìn)行重量歸一化后的多變量統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

偏最小二乘法-判別式分析(PLS-DA)是一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，用于對(duì)照組、模型組和治療組的可視化趨勢(shì)分析。如圖1A、1B中ESI陽性模式和陰性模式的PLS-DA得分圖所示，對(duì)照組在第一主成分中模型組和治療組有較明顯的區(qū)分趨勢(shì)，模型組和治療組聚集在一起，沒有明顯的區(qū)分趨勢(shì)，說明模型組的代謝譜與對(duì)照組相比，明顯受到干擾，且治療組的代謝譜與模型組相似。

采用PLS-DA進(jìn)一步篩選模型組和對(duì)照組之間的不同代謝物。圖1C、1D顯示模型組與對(duì)照組有明顯的區(qū)分趨勢(shì)。當(dāng)計(jì)算2個(gè)成分時(shí)，累積R2X、R2Y和Q2分別為正模式下的0.419、0.937、0.693，而負(fù)模式下累計(jì)R2X、R2Y和Q2分別為0.565、0.942、0.826。這些結(jié)果表明PLS-DA模型具有良好的擬合度及預(yù)測(cè)能力用以篩選組間差異性變量。PLS-DA模式的載荷圖(圖1E、1F)可用于識(shí)別離子以區(qū)分這些組，其中遠(yuǎn)離原點(diǎn)的點(diǎn)被認(rèn)為對(duì)組間差異貢獻(xiàn)度大。VIP值反映了變量在差異中的重要性，大于1.0的代謝物被認(rèn)為是差異代謝物。然后進(jìn)行單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)以評(píng)估3組的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。最后，確定了對(duì)照組和模型組之間具有顯著差異的27種代謝物。不同的代謝物詳見表1。此外，在這些代謝物中，與模型組相比，治療組中的溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)和磷脂酰膽堿(PC)被顯著重新調(diào)節(jié)。

圖1 對(duì)照組、模型組和治療組的多變量統(tǒng)計(jì)分析圖

序號(hào)質(zhì)荷比(m/z)保留時(shí)間(t/min)VIP值倍數(shù)(M/C)P值(M/C)倍數(shù)(T/M)P值(T/M)粒子模式分子式代謝物名稱相關(guān)途徑1259.0230.731.741.500.00510.970.9328[M-H]-C6H13O9PD-Glucose 6-phosphateinositol phosphate metabolism2167.0200.882.410.790.02951.160.2239[M-H]-C5H4N4O3uric acidpurine metabolism 3169.0351.001.400.740.01201.050.8666[M+H]+C5H4N4O3uric acidpurine metabolism 4133.0321.001.491.270.04391.040.8597[M+H]+C5H8O2STHTC—5346.0551.021.022.350.00151.150.5178[M-H]-C10H14N5O7Padenosine monophosphatecAMP signaling pathway6153.0401.032.013.900.03180.530.2117[M+H]+C5H4N4O2xanthinepurine metabolism7318.3009.311.171.950.04910.560.0763[M+H]+C18H39NO3phytosphingosinesphingolipid metabolism8526.29410.161.031.410.00220.890.2746[M+H]+C27H44NO7PlysoPE(22∶6/0∶0)glycerophospholipid metabolism9502.29310.171.791.390.00130.810.0228[M+H]+C25H44NO7PlysoPE(20∶4/0∶0)glycerophospholipid metabolism10506.36010.551.071.440.04190.980.9866[M+H]+C26H52NO6PC-8 Ceramide-1-phosphatesphingolipid metabolism11526.35110.873.930.460.00141.001.0000[M+FA-H]-C24H52NO6Plyso-PAF C-16glycerophospholipid metabolism12917.62810.891.720.420.00091.300.5811[M-H]-C49H91O13PPI(18∶0/22∶2)glycerophospholipid metabolism

(續(xù)表1)

4 討論

目前多項(xiàng)對(duì)原發(fā)性高血壓發(fā)病機(jī)制的研究表明其不僅與血流動(dòng)力學(xué)異常有關(guān)，也與人體生化代謝紊亂密切相關(guān)，大部分患者常伴有糖代謝和血脂代謝異?，F(xiàn)象，原發(fā)性高血壓與生化代謝異常等危險(xiǎn)因素相互協(xié)同、共同導(dǎo)致心血管系統(tǒng)的損害，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。一系列臨床研究評(píng)估了腸道菌群對(duì)血壓的影響。一項(xiàng)包含了9個(gè)臨床試驗(yàn)在內(nèi)的 Meta分析表明，每天攝入一定量益生菌的人群血壓顯著降低，表明腸道菌群對(duì)維持血壓穩(wěn)定起著重要作用[3]。代謝組學(xué)是指通過核磁共振、色譜、質(zhì)譜等技術(shù)手段，定性和定量分析各種代謝路徑的小分子代謝物[4]，用以分析整體的生物學(xué)狀況和基因功能調(diào)節(jié)，探尋生命活動(dòng)的整體代謝狀況，從而更好地理解生命活動(dòng)規(guī)律[5]。目前對(duì)于高血壓代謝組學(xué)的研究主要集中在血液代謝組學(xué)和尿液代謝組學(xué)的研究，表明高血壓患者氨基酸和脂肪酸代謝紊亂失衡[6-8]。本實(shí)驗(yàn)通過研究自發(fā)性高血壓大鼠及使用合生元制劑治療后大鼠回腸段代謝產(chǎn)物異常來揭示合生元制劑治療原發(fā)性高血壓的可能機(jī)制。

代謝組學(xué)結(jié)果顯示，治療組回腸段LysoPE和PC水平明顯高于模型組。LysoPE是磷脂酰乙醇胺(PE)的分解產(chǎn)物，存在于所有生物的細(xì)胞中，是細(xì)胞膜的微量成分，在細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他酶的活化中起作用[7]。PC在自然界中無處不在，是細(xì)胞膜脂雙層結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組成部分，也涉及新陳代謝和信號(hào)傳導(dǎo)[8]。PC可以通過3種不同的途徑合成。一是膽堿首先通過磷酸化激活，然后在連接磷脂酸之前通過與CDP偶聯(lián)來激活；二是通過將膽堿加入CDP活化的1,2-二酰甘油來合成；第3條途徑是將PS或PE轉(zhuǎn)換為PC。有文獻(xiàn)報(bào)道LysoPE和PC可通過腸道細(xì)菌發(fā)酵飲食及其代謝產(chǎn)物(如游離脂肪酸)，特異性激活PPAR途徑并促進(jìn)PPARs的表達(dá)[9]。因此，合生元制劑可以通過改變腸道微生物群的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)PPAR信號(hào)通路，從而激活PPARβ和γ在回腸節(jié)段中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而改善自發(fā)性高血壓狀態(tài)。