王志君，楊云云，張文靜，王學(xué)彬，宋洪杰，王 卓

(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

伏立康唑(voriconazole)為三唑類廣譜抗真菌藥，2004年被FDA批準(zhǔn)為曲霉菌或念珠菌血癥的首選藥物。其抑制麥角甾醇的合成，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性異常，促使真菌細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗真菌效應(yīng)[1]。與其他三唑類抗真菌藥相比，伏立康唑是一種耐受性良好的藥物，但有肝毒性、神經(jīng)毒性，同時(shí)伏立康唑的藥動(dòng)學(xué)個(gè)體間差異很大，主要原因是人體內(nèi)的代謝酶CYP2C19具有遺傳多態(tài)性，特別是亞洲人中弱代謝者的發(fā)生率高達(dá)15%～20%，同時(shí)患者自身的疾病狀態(tài)或合并用藥可能增加伏立康唑代謝的差異[2-7]。因此，對(duì)伏立康唑及其主要代謝物伏立康唑氮氧化物進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)具有臨床意義。目前，用于伏立康唑血藥濃度測(cè)定的方法主要包括微生物檢測(cè)法、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]，考慮到臨床應(yīng)用的實(shí)用性和可行性，本研究建立了樣品沉淀蛋白，并用HPLC-UV測(cè)定的方法，使其具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的特點(diǎn)，并可以同時(shí)測(cè)定伏立康唑及其氮氧化物，以便用于日常治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)和個(gè)體化給藥調(diào)整。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(包括SPD-20A紫外檢測(cè)器、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱日本島津公司)；C18-AR色譜柱(ACE 150 mm×4.6 mm，柱號(hào)：V12-6682)；XW-80A渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；離心機(jī)(Eppendorf AG 22331 Hamburg 5452ZR858343)；SQP電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；DL-180A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；1.5 ml微型離心管(EP管)。

1.2 藥品與試劑

伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品食品檢定研究院，批號(hào)：100862-201402，含量 99.2%)；罌粟堿(Cayman CHEMICAL 公司，批號(hào)：0476735-1，含量≥98%)；伏立康唑氮氧化物(Toronto Research Chemicals公司，批號(hào)：7-dpm-64-3，含量97%)；甲醇、乙腈(色譜純)、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉(分析純，上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司)；空白人血漿(長(zhǎng)海醫(yī)院血庫(kù))。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

LcSolution版本1.26 SP1(日本島津公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱ACE 5 C18-AR(150 mm×4.6 mm，柱號(hào)：V12-6682)，以0.025 mol/L磷酸二氫鈉(含三乙胺400 μl/L，用0.25 mol/L的氫氧化鈉調(diào)至pH為7.0)-乙腈(67∶33)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)：255、276 nm(雙波長(zhǎng)檢測(cè))，流速：1.0 ml/min，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4 ℃，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液

精密稱取伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品、伏立康唑氮氧化物標(biāo)準(zhǔn)品適量，置50 ml棕色量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即得400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，置2～8 ℃冰箱冷藏保存，備用。

2.2.2內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取罌粟堿適量置100 ml棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，得濃度為100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液5 ml置100 ml棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得濃度為5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，置2～8 ℃冰箱冷藏保存，備用。

2.3 血漿樣品的預(yù)處理

取血漿0.3 ml于1.5 ml的EP管中，再加乙腈至1.2 ml，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min離心15 min，取上清液20 μl進(jìn)樣分析。

2.4 方法專屬性試驗(yàn)

分別取空白血漿、加入內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿、加入伏立康唑和伏立康唑氮氧化物及內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿、使用伏立康唑的患者血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行前處理，按“2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)伏立康唑氮氧化物、罌粟堿、伏立康唑保留時(shí)間分別為4.5、11.3、13.7 min，各峰分離度均大于2，理論塔板數(shù)均大于1 000，空白血漿和流動(dòng)相中干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，結(jié)果見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

取空白血漿及伏立康唑和伏立康唑氮氧化物儲(chǔ)備液以及罌粟堿儲(chǔ)備液，將伏立康唑和伏立康唑氮氧化物濃度分別配制為0.5、1、2、5、10、15、20 μg/m1，內(nèi)標(biāo)罌粟堿濃度調(diào)為3.75 μg/m1的混合血漿樣品。按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品預(yù)處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以伏立康唑氮氧化物和罌粟堿面積的比值(F1)對(duì)血漿濃度(C1)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重系數(shù)：1/C)，得回歸方程為：F1=0.111 1 C1+0.020 0，r=0.999 5；以伏立康唑和罌粟堿面積的比值(F2)對(duì)血漿濃度(C2)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重系數(shù)：1/C)，得回歸方程為：F2=0.070 74C2-0.038 60，r=0.999 5。結(jié)果表明，伏立康唑和伏立康唑氮氧化物在0.5～20.0 μg/m1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。定量限濃度為0.2 μg/ml(S/N>10)。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

2.6.1批內(nèi)回收率和精密度

分別配制定量下限及低、中、高濃度樣品(0.5、1、5、15 μg/m1)的質(zhì)控(QC)血漿樣品，每個(gè)濃度取5個(gè)樣本，按“2.3”項(xiàng)方法操作，測(cè)定。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定QC樣品的相對(duì)回收率，伏立康唑：101.3%、103.8%、94.2%、91.7%(RSD分別為6.2%、4.4%、4.7%、1.4%，n=5)，伏立康唑氮氧化物：106.8%、100.1%、94.3%、91.6%(RSD分別為6.2%、4.8%、4.7%、2.1%，n=5)。

2.6.2批間回收率和精密度

分別配制3批的定量下限及低、中、高濃度樣品(0.5、1、5、15 μg/m1)的QC血漿樣品，每個(gè)濃度取5個(gè)樣本，按“2.3”項(xiàng)方法操作，分3 d進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果的峰面積代入相應(yīng)的當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品的回收率，伏立康唑：97.9%、99.6%、102.6%、101.6%(RSD分別為9.2%、5.9%、3.3%、3.6%)，伏立康唑氮氧化物：100.9%、100.0%、97.3%、98.7%(RSD分別為9.3%、6.4%、5.9%、6.7%)。

圖1 伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的專屬性色譜圖 A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)；C.空白血漿+伏立康唑?qū)φ掌?伏立康唑氮氧化物對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)；D.患者血漿+內(nèi)標(biāo) 1.伏立康唑氮氧化物；2.伏立康唑；3.罌粟堿

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7.1工作溶液

取伏立康唑和伏立康唑氮氧化物乙腈溶液，配成0.5、2.0、15 μg/m1濃度系列，以及罌粟堿乙腈溶液1.0 μg/m1,按“2.1”項(xiàng)下方法處理進(jìn)樣，分別于日內(nèi)和日間進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)和日間誤差。結(jié)果顯示,伏立康唑日內(nèi)(0、2、4、6、8 h)和日間(3 d)測(cè)得濃度的RSD分別為1.6%和1.2%；伏立康唑氮氧化物日內(nèi)(0、2、4、6、8 h)和日間(3 d)測(cè)得濃度RSD分別為1.5%和2.0%；罌粟堿測(cè)得濃度RSD為1.5%。伏立康唑、罌粟堿和伏立康唑氮氧化物的乙腈溶液3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.2血漿樣品

制備伏立康唑和伏立康唑氮氧化物低、高濃度(含伏立康唑氮氧化物和罌粟堿)的血漿樣品，分別進(jìn)行：①反復(fù)3次凍融 (-20～25℃)穩(wěn)定性試驗(yàn)；②含藥血漿樣品(-20℃)放置1個(gè)月穩(wěn)定性試驗(yàn)；③血漿樣品處理后48 h穩(wěn)定性試驗(yàn)；④血漿樣品自動(dòng)進(jìn)樣器中(4℃)放置24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)；⑤樣品常溫放置24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“2.3”項(xiàng)方法操作，每個(gè)濃度取5個(gè)樣本，測(cè)定結(jié)果的峰面積代入相應(yīng)的當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果由表1可見：血漿樣品反復(fù)凍融3次后穩(wěn)定性良好；血漿樣品在-20℃條件下至少可以保存1個(gè)月；血漿樣品處理后可在室溫下保存48 h；處理后的血漿樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中(4℃)、室溫中至少可保存48 h。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5，%)

2.8 臨床標(biāo)本測(cè)定應(yīng)用

取血液科服用伏立康唑(同時(shí)服用環(huán)孢素A)的臨床患者的血液樣品(采用EDTA抗凝管，取血量2～3 m1)，3 000 r/min離心5 min，取血漿300 μl，加5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液至1 200 μl，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min離心15 min，取上清液20 μl進(jìn)樣分析，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。10例患者中，伏立康唑血藥濃度在0.49～5.2 μg/m1；伏立康唑氮氧化物血藥濃度在0.43～5.5 μg/m1；伏立康唑血藥濃度/伏立康唑氮氧化物血藥濃度的比值在0.63～20之間。在本研究過程中1名患者使用伏立康唑后，臨床醫(yī)生根據(jù)其血液樣品監(jiān)測(cè)結(jié)果對(duì)患者進(jìn)行2次給藥方案調(diào)整，最終使伏立康唑血藥谷濃度在有效濃度范圍內(nèi)(1～5 μg/m1)，具體監(jiān)測(cè)結(jié)果見表2。在此過程中，通過TDM監(jiān)測(cè)，臨床醫(yī)生及時(shí)調(diào)整給藥方案，避免低效治療并降低發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

表2 患者血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果(ρB/μg·ml-1)

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)成分的選擇

伏立康唑主要在肝臟通過CYP450的同工酶CYP2C19代謝，主要代謝產(chǎn)物為無抗菌活性的伏立康唑氮氧化物，血漿中約占72%。CYP2C19酶呈基因多態(tài)性，其在不同人種、不同基因型患者的伏立康唑代謝具有明顯差異。在給予相同劑量伏立康唑后，因代謝的明顯差異，導(dǎo)致體內(nèi)血藥濃度變化較為明顯，從而引起治療效果不佳或者不良反應(yīng)增加。本研究擬考察伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的濃度來提高治療效果，從而達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的。同時(shí)為下一步擬合CYP2C19酶多態(tài)性及伏立康唑、伏立康唑氮氧化物濃度的關(guān)系提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

伏立康唑是三唑類化合物，采用甲醇-乙腈溶劑系統(tǒng)流動(dòng)相，干擾現(xiàn)象比較嚴(yán)重，在流動(dòng)相中加入適量鹽和三乙胺可抑制其拖尾，改善峰形。本研究曾分別考察了加入不同比例三乙胺、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值對(duì)峰形的影響。發(fā)現(xiàn)0.025 mol/L磷酸二氫鈉(三乙胺400 μl/L，用0.25 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH=7.0)-乙腈(67∶33)作為流動(dòng)相時(shí)，峰形對(duì)稱，分離效果較好，檢測(cè)時(shí)間適宜，從而選擇其作為流動(dòng)相。

3.3 提取溶媒的選擇

本研究采用以乙腈為沉淀劑的蛋白沉淀法處理血液樣品。采用此方法時(shí)，干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，按照《中國(guó)藥典》四部通則9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，可作為提取方法。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

255 nm、276 nm分別為伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的最大吸收波長(zhǎng)，在測(cè)定部分患者血液樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)：檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm時(shí)，伏立康唑氮氧化物的干擾小，測(cè)定準(zhǔn)確性好；檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm時(shí)，伏立康唑的響應(yīng)值高，精密性好，所以選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)。

3.5 臨床標(biāo)本的測(cè)定

由于血液科用藥品種多，用藥方案多變，本研究采用常見的環(huán)孢素A+伏立康唑的患者作為對(duì)象，文獻(xiàn)報(bào)道[12]：環(huán)孢素A和伏立康唑具有相互作用，伏立康唑影響環(huán)孢素A的血藥濃度，同時(shí)兩者均有肝毒性，本研究擬通過監(jiān)測(cè)患者(同時(shí)使用環(huán)孢素A藥物)伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的血藥濃度，為個(gè)體化給藥方案提供數(shù)據(jù)支持，為降低血液科患者這一特殊人群發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)做前期的研究準(zhǔn)備工作。