趙 輝，章越凡，李鐵軍,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 ，安徽 合肥 230012；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海200433；3.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院藥劑科，上海200125)

缺血性卒中是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，是導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的天然免疫效應(yīng)細(xì)胞，參與一系列神經(jīng)退行性病變[2]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子以及細(xì)胞毒性因子(如NO和ROS)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[3]。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞激活誘發(fā)的炎癥反應(yīng)參與了腦卒中的損傷過程[4]。二氯乙酸鈉(DCA)是一種可口服吸收的小分子化合物，臨床上可用于治療線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(MELAS)綜合征、先天性乳酸性酸中毒和其他疾病的兒童[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，DCA通過抑制 PDK2和減少冠狀動(dòng)脈肌內(nèi)膜增生而起到潛在的血管保護(hù)作用[6]，并促進(jìn)腦缺血后的腦再生[7]。筆者使用 BV2細(xì)胞的OGD損傷模型，探討DCA治療是否具有保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

BV2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中(37℃，5% CO2)，每48 h更換培養(yǎng)基并傳代。

1.2 藥物與試劑

二氯乙酸鈉(DCA，TCI公司，貨號：D1719)； DMEM完全培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基 (Gibco 公司)；凋亡檢測試劑盒、NO試劑盒、ROS試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司) ；抗體:β-actin， SAPK/JNK， P-SAPK/JNK， I-κB， P-I-κB， stat3， P-stat3， NF-κB， P-NF-κB (CST公司)。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司)；高速水平離心機(jī) (Eppendorf公司)；缺氧裝置(Billups-Rothenberg 公司)；酶標(biāo)儀(Thermo 公司)；流式細(xì)胞儀 (BD Biosciences公司); Western blot 圖像掃描儀(Odyssey公司)。

2 方法

2.1 OGD 模型的建立

參考文獻(xiàn)[8]建立體外模擬腦缺血模型，即OGD模型，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳宰餍薷?。?xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞貼壁后，對照組更換為不含血清的DMEM，OGD組用無糖 DMEM培養(yǎng)基，DCA給藥組更換為加有 DCA的無糖 DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中適應(yīng)1 h，然后置于缺氧裝置中，通入混合氣(95%N2、5% CO2)密閉后，置于培養(yǎng)箱中，1～4 h后取出細(xì)胞，做后續(xù)處理。

2.2 CCK8法測定細(xì)胞活力

將BV2細(xì)胞以1.2×105個(gè)/ml的密度接種于96孔板中，按照“2.1”項(xiàng)下操作方法，在 OGD之前將給藥組更換為加入不同濃度的二氯乙酸鈉( 1、10、100、400、800 μmol/L)適應(yīng)性培養(yǎng)1 h，OGD組和給藥組置于缺氧裝置中OGD 4 h后，采用 CCK-8法檢測細(xì)胞活力， 用酶標(biāo)儀測定450 nm處上述不同濃度組的吸光度值(A)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

以1.0×106個(gè)/ml的密度將 BV2細(xì)胞接種于6孔板中，分為對照組、OGD組和給藥組，細(xì)胞貼壁后，OGD組更換為無糖 DMEM培養(yǎng)基，給藥組更換為加有DCA的無糖 DMEM培養(yǎng)基，適應(yīng)性培養(yǎng)1 h后，OGD組和給藥組置于缺氧裝置中OGD 4 h，之后分別收集各組細(xì)胞，使用凋亡試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行處理，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的表達(dá)

以1.0×106個(gè)/ml的密度將 BV2細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，OGD組更換為無糖 DMEM培養(yǎng)基，給藥組更換為加有DCA的無糖 DMEM培養(yǎng)基，適應(yīng)性培養(yǎng)1 h后，OGD組和給藥組置于缺氧裝置中OGD 4 h，之后分別收集各組細(xì)胞，按照相應(yīng)的ROS和NO檢測試劑盒說明書對細(xì)胞進(jìn)行前處理，流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS和NO含量。

2.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá)

以1.0×106個(gè)/ ml的密度將 BV2細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，OGD組更換為無糖 DMEM培養(yǎng)基，給藥組更換為加有DCA的無糖 DMEM培養(yǎng)基，然后 OGD 4 h， 結(jié)束后分別收集各組細(xì)胞，置于 預(yù)冷的RIPA裂解液中裂解30 min，離心，取上清液。BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，將硝酸纖維素膜用含有5%脫脂奶粉的 Tris緩沖液封閉2 h， 4 ℃環(huán)境下一抗孵育過夜，棄去一抗，漂洗3次(5 min/次)，室溫下與二抗孵育1 h后洗滌膜。使用Western blot 圖像掃描儀進(jìn)行掃描統(tǒng)計(jì)。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。t檢驗(yàn)用于組間比較，P<0.05時(shí)表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DCA對OGD誘導(dǎo)的 BV2 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

OGD 1～4 h后，細(xì)胞生存率顯著降低，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，以 OGD 4 h為最佳時(shí)間(圖1A)。DCA濃度為400 μmol/L可顯著提高 OGD 4 h后的細(xì)胞活力(P<0.01)，因此選擇 OGD 4 h，給藥濃度400 μmol/ L作為后續(xù)試驗(yàn)條件(圖1B)。

圖1 DCA對OGD誘導(dǎo)BV2細(xì)胞損傷的影響 A.不同的OGD時(shí)間；B.不同的DCA濃度(μmol/L)*P<0.05,**P<0.01,與對照組比較；##P<0.01,與OGD組比較

3.2 DCA降低OGD誘導(dǎo)的 BV2 細(xì)胞凋亡

為了考察DCA對 OGD 損傷的BV2細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示(圖2)，與對照組相比， OGD誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率增加，由對照組(2.62±0.22)%上升到(8.55±0.37)%(P<0.01)，而DCA可顯著減少細(xì)胞凋亡，凋亡率降至(3.95±0.16)% (P<0.01)。

3.3 DCA降低OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中ROS和NO的含量

與對照組相比， OGD提高了BV2細(xì)胞中ROS和NO的含量 (P<0.01); 而DCA可顯著降低BV2細(xì)胞內(nèi)ROS(P<0.01)和NO(P<0.05)的含量(圖3)。

3.4 DCA 對 NF-κB/STAT3信號通路的調(diào)節(jié)作用

NF-KB信號通路廣泛參與凋亡、炎癥反應(yīng)，因此本研究檢測了 DCA對該信號通路的影響。結(jié)果如圖4A和圖4B所示， OGD損傷后 P-NF-κB、 P-JNK及 P-I-κB的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)； DCA可顯著下調(diào) OGD誘導(dǎo)的P-NF-κB，P-JNK(P<0.05)及 P-I-κB蛋白的升高(P<0.01)。而 STAT3在腦卒中血管生成方面起到重要作用， OGD后 P-STAT3表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，而 DCA治療組 P-STAT3表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

圖2 DCA對OGD誘導(dǎo)的 BV2 細(xì)胞凋亡率的影響 A.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況；B.細(xì)胞凋亡比例 **P<0.01,與對照組比較；##P<0.01,與OGD組比較(n=3)

圖3 DCA對OGD誘導(dǎo)的 BV2 細(xì)胞內(nèi)ROS和NO含量的影響 A.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量；B.ROS含量統(tǒng)計(jì)圖；C.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)NO含量；D.NO含量統(tǒng)計(jì)圖**P<0.01,與對照組比較；#P<0.05,##P<0.01,與OGD組比較(n=3)

4 討論

卒中是由血管阻塞或出血引起的腦血液循環(huán)障礙并誘發(fā)腦神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，致死率較高，其病理機(jī)制復(fù)雜， 目前仍缺乏有效的治療方法，而炎癥反應(yīng)已被證實(shí)為卒中誘發(fā)損傷中一個(gè)關(guān)鍵影響因素。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是誘發(fā)卒中炎癥反應(yīng)的主要原因之一[9]，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)及功能上會(huì)發(fā)生明顯改變，并在炎癥部位產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒素和促炎癥介質(zhì)， 從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，并且會(huì)釋放促炎因子和細(xì)胞毒性因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、NO和ROS[4]。因此，降低小膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及抑制其細(xì)胞毒性因子的釋放對神經(jīng)元的保護(hù)具有重要作用。

圖4 DCA 對OGD誘導(dǎo)下BV2細(xì)胞 NF-κB/STAT3通路的影響 A.Western blotting檢測JNK、NF-κB、I-κB、STAT3及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平；B.p-JNK/JNK比值；p-NF-κB/NF-κB比值；p-I-κB/I-κB比值；p-STAT3/STAT3比值**P<0.01,與對照組比較；#P<0.05,##P<0.01,與OGD組比較(n=3)

最新研究表明， DCA在血管保護(hù)和促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)中起著重要作用[6]，可以改善動(dòng)脈粥樣硬化患者的血管鈣化[10]。然而，DCA對小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的炎癥反應(yīng)的作用尚無研究報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)研究了DCA對OGD誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的抑制作用，并初步探討其可能的機(jī)制。首先建立 OGD損傷BV2細(xì)胞模型，同時(shí)加入不同濃度的DCA進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DCA可劑量依賴性地抑制 OGD介導(dǎo)的BV2細(xì)胞損傷，并且當(dāng) DCA濃度為400 μmol/L時(shí)抑制作用最強(qiáng)。于是，筆者選擇400 μmol/L給藥劑量進(jìn)行機(jī)制探討。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過OGD損傷，BV2細(xì)胞凋亡明顯增加并且細(xì)胞內(nèi) ROS和 NO水平顯著升高， 而 DCA可顯著抑制細(xì)胞凋亡并下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS、 NO的水平， 提示DCA可能通過抑制BV2細(xì)胞激活后ROS和NO的水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)活性。為進(jìn)一步探討 DCA是否通過抗炎作用發(fā)揮對小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，筆者對 JNK、 I-κB和 NF-κB的蛋白表達(dá)， I-κB磷酸化水平以及 NF-κB磷酸化水平進(jìn)行檢測。NF-κB作為促炎因子基因表達(dá)的最主要調(diào)節(jié)者之一[11]，與腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)炎癥的發(fā)生及小膠質(zhì)細(xì)胞激活密切相關(guān)[12]。 I-κB是 NF-κB信號通路的重要組成，正常情況下，I-κB和NF-κB形成復(fù)合體存在于胞質(zhì)中。當(dāng)受到胞外信息刺激時(shí)， I-κB發(fā)生磷酸化并被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，導(dǎo)致 NF-κB p65核結(jié)合位點(diǎn)暴露并使之發(fā)生核轉(zhuǎn)位， NF-κB p65入核后與相關(guān)免疫基因結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)這些基因轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示，OGD誘導(dǎo)的 BV2 細(xì)胞激活伴隨JNK、I-κB 、NF-κB磷酸化水平的增加； 而DCA處理可顯著抑制上述改變。結(jié)合 DCA對 OGD所致BV2細(xì)胞激活后 ROS、 NO表達(dá)的降低，表明DCA可能通過抑制 JNK/I-κB/ NF-κB信號通路的激活，進(jìn)而抑制 OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)，最終發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明，DCA能夠顯著抑制 OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞凋亡并且可以減少細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的水平，并通過調(diào)控NF-κB/STAT3信號通路產(chǎn)生抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用。DCA可能在腦缺血中對小膠質(zhì)細(xì)胞引起的損傷具有保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究需要在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蜕细钊氲亟忉孌CA對腦缺血的影響及其作用機(jī)制，為DCA在臨床用于缺血性腦卒中的治療提供藥理學(xué)理論基礎(chǔ)。