鄭 慧 楊 勇 曾藝瓊 梁倩倩 單 碩 李順祥

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院食品藥品工程系，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

蜂花粉被譽(yù)為“微型營(yíng)養(yǎng)庫(kù)”，在中國(guó)其藥食兼用歷史可追溯到兩千年前。依托中國(guó)豐富的蜂花粉資源，近年來中國(guó)蜂花粉相關(guān)研究日益升溫，主要集中在細(xì)胞壁破壁，總黃酮、總多酚、多糖等成分的研究上，其中多酚類組分因其較強(qiáng)的抗氧化性，已成為蜂花粉的特征性功效成分[1-3]。前期研究[4]表明蜂花粉纖維類組分含量豐富，可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)含量為4%～9%。且纖維組分的提取工藝勢(shì)必會(huì)影響蜂花粉的蛋白致敏源，可能降低蜂花粉致敏性，同時(shí)解決含雜含砂、口感獨(dú)特等制約其進(jìn)一步開發(fā)利用的難題。

近年來膳食纖維因其良好的生理功能[5-6]，已成為產(chǎn)品開發(fā)的研究熱點(diǎn)，其中SDF因其良好的溶解性，被廣泛地應(yīng)用于乳制品、飲料等食品中[7-8]；同時(shí)研究[9-10]多認(rèn)為膳食纖維的抗氧化性、降血糖、減肥、減少慢性胃腸道紊亂等功效與其中含有的多酚類緊密有關(guān)。研究[11]表明蜂花粉中含有豐富的多酚類化合物，則其纖維組分也可能含有一定量的多酚類物質(zhì)。目前，蜂花粉纖維類組分的研究剛剛起步，提取方法對(duì)蜂花粉可溶性膳食纖維(bee pollen soluble dietary fiber，BPSDF)中多酚含量影響的相關(guān)研究暫未有報(bào)導(dǎo)。本試驗(yàn)擬在前期研究基礎(chǔ)上，分別采用纖維素酶酶解提取、酸溶液提取、堿溶液提取3種方法制備BPSDF，探究提取方法對(duì)BPSDF游離酚、結(jié)合酚及總酚含量，以及對(duì)常見致病菌、有益菌生長(zhǎng)的影響，為后期蜂花粉纖維組分的深入研究及產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 材料與試劑

荷花蜂花粉：2017年產(chǎn)自湖南，長(zhǎng)沙蜂舞人間生物科技有限公司；

原兒茶酸：分析標(biāo)準(zhǔn)品，上海躍騰生物技術(shù)有限公司；

纖維素酶：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

丙酮、福林酚、乙酸乙酯、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、乙醇等：分析純；

LB培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)、SDA培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)白色念珠球菌)、MRS培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌)：杭州百思生物技術(shù)有限公司；

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌：上海魯微科技有限公司；

嗜酸乳桿菌凍干粉：廣東省菌種保藏中心；

雙歧桿菌：由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院食品科學(xué)與工程教研室保存。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱：MJX-150BX型，天津泰斯特儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZM-60KCS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

凈化工作臺(tái)：SW-CJ-2FD型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

恒溫振蕩器：ZHWY-200D型，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；

電子分析天平：AV1120型，日本島津儀器有限公司；

電子恒溫水浴鍋：DZKW-4型，北京中關(guān)偉業(yè)儀器有限公司；

pH計(jì)：STARTER3100/F型，奧豪斯儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV 2450型，日本島津儀器有限公司；

高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器：Agilent 1260型，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BPSDF提取

(1) 纖維素酶酶解提?。簻?zhǔn)確稱取100 g蜂花粉置于pH 4.0水溶液中，加入2.5 g纖維素酶，50 ℃振搖2 h，85 ℃ 水浴10 min滅酶。3 500 r/min離心10 min后取上清液，用4倍體積的95%乙醇醇沉，5 ℃靜置過夜，3 500 r/min 離心10 min 取沉淀，置于真空干燥箱60 ℃干燥10 h得到酶提BPSDF[12]。

(2) 酸溶液提?。簻?zhǔn)確稱取100 g蜂花粉置于pH 4.3水溶液中，50 ℃振搖2 h。3 500 r/min離心10 min取上清液，其后按酶解提取中后續(xù)方法進(jìn)行，得到酸提BPSDF[13]。

(3) 堿溶液提?。簻?zhǔn)確稱取100 g蜂花粉置于pH 10.0 水溶液中，50 ℃振搖2 h。3 500 r/min離心10 min取上清液，其后按酶解提取方法進(jìn)行，得到堿提BPSDF[14]。

1.2.2 游離態(tài)多酚的提取 參照Adom等[15]的方法，稍作修改。準(zhǔn)確稱取4.000 g BPSDF于離心管中，加入80%冷凍丙酮溶液16 mL，5 ℃振搖1 h，于3 500 r/min 離心10 min，取上清液。殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并上清液，抽濾后45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇定容，-5 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 結(jié)合態(tài)多酚的提取 BPSDF游離酚提取后的殘?jiān)尤? mol/L NaOH溶液4 mL，充分?jǐn)嚢韬蟊芄庀? h，用濃鹽酸調(diào)至pH 2。加入8 mL乙酸乙酯并充分?jǐn)嚢杼崛?0 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液。重復(fù)提取5 次，合并上清液。抽濾后45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇定容，-5 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 多酚含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品，定容后得原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL于10 mL容量瓶中，各加6 mL 水，搖勻，再加0.5 mL福林酚試劑，充分搖勻。1 min 之后，加入20% Na2CO3溶液1.5 mL，混勻后定容。在室溫下反應(yīng)10 min，于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以原兒茶酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=102.54x+0.005 1 (R2=0.999 2)。BPSDF多酚含量測(cè)定的操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。

1.2.5 多酚的HPLC分析 BPSDF多酚提取液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后待用。色譜條件[16]：Ultimate XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：純水—甲醇(體積比50∶50)；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.6 BPSDF對(duì)有益菌、有害菌生長(zhǎng)的影響

(1) 菌懸液的制備：供試菌種活化后，挑取斜面培養(yǎng)基上的菌苔，用無(wú)菌水采用梯度法稀釋，依次得到不同濃度的供試菌菌懸液。

(2) 試驗(yàn)培養(yǎng)基的配制：分別稱取BPSDF于適量蒸餾水中，50 ℃振搖5 h，充分溶解后備用。各基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置、密封后，于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min，取出后將各BPSDF水溶液按比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，得到含有BPSDF分別為 1，3，5 g/L 3個(gè)濃度的試驗(yàn)培養(yǎng)基，同時(shí)以不添加BPSDF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照。

(3) 菌體生長(zhǎng)試驗(yàn)、計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)：在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)菌操作，準(zhǔn)確移入1 mL受試菌菌懸液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再趁熱分別移入10 mL含有BPSDF 1，3，5 g/L 3個(gè)濃度的試驗(yàn)培養(yǎng)基以及對(duì)照培養(yǎng)基，振蕩搖勻，待培養(yǎng)基凝固后移入培養(yǎng)箱中，在受試菌規(guī)定的溫度、時(shí)間下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同提取方法、不同濃度BPSDF對(duì)各受試菌生長(zhǎng)的影響。采用平板菌落計(jì)數(shù)法，對(duì)受試菌的培養(yǎng)結(jié)果按式(1)進(jìn)行活菌落計(jì)數(shù)，將結(jié)果換算成lgN進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[17]。

N=n×m×10，

(1)

式中：

N——活菌數(shù)，CFU；

n——細(xì)菌菌落數(shù)，CFU；

m——稀釋倍數(shù)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)試樣重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取BPSDF的游離酚、結(jié)合酚和總酚含量

由表1可得，在提取過程中蜂花粉原料中的多酚類物質(zhì)除溶于水、乙醇溶液而流失外，還有部分被殘留在BPSDF中。多酚在食品基質(zhì)中可能以單體的形式被物理吸附或截留成為游離態(tài)多酚，或與基質(zhì)通過化學(xué)鍵的結(jié)合而成為結(jié)合態(tài)多酚[18]。游離態(tài)多酚多通過胃、小腸消化吸收而發(fā)揮功效；結(jié)合態(tài)多酚則能到達(dá)大腸，在腸道微生物的作用下實(shí)現(xiàn)游離化而發(fā)揮其功效[19-20]。

從表1還可知，不同方法提取BPSDF的游離酚、結(jié)合酚和總酚含量均差異顯著，游離酚為0.309～0.435 mg/g，結(jié)合酚含量為0.092～0.135 mg/g，總酚含量為0.444～0.536 mg/g。纖維素酶酶解提取、酸溶液提取、堿溶液提取BPSDF游離酚分別占其總酚的81.16%，80.34%，69.59%，可推知BPSDF中多酚主要以游離酚的形式存在。同時(shí)，酶提BPSDF游離酚、總酚含量較高，分別為堿提的1.41，1.21倍；堿提BPSDF結(jié)合酚含量較高，為酸提的1.47倍。不同的提取方法可能導(dǎo)致蜂花粉細(xì)胞壁裂解組分、同一組分裂解方式不同，得到的BPSDF組成成分、分子量大小、碳鏈長(zhǎng)短不同[12]，從而影響B(tài)PSDF中殘留多酚的含量及多酚存在形式。

表1 BPSDF游離酚、結(jié)合酚和總酚含量?

Table 1 Contents of free polyphenols, binding polyphenols and total polyphenols in BPSDF mg/g

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同方法提取BPSDF游離酚、結(jié)合酚的HPLC圖譜

3種方法提取BPSDF的游離酚、結(jié)合酚HPLC疊加圖譜如圖1所示，游離酚、結(jié)合酚HPLC圖譜峰形相似，出峰時(shí)間相近，出峰面積略有差異。其中，BPSDF游離酚在3.775 min附近均出現(xiàn)較大吸收峰，結(jié)合酚在3.775，4.256 min 附近均出現(xiàn)較大吸收峰。從HPLC圖譜初步推之，提取條件雖對(duì)蜂花粉多酚含量有一定影響，但對(duì)保留在BPSDF中各游離酚、結(jié)合酚中主要的多酚組分影響較小，其具體差異性還需進(jìn)一步研究確定。

2.3 不同方法提取BPSDF對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，不同方法提取的BPSDF對(duì)大腸桿菌均有一定的抑制作用；且隨著試驗(yàn)培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，抑制能力增加。同時(shí)，同種濃度下添加酶提BPSDF供試培養(yǎng)基的大腸桿菌菌落數(shù)最低，與空白對(duì)照組相比在1 g/L濃度下即有極顯著差異，抑制作用最強(qiáng)；其次，酸提BPSDF 1 g/L濃度下與空白對(duì)照組相比差異顯著，5 g/L濃度達(dá)到差異極顯著；堿提BPSDF對(duì)大腸桿菌的抑制作用相對(duì)較低，在5 g/L濃度下與空白對(duì)照組相比差異顯著。3種方法提取的BPSDF對(duì)大腸桿菌的抑制能力與其含有游離酚、總酚含量高低的趨勢(shì)一致。

S1. 酶提BPSDF S2. 酸提BPSDF S3. 堿提BPSDF圖1 BPSDF游離酚、結(jié)合酚HLPC圖譜Figure 1 HPLC chromatograms of free polyphenols,binding polyphenols in BPSDF

*表示與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)

圖2 BPSDF對(duì)大腸桿菌菌落數(shù)的影響

Figure 2 The influence of BPSDF onE.colicolonies

2.4 不同方法提取BPSDF對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，3種方法提取的BPSDF對(duì)金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用；且隨著試驗(yàn)培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，抑制能力增加。同時(shí)，同種濃度下添加酶提BPSDF供試培養(yǎng)基的金黃色葡萄球菌菌落數(shù)最低，與空白對(duì)照組相比在1 g/L濃度下差異顯著，在3 g/L 濃度下達(dá)到差異極顯著，抑制作用最強(qiáng)。其次，堿提BPSDF在3 g/L濃度下與空白對(duì)照組相比差異顯著，酸提BPSDF在5 g/L濃度下與空白對(duì)照組相比差異顯著。

*表示與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)

圖3 BPSDF對(duì)金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的影響

Figure 3 The influence of BPSDF on Staphylococcus aureus colonies

2.5 不同方法提取BPSDF對(duì)白色念珠球菌生長(zhǎng)的影響

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，3種方法提取的BPSDF對(duì)白色念珠球菌均有一定的抑制作用；隨著試驗(yàn)培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，抑制能力增加。同時(shí)，同種濃度下添加酶提BPSDF供試培養(yǎng)基的白色念珠球菌菌落數(shù)最低，與空白對(duì)照組相比在1 g/L濃度下差異顯著，3 g/L 時(shí)差異極顯著，抑制作用最強(qiáng)。其次，酸提BPSDF在3 g/L 濃度下與空白對(duì)照組相比差異顯著，5 g/L濃度達(dá)到差異極顯著。堿提BPSDF對(duì)白色念珠球菌的抑制作用相對(duì)較低，在5 g/L濃度下與空白對(duì)照組相比差異顯著。3種方法提取的BPSDF對(duì)白色念珠球菌的抑制能力與其含有游離酚、總酚含量高低的趨勢(shì)一致。

2.6 不同方法提取BPSDF對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響

如圖5所示，與空白對(duì)照組相比，3種方法提取的BPSDF對(duì)雙歧桿菌均有一定的促進(jìn)作用；且隨著試驗(yàn)培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，促進(jìn)能力增加。同時(shí)，同種濃度下添加酶提、酸提BPSDF供試培養(yǎng)基的雙歧桿菌菌落數(shù)較高，與空白對(duì)照組相比均在3 g/L濃度下差異顯著，5 g/L 時(shí)差異極顯著，促進(jìn)作用較強(qiáng)。堿提BPSDF對(duì)雙歧桿菌的促進(jìn)作用相對(duì)較低，在5 g/L濃度下與空白對(duì)照組相比差異顯著。

*表示與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)

圖4 BPSDF對(duì)白色念珠球菌菌落數(shù)的影響

Figure 4 The influence of BPSDF on Candida sporogenes colonies

*表示與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)

圖5 BPSDF對(duì)雙歧桿菌菌落數(shù)的影響

Figure 5 The influence of BPSDF on Bifidobacterium colonies

2.7 不同方法提取BPSDF對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響

如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，3種方法提取的BPSDF對(duì)嗜酸乳桿菌均有一定的促進(jìn)作用；且隨著試驗(yàn)培養(yǎng)基中BPSDF濃度增加，促進(jìn)能力增加。同時(shí)，同種濃度下添加堿提、酸提BPSDF供試培養(yǎng)基的嗜酸乳桿菌菌落數(shù)較高，與空白對(duì)照組相比均在1 g/L濃度下達(dá)到差異極顯著，促進(jìn)作用相對(duì)較強(qiáng)。相同濃度下酶提BPSDF供試培養(yǎng)基的嗜酸乳桿菌菌落數(shù)較低，在5 g/L濃度下與空白對(duì)照組相比差異極顯著，對(duì)嗜酸乳桿菌的促進(jìn)作用相對(duì)較低。

*表示與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)

圖6 BPSDF對(duì)嗜酸乳桿菌菌落數(shù)的影響

Figure 6 The influence of BPSDF on Lactobacillus acidophilus colonies

3 結(jié)論

本研究探討了3種方法提取的BPSDF中多酚存在形式及其含量，BPSDF對(duì)常見有害菌、有益菌的影響。結(jié)果表明，BPSDF中多酚主要以游離酚的形式存在；提取方法對(duì)其保留的游離酚、結(jié)合酚的多酚組分影響較小。3種方法提取的BPSDF對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌有較好的抑制作用，對(duì)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌有一定的促進(jìn)作用。從抑制有害菌、促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的百分率對(duì)比分析，BPSDF對(duì)供試有害菌的抑制作用優(yōu)于對(duì)供試有益菌的促進(jìn)作用。并且，BPSDF中總酚、游離酚含量與其對(duì)供試有害菌抑制作用的趨勢(shì)相符，采用纖維素酶酶解提取BPSDF其總酚、游離酚殘留較高，對(duì)3種供試有害菌的抑制作用較好。

另外，糖份作為微生物生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分。BPSDF對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響不僅與其所含多酚相關(guān)，也應(yīng)與其所含糖相關(guān)。故后續(xù)將對(duì)不同方法提取的BPSDF中糖的組成做進(jìn)一步研究。