蒯權(quán) 王宜梅 李聰 黃娜 祝愿 文輝才

慢性創(chuàng)面多發(fā)于糖尿病足、靜脈性潰瘍、褥瘡及深度創(chuàng)傷等疾病[1]，目前臨床上仍缺乏有效的治療方法，其修復(fù)難點在于新生血管較正常創(chuàng)面少、創(chuàng)面局部血液供應(yīng)不足、炎癥因素持續(xù)存在等[2]。血管基質(zhì)組分（Stromal vascular fraction，SVF）是脂肪來源干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）與其他細胞成分相混雜的細胞群體。有研究表明，SVF/ADSCs不僅具有自我更新和分化為各系組織細胞的能力，還可旁分泌多種促進血管新生的生長因子，較其他成體干細胞更易獲取，儲量豐富，較少涉及倫理問題，被廣泛地應(yīng)用于缺血性疾病的治療[3-5]。但是SVF和ADSCs的制備過程較為復(fù)雜，需要特定的設(shè)備裝置；培養(yǎng)過程中添加的異種血清及血清中尚未明確的蛋白都可能造成污染。SVF-gel是將脂肪組織中的成熟脂肪細胞最大程度破壞而獲取的富集有脂肪來源干細胞和細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的混合物[3-5]。研究證實，局部移植SVF-gel到大鼠缺血性皮瓣中，可上調(diào)組織中的VEGF和bFGF的表達，促進皮瓣血管的新生[6]。本實驗擬研究SVF-gel對糖尿病鼠創(chuàng)面愈合的促進作用，為SVF-gel治療慢性創(chuàng)面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

8～9周齡SPF級SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g（南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心）。

鏈尿佐菌素、Ⅰ型膠原酶、紅細胞裂解液（S igma公司，美國），檸檬酸、檸檬酸鈉（北京化工廠），水合氯醛（上?；S），CD34免疫組織化學(xué)試劑盒（中杉公司），PBS、胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）。

離心機（中科中佳科學(xué)儀器有限公司），吸脂針Tonnard HarvesterTM（Tulip公司，美國），一次性螺旋口無菌注射器10 m L、無菌二通接頭（BD公司，美國），200目篩網(wǎng)（CORNING公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪組織的獲取

8周齡左右的SD雄性大鼠，腹腔注射麻醉，在超凈工作臺上，取大鼠雙側(cè)腹股溝處的脂肪組織，用含有雙抗的PBS反復(fù)沖洗去除血液，剔除脂肪組織中的小血管和結(jié)締組織并剪碎。

1.2.2 SVF-gel的制備

參照文獻[7]的方法：將剪碎的脂肪組織以1 200 g離心3 min，棄下層液體部分，得到中間層的脂肪，同時收集上層的油脂備用。將脂肪置入2個內(nèi)徑為2.4 mm直二通管相連的10 mL螺旋口注射器中，以10 mL/sec的推注速度反復(fù)推注2 min，成乳糜狀后過濾除去粗大的結(jié)締組織，將0.5 mL的油脂加入乳糜化的脂肪組織中，推注3～5次，再以2 000 g離心3 min，棄去下層液體以及上層大量的油脂，得到中間層凝膠樣的物質(zhì)即為SVF-gel（圖1）。

圖1 制備的SVF-gel Fig.1 SVF-gel

1.2.3 SVF懸液的制備

收集大鼠腹股溝處的脂肪組織10 m L，加入等體積0.1%Ⅰ型膠原酶消化液混勻，在37℃恒溫搖床中消化1 h后，用200目尼龍網(wǎng)過濾，1 500 g離心5 min，去上清，完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，加入紅細胞裂解液，室溫下孵育5 min，1 200 g離心3 min后，將細胞沉淀加入生理鹽水混懸并計數(shù)[8]。

1.2.4 建立糖尿病大鼠創(chuàng)面模型

將SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，單次性腹腔內(nèi)注射55 mg/K g劑量的STZ（溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.0），48 h后尾靜脈取血，用血糖試紙測大鼠的非空腹血糖值≥13.8 mmol/L，并觀察1周，穩(wěn)定者為糖尿病大鼠模型[9]。將36只糖尿病鼠腹腔注射麻醉后，在背部兩側(cè)分別制作直徑為1.2 cm的圓形皮膚全層創(chuàng)面。隨機分為A組（SVF-gel）組、B組（SVF懸液）、C組（生理鹽水），每組12只大鼠。B組創(chuàng)面周圍注射1 mL的SVF細胞懸液（SVF細胞數(shù)約為1×105個），A組創(chuàng)面周圍注射含有相同SVF細胞數(shù)的SVF-gel，C組創(chuàng)面周圍注射1 mL生理鹽水。觀察治療后0 d、3 d、7 d、10 d和14 d創(chuàng)面閉合情況，并于治療后14 d每組取4只大鼠觀察創(chuàng)面組織學(xué)變化。

1.3 觀察指標

1.3.1 不同時間三組動物創(chuàng)面愈合大小

每組抽取4只大鼠觀察拍照，每只大鼠2個創(chuàng)面，每組共8個創(chuàng)面用來記錄各觀察時間點創(chuàng)面愈合情況。拍照后以Image Proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面愈合率。

1.3.2 組織學(xué)觀察

治療后14 d，每組4只大鼠，取創(chuàng)面及周圍2 mm組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察創(chuàng)面組織內(nèi)炎癥細胞浸潤情況、創(chuàng)面內(nèi)新生血管的形成，以及肉芽組織生長和再上皮化情況。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色觀察

同法取材、切片，按CD34免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明書進行染色，光鏡下觀察血管形成情況，棕黃色即為陽性染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建糖尿病大鼠創(chuàng)面模型

STZ腹腔注射1周后，尾靜脈取血，測得所有大鼠的血糖值均大于13.8 mmol/L，且有明顯的多飲、多食、多尿、毛色變黃等癥狀，無大鼠因血糖過高死亡。大鼠背部創(chuàng)面形成后分籠飼養(yǎng)，常規(guī)觀察，術(shù)后動物無死亡，全部存活。

2.2 大體觀察結(jié)果

術(shù)后3 d拆去敷料后各組創(chuàng)面無血腫、感染及其他不良反應(yīng)。注射治療后7 d，各組創(chuàng)面表層都被淡紅或暗紅色的痂皮覆蓋，揭去血痂后，A組創(chuàng)面肉芽組織生長良好，顏色鮮紅，濕潤，觸之易出血；B組創(chuàng)面內(nèi)也可見肉芽組織生成，未見液體滲出；C組創(chuàng)面肉芽組織生長緩慢，顏色略暗，部分表面尚有滲出。治療10 d后，A組創(chuàng)面面積較另兩組顯著減小，再上皮化明顯，C組創(chuàng)面愈合較緩慢，表面仍有部分血痂及少許滲出。治療14 d后，A組創(chuàng)面幾乎完全愈合，B組創(chuàng)面部分愈合，表面有薄層的上皮覆蓋，C組創(chuàng)面愈合最差，創(chuàng)面面積明顯大于另兩組（圖2）。

圖2 各組創(chuàng)面在不同時間點愈合情況Fig.2 Wound healing at different time points in each group

2.3 創(chuàng)面愈合率比較

A、B組各時間點創(chuàng)面愈合率均優(yōu)于C組（P＜0.05），且A組各時間點創(chuàng)面愈合率均優(yōu)于B組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組不同時間點創(chuàng)面愈合率比較Table 1 Comparison of wound healing rates at different time points in each group

2.4 組織學(xué)觀察

HE染色見C組創(chuàng)面內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤和成纖維細胞，細胞排列紊亂，新生血管少，肉芽組織結(jié)構(gòu)疏松，再上皮化不完整。A組與C組相比，炎癥細胞浸潤減少，真皮毛細血管數(shù)量明顯增多，再上皮化明顯，肉芽組織結(jié)構(gòu)致密。B組與C組相比，炎癥細胞浸潤減少，較多的膠原纖維及毛細血管，再上皮化較完整，但不及A組（圖3）。

圖3 治療后14 d各組組織形態(tài)學(xué)觀察（200×）Fig.3 Histological observation of each group by HE staining 14 days after treatment(200×)

2.5 免疫組織化學(xué)染色觀察

各組創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)均有垂直于創(chuàng)面的新血管生成。A、B兩組新生血管數(shù)量多于C組，C組部分新生血管尚無明顯的管腔結(jié)構(gòu)，血管斷層僅有單個內(nèi)皮細胞。A、B組創(chuàng)面內(nèi)均可見較多具有成熟管腔的新生血管，尤以A組為多（圖4）。

圖4 治療后14 d各組免疫組化觀察血管形成情況（200×）Fig.4 The angiogenesis in each group detected by immunohistochemical staining 14 days after treatment(200×)

3 討論

創(chuàng)面組織的愈合是通過一個及時有序的連續(xù)過程來恢復(fù)組織功能與解剖的完整性。當(dāng)創(chuàng)面受到內(nèi)外因素的影響，這種有序的過程會受到干擾，使創(chuàng)面停滯在病理炎癥反應(yīng)狀態(tài)，導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈[10]。血管再生是創(chuàng)面修復(fù)的重要環(huán)節(jié)，血管新生速度減慢或者功能降低都有可能導(dǎo)致局部血液循環(huán)不良，周圍組織缺血缺氧。這樣不僅會損害人體抵抗細菌的防御系統(tǒng)，使創(chuàng)面易感性增加，也會影響機體的新陳代謝能力，使創(chuàng)面內(nèi)的膠原蛋白合成減少，血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞等的增殖遷移受到限制[11]。

治療慢性創(chuàng)面的方法主要包括外科治療（清創(chuàng)、植皮、皮瓣移植等）、高壓氧治療、外源性生長因子的應(yīng)用、負壓引流術(shù)和光子治療等，療效各異[12]。目前，干細胞療法被認為是最具前景，最早應(yīng)用于慢性創(chuàng)面治療的是BMSC[13-15]，但抽取骨髓是高度侵入性的，且數(shù)量稀少[16]。與此相比，ADSC獲取容易，且含量遠高于BMSC，更有研究證實ADSC增殖分化能力強于BMSC[17-18]。因此，ADSC可作為一種更加優(yōu)質(zhì)的細胞資源用于慢性創(chuàng)面的治療。大量報道認為，新鮮分離的SVF細胞和培養(yǎng)后的ADSC用于治療糖尿病或難愈性潰瘍，其促愈合機制不僅是直接分化為像血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和表皮細胞等各種修復(fù)細胞，而且還可旁分泌出多種生物活性分子，如VEGF、HGF、FGF等來促進血管生成和創(chuàng)面再上皮化，減少炎癥和細胞凋亡，參與創(chuàng)面的損傷修復(fù)，實現(xiàn)創(chuàng)面加速愈合過程[19-22]。

SVF-gel是將脂肪組織經(jīng)簡單的機械方法處理而獲取的凝膠狀物質(zhì)，含有高度濃縮的具有生物活性的ECM和SVF。本實驗中，我們局部注射SVFgel到糖尿病鼠創(chuàng)面中，發(fā)現(xiàn)治療后大鼠創(chuàng)面愈合率在各個時間點都高于另兩組，組織學(xué)結(jié)果也證實SVF-gel可明顯減輕創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)，增加血管網(wǎng)的數(shù)量，促進肉芽組織生長，加速再上皮化的形成。與SVF懸液相比，雖然兩者的SVF細胞數(shù)相同，但SVF-gel顯示出更佳的治療效果。這主要是SVFgel中的ECM發(fā)揮著天然細胞載體的作用。研究表明，如直接將ADSC注射到病變部位，微環(huán)境中缺血缺氧和炎癥反應(yīng)、注射過程中的機械性損傷，以及經(jīng)過組織間隙的大量流失，均可導(dǎo)致其在靶區(qū)域存活率下降，使之發(fā)揮的作用有限[23-24]。而ECM包含了纖維蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖，可以為ADSC提供良好的微環(huán)境，調(diào)節(jié)細胞的行為，促進細胞的增殖和分化潛能，讓ADSC能分泌更多的血管生長因子，保護其免遭巨噬細胞的吞噬，使之能在創(chuàng)面處充分地發(fā)揮促愈合的能力[25-26]。

SVF-gel治療機制尚不清楚，還有待于進一步的研究。