陳 陽， 崔 波， 張藝竹， 安 叡， 邵建華

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

中西藥聯(lián)合應(yīng)用后，可導(dǎo)致不同藥物之間發(fā)生相互作用，主要體現(xiàn)在理化性質(zhì)、藥動學(xué)、藥效學(xué)3個方面［1-4］。其中，藥動學(xué)相互作用可發(fā)生在體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄過程中的某一個或多個環(huán)節(jié)，直接影響藥物療效，甚至產(chǎn)生毒副作用［5-7］，故研究聯(lián)合用藥后的藥動學(xué)變化對指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義。

葛根芩連湯是中醫(yī)治療泄瀉、痢疾的經(jīng)典方劑，現(xiàn)代醫(yī)家也將其應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療，取得了良好的療效，可減輕2型糖尿病患者對胰島素的抵抗，促進(jìn)胰腺B細(xì)胞功能上的恢復(fù)，并具有抗氧化活性［8-9］， 方中葛根素［10-11］、 黃芩苷［12-13］、 小檗堿［14-16］對該疾病發(fā)生發(fā)展具有延緩和治療作用。

吡格列酮為噻唑烷二酮類口服降糖藥，可用于治療2型糖尿病，但臨床研究表明［17］服用該藥物后會有胃潰瘍復(fù)發(fā)的風(fēng)險，并伴有低血糖、水腫、肝功能異常、腹脹腹瀉等不良反應(yīng)。葛根芩連湯與吡格列酮聯(lián)合應(yīng)用時，在發(fā)揮降低血糖作用的同時又可調(diào)理胃腸道癥狀，能降低或延緩后者不良反應(yīng)的發(fā)生，避免糖尿病患者要逐漸增加藥量才能達(dá)到治療目的的弊端，具有一定臨床意義。課題組前期研究表明，葛根芩連湯及其主要藥效成分在大鼠肝微粒體中能抑制吡格列酮的代謝；本實驗將考察葛根芩連湯對吡格列酮在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)行為的影響，以期為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UPLC XR超高效液相色譜／TSQ三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 （日本 Shimadzu公司／美國Thermo Fisher公司）；VX-200漩渦混懸器 （美國Labnet公司）；BT125D電子天平 （德國Sartoris公司）；DC12H水浴氮吹儀 （上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；5424R冷凍離心機、Research plus移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥 鹽酸吡格列酮片 （批號170801-153B，15 mg／片），由日本武田藥品工業(yè)株式會社生產(chǎn)。葛根 （批號170316）、黃芩 （批號170708）、黃連（批號170727）均購于上海康橋中藥飲片有限公司，炙甘草 （批號170306）購于上海金橋養(yǎng)和堂藥店，經(jīng)上海虹橋飲片廠陳燕軍藥師鑒定為正品，均符合2015年版 《中國藥典》規(guī)定。吡格列酮（批號100634-200401）、羅格列酮 （批號100673-200401）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇（德國Merck公司）、甲酸 （德國CNW公司）均為色譜純；乙酸乙酯、乙酸銨均為分析純，羧甲基纖維素鈉為化學(xué)純，均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為雙蒸水。

1.3 動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK （滬）2014-0008。

2 方法與結(jié)果

2.1 LC-MS／MS條件

2.1.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱 （4.6 mm×50 mm，2.7 μm）， 預(yù)柱月旭 XBC18色譜柱 （3 μm）； 流動相 5 mmol／L 乙酸銨 （含0.1%甲酸） （A） -甲醇 （B），梯度洗脫 （0 min，70%B； 2 min， 95%B； 2.1 min， 70%B； 4 min，70%B）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30℃；進(jìn)樣量 5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離 （ESI）源，正離子模式檢測，掃描方式多反應(yīng)檢測 （MRM）；毛細(xì)管溫度280℃；霧化溫度300℃；鞘氣30 psi（1 psi＝6.895 kPa）；輔助氣8 psi；碰撞氣氬氣；正離子源噴射電壓3 000 V；m／z 357.4→134.2（吡格列酮），m／z 358.1→135.2（羅格列酮，內(nèi)標(biāo)）。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取吡格列酮對照品適量，甲醇溶解定容，制成201 μg／mL溶液，即得，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取羅格列酮對照品適量，甲醇溶解定容，制成200 μg／mL貯備液，精密吸取適量，甲醇稀釋至2 μg／mL，即得，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 葛根芩連湯 按處方比例 （葛根 ∶黃芩 ∶黃連 ∶炙甘草＝16∶9∶9∶5）加8倍量水，葛根先煎20 min，其他藥材共煎30 min，煎煮2次后濾過，合并濾液，濃縮成每1 mL含1.4 g生藥的藥液，即得，－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 給藥溶液 將鹽酸吡格列酮片研磨至粉末，精密稱取適量置于小燒杯中，加入0.5%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液 （含藥量0.3 mg／mL），超聲15 min，即得，使用前搖勻。

2.3 給藥

2.3.1 單次給藥 12只大鼠隨機分成葛根芩連湯＋吡格列酮組和吡格列酮組，每組6只，給藥前禁食 12 h，自由飲水，以 14 g／kg葛根芩連湯、3 mg／kg吡格列酮灌胃 （給藥體積 10 mL／kg）， 其中葛根芩連湯＋吡格列酮組以葛根芩連湯與吡格列酮相繼灌胃，間隔30 min；吡格列酮組用生理鹽水代替葛根芩連湯 （給藥體積10 mL／kg），其余步驟同葛根芩連湯＋吡格列酮組。分別于給藥前及給藥后0.083、 0.25、 0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3、 5、 8、12、24、32 h眼眶后靜脈叢取血200 μL，肝素抗凝，冷凍離心 （8 000 r／min、4℃）8 min，取上層血漿，－80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 多次給藥 12只大鼠隨機分成葛根芩連湯＋吡格列酮組和吡格列酮組，每組6只，給藥前禁食 12 h，自由飲水，以 14 g／kg葛根芩連湯、3 mg／kg吡格列酮灌胃 （給藥體積 10 mL／kg）， 其中葛根芩連湯＋吡格列酮組每天早晨灌胃葛根芩連湯1次，吡格列酮組每天早晨灌胃生理鹽水1次（給藥體積10 mL／kg），連續(xù)7 d，第8天給藥前禁食12 h，自由飲水，葛根芩連湯＋吡格列酮組以葛根芩連湯與吡格列酮相繼灌胃，間隔30 min，吡格列酮組以生理鹽水與吡格列酮相繼灌胃，間隔30 min。分別于給藥前及給藥后 0.083、0.25、0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3、 5、 8、 12、 24、 32 h 眼眶后靜脈叢取血 200 μL，肝素抗凝，冷凍離心8 min（8 000 r／min、 4℃）， 取上層血漿， －80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿處理 取肝素抗凝后的血漿50 μL，加入 10 μL 羅格列酮 （2 μg／mL， 內(nèi)標(biāo)）、 1 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻1 min， 冷凍離心 （12 000 r／min、4℃）8 min，吸取上清液 500 μL，氮氣吹干，200 μL流動相復(fù)溶， 冷凍離心 （13 500 r／min、4℃）10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 取空白血漿、空白血漿＋吡格列酮、灌胃給藥2.5 h后血漿，在 “2.1”項條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1。由圖可知，色譜峰峰形理想，與血漿中的內(nèi)源性成分達(dá)到很好的基線分離，空白無干擾，方法專屬性良好。

圖1 吡格列酮MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of pioglitazone

2.5.2 線性關(guān)系考察 取空白血漿50 μL，加入吡格列酮 10 μL， 配制成 1.05、 2.10、 5.25、 10.05、21.0、 52.5、 105、 210、 525、 1 050 ng／mL， 按“2.4”項下方法處理，在 “2.1”項條件下進(jìn)樣分析。以對照品質(zhì)量濃度 （X）對對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比 （Y）進(jìn)行回歸，得到方程為Y＝0.019 2＋0.006 74X （r＝0.999 5）， 在 1.05～1 050 ng／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限 （S／N＞10）為1.05 ng／mL。

2.5.3 精密度、準(zhǔn)確度試驗 取空白血漿50 μL，按 “2.5.2” 項下方法制成5.25、210、1 050 ng／mL質(zhì)控樣品各5份，連續(xù)測定3 d，測得吡格列酮批內(nèi)、批間精密度RSD均小于15%，準(zhǔn)確度86.6%～109.1%，均符合生物樣品分析要求。

2.5.4 回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗 取空白血漿，精密加入適量對照品溶液，配制成 5.25、210、1 050 ng／mL， 按 “2.4” 項下方法處理， 平行 5份，在 “2.1”項條件下進(jìn)樣分析，得峰面積A1；取相同體積空白血漿，按 “2.4”項下方法處理，平行5份，取上清液，加入對照品溶液，使其質(zhì)量濃度與A1一致，在 “2.1”項條件下進(jìn)樣分析，得峰面積A2；流動相稀釋對照品溶液至與A1一致，平行5份，在 “2.1”項條件下進(jìn)樣分析，得峰面積 A3， 計算提取回收率 （A1／A3）、 基質(zhì)效應(yīng)（A2／A3）。結(jié)果，吡格列酮提取回收率為89.93%～94.06%，RSD＜15%；基質(zhì)效應(yīng)為 85%～115%，RSD＜15%，符合相關(guān)要求，無明顯內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品各5份，分別考察含吡格列酮的血漿，按“2.4”項下方法處理，立即在 “2.1”項條件下進(jìn)樣分析；4℃下保存4 h后按 “2.4”項下方法處理，上清液放置24 h及－80℃下反復(fù)凍融3次、冷凍放置2周的穩(wěn)定性。結(jié)果，血漿在上述條件下的RSD均小于15%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.5.6 稀釋效應(yīng) 配制8.04 ng／mL對照品溶液，血漿稀釋10倍，測定稀釋樣品中吡格列酮質(zhì)量濃度。結(jié)果，吡格列酮準(zhǔn)確度、精密度RSD分別為8.3%、5.9%，表明稀釋不影響血漿中吡格列酮的質(zhì)量濃度。

2.6 藥動學(xué)研究

2.6.1 單次給藥 取 “2.3.1”項下血漿，按“2.4”項下方法處理，計算吡格列酮血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，結(jié)果見圖2，再通過DAS 2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表1。由此可知，與吡格列酮組比較，葛根芩連湯-吡格列酮組可顯著降低 Cmax， 顯著延長 Tmax、 MRT0～t（P＜0.05）。

圖2 吡格列酮血藥濃度-時間曲線 （單次給藥）Fig.2 Plasma concentration-time curves for pioglitazone（single administration）

表1 吡格列酮藥動學(xué)參數(shù) （單次給藥） （±s， n＝6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters for pioglitazone（single administration） （±s， n＝6）

表1 吡格列酮藥動學(xué)參數(shù) （單次給藥） （±s， n＝6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters for pioglitazone（single administration） （±s， n＝6）

注：與吡格列酮組比較，?P＜0.05

參數(shù) 單位 吡格列酮組 葛根芩連湯-吡格列酮組AUC0～t μg·L－1·h 23 085.02 ±3 490.70 18 972.22 ±3 495.61 AUC0～∞ μg·L－1·h 23 742.91 ±3 727.37 19 287.09 ±3 596.27 MRT0～t h 5.24 ±0.45 6.00 ±0.59?Cmax μg·L－1 2 993.22 ±483.77 2 040.49 ±436.33?Tmax h 1.20±0.27 1.70±0.27?t1／2 h 2.58 ±0.42 2.40 ±0.65 CLz／F L·（kg·h）－1 0.13 ±0.02 0.16 ±0.03

2.6.2 多次給藥 取 “2.3.2”項下血漿，按“2.4”項下方法處理，計算吡格列酮血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，結(jié)果見圖3，再通過DAS 2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。由此可知，與吡格列酮組比較，葛根芩連湯-吡格列酮組可極顯著提高 AUC，極顯著降低 CLZ／F（P＜0.01）， 同時顯著提高 MRT0～t、 Cmax， 顯著延長Tmax（P＜0.05）。

圖3 吡格列酮血藥濃度-時間曲線 （多次給藥）Fig.3 Plasma concentration-time curves for pioglitazone（multiple administration）

表2 吡格列酮藥動學(xué)參數(shù) （多次給藥） （±s， n＝6）Tab.2 Pharmacokinetic parameters for pioglitazone（multiple administration） （±s， n＝6）

表2 吡格列酮藥動學(xué)參數(shù) （多次給藥） （±s， n＝6）Tab.2 Pharmacokinetic parameters for pioglitazone（multiple administration） （±s， n＝6）

注：與吡格列酮組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

參數(shù) 單位 吡格列酮組 葛根芩連湯-吡格列酮組AUC0～ t μg·L－1·h 17 839.13 ±3 117.00 34 286.18 ±5 809.71??AUC0～∞ μg·L－1·h 17 853.55 ±3 116.31 34 369.24 ±5 784.80??MRT0～t h 6.21 ±0.32 6.94 ±0.37?Cmax μg·L－1 2 821.59 ±662.42 4 342.44 ±685.17?Tmax h 1.33±0.26 1.67±0.26?t1／2 h 4.07 ±1.81 4.10 ±0.38 CLz／F L·（kg·h）－1 0.17 ±0.03 0.09 ±0.02??

3 討論

3.1 血漿樣品前處理方法確定 生物樣品前處理是色譜分析中必不可少的步驟，方法主要有液液提取、蛋白沉淀、固相萃取等，可改善分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，延長色譜柱壽命，排除基質(zhì)干擾，富集被測組分［18］，故有效的前處理方法和HPLCMS聯(lián)用技術(shù)已成為藥動學(xué)研究中的有力工具。本實驗采用液液萃取法，考察了酸、中、堿性條件下乙酸乙酯、二氯甲烷作為萃取劑時的萃取條件，發(fā)現(xiàn)以中性乙酸乙酯為萃取劑時萃取完全，雜質(zhì)干擾小。

3.2 色譜條件確定 吡格列酮結(jié)構(gòu)中含有氮雜環(huán)，在反相C18色譜柱上的拖尾現(xiàn)象比較嚴(yán)重。為了改善峰形，本實驗考察了甲醇-水、甲醇-水 （含0.1%甲酸）、甲醇-1 mmol／L乙酸銨 （含0.1%甲酸）、甲醇-5 mmol／L乙酸銨 （含0.1%甲酸）等流動相，發(fā)現(xiàn)甲醇-5 mmol／L乙酸銨 （含0.1%甲酸）洗脫時峰形對稱性良好，分離度高。

3.3 內(nèi)標(biāo)確定 本實驗考察了卡馬西平、柚皮苷、吡格列酮的同系物羅格列酮，發(fā)現(xiàn)羅格列酮在質(zhì)譜響應(yīng)、色譜行為上都與吡格列酮接近，而且能與后者完全分離。

3.4 藥動學(xué)分析 多次給藥后，葛根芩連湯-吡格列酮組 AUC0～t、Cmax分別較吡格列酮組升高了1.92、 1.54倍， MRT0～t顯著增加， CLz／F 極顯著下降；與單次給藥比較，AUC0～t、Cmax分別升高了1.81、 2.13 倍， MRT0～t顯著增加， t1／2顯著延長，CLz／F顯著下降。由此可知，葛根芩連湯多次給藥能提高吡格列酮體內(nèi)暴露量，推測可能是由于所含藥效成分 （如小檗堿等）不斷與肝臟中的CYP1A2、 CYP2C11、 CYP3A1／2酶發(fā)生作用， 導(dǎo)致其活性受到抑制，從而抑制吡格列酮肝代謝及消除，而單次給藥不能明顯提高該藥物在大鼠體內(nèi)的生物利用度。