孔 燕， 王 健

（揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇揚州225009）

益氣通脈膠囊為寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院經(jīng)驗方，由西洋參、三七、黃精、川芎、赤芍等8味藥材組成，功效益氣養(yǎng)陰、活血通脈，用于氣陰不足兼血瘀癥所致頭昏、頭暈、胸悶、胸痛，但該方并無明確詳細(xì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本實驗通過查閱相關(guān)文獻和反復(fù)摸索，制定三七、川芎的顯微鑒別方法，確定川芎、赤芍、西洋參、三七的TLC定性鑒別方法［1］，并通過HPLC法測定西洋參、三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含有量［2］， 以期控制該制劑質(zhì)量［3］。

1 材料

BX51光學(xué)顯微鏡、3X Optical Zoom數(shù)碼相機（日本 Olympus公司）；MS204S電子天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州國華電器有限公司）；TLC Visualizer薄層成像系統(tǒng) （瑞士Camag公司）；硅膠G薄層板、高效硅膠G薄層板 （青島海洋化工廠）；Agilent 1200高效液相色譜儀 （美國安捷倫公司）。乙腈為色譜純［4］；其他試劑均為分析純；水為純化水。

川芎 （批號120918-201612）對照藥材及芍藥苷 （批號 110736-201741）、 三七皂苷 R1（批號110745-201619）、 人參皂苷 Rg1（批號 110703-201731）、人參皂苷Re（批號110754-201626）、人參皂苷 Rb1（批號110704-201625）、擬人參皂苷（批號841-9903）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。

3批益氣通脈膠囊來自寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院制劑室， 批號170502、 170529、 170619， 0.3 g／粒， 10粒／板，3板／盒。缺川芎、赤芍、西洋參、三七陰性樣品 （同時缺西洋參、三七的為陰性對照），來自寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院制劑室。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 圖1～2顯示，三七中樹脂道碎片含黃色分泌物［7］；川芎中油室大多已破碎，偶可見油室碎片，分泌細(xì)胞壁薄，含有較多的油滴［7］，3批樣品顯微特征均穩(wěn)定，易于鑒別。

圖1 三七顯微鑒別圖Fig.1 Image for microscopic identification of Notoginseng Radix et Rhizoma

2.2 TLC定性鑒別

2.2.1 川芎 取本品內(nèi)容物2 g，加25 mL乙醚輕搖，回流15 min，過濾，蒸干，殘渣加1 mL乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液［8-9］；取對照藥材1 g，同法制成相應(yīng)溶液［3，7］；取陰性樣品適量，同法制成相應(yīng)溶液，吸取上述3種溶液各5 μL，點于同一硅 膠 G 薄 層 板 上［6，10］， 以 正 己 烷-乙 酸 乙 酯（3∶1）為展開劑，展開缸中預(yù)平衡15 min，上行展開，展距 9 cm，取出，晾干，置于紫外燈（365 nm） 下檢視［4，11］， 結(jié)果見圖 3。 由圖可知，供試品色譜中在與對照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點［12］， 陰性無干擾［13］。

圖2 川芎顯微鑒別圖Fig.2 Image for microscopic identification of Chuanxiong Rhizoma

圖3 川芎TLC色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Chuanxiong Rhizoma

2.2.2 赤芍 取本品內(nèi)容物2 g，加25 mL乙醇，輕搖，超聲15 min，過濾，蒸干，殘渣加1 mL乙醇溶解，作為供試品溶液［4］；取芍藥苷對照品適量，甲醇制成每1 mL含1 mg該成分的對照品溶液［2］；取陰性樣品適量，同法制成相應(yīng)溶液，吸取上述3種溶液各8 μL，點于同一硅膠G薄層板上［2］， 以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 （40 ∶5 ∶20 ∶0.5）為展開劑，展開缸中預(yù)平衡15 min，上行展開，展距9 cm，取出，晾干，再噴以5%香草醛硫酸溶液［7-8］， 105 ℃下加熱至斑點顯色清晰［11］， 置于日光下檢視，結(jié)果見圖4。由圖可知，供試品色譜在與對照品相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點［2］，陰性無干擾。

2.2.3 西洋參、三七 取本品內(nèi)容物2 g，加25 mL甲醇輕搖，回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加20 mL水溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2次［5］， 每次 25 mL， 合并提取液［14-15］， 正丁醇飽和水洗滌 2 次［2-3］， 每次 10 mL， 分取正丁醇液［7，9］，蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液［4，8］； 取擬人參皂苷 F11、 人參皂苷 Rb1、 人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對照品適量，甲醇制成每l mL各含2 mg上述成分的對照品溶液；取陰性對照適量，同法制成相應(yīng)溶液，吸取上述3種溶液各 5 μL，點于同一硅膠 G薄層板上［4，11］， 以三氯甲烷-無水乙醇-水 （20 ∶20 ∶2）為展開劑，展開缸中預(yù)平衡15 min，上行展開，展距9 cm，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液［11］， 105 ℃下加熱至斑點顯色清晰［4，15］， 分別置于日光、紫外光燈 （365 nm）下檢視，結(jié)果見圖5。由圖可知，供試品色譜在與對照品相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點或熒光斑點［2，10］，陰性無干擾。

2.3 HPLC含有量測定

2.3.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 Inertsil?ODS-SP 色譜柱 （5 μm， 4.6 mm×250 mm）； 流動相乙腈 （A）-水 （B）， 梯度洗脫， 程序見表 1；體積流量 1.0 mL／min；柱溫 28℃；檢測波長203 nm；進樣量10 μL，色譜圖見圖6。由圖可知，各成分分離度良好，陰性無干擾，理論塔板數(shù)按人參皂苷Rb1計應(yīng)不低于4 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

圖5 三七、西洋參TLC色譜圖Fig.5 TLC chromatograms of Notoginseng Radix et Rhizoma and Panacis quinquefolii Radix

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，制成分別含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、 人 參 皂 苷 Rb1317.12、 552.32、 646.72、561.28 μg／mL 的溶液， 即得。

2.3.2.2 供試品溶液 取質(zhì)量差異項下本品內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，精密稱取約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，靜置1 h，80℃水浴回流2 h，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.5、1、2、3、4、5、6 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度， 分別精密量取 10 μL［4］， 在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定［10］。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X）， 峰面積為縱坐標(biāo) （Y）［16］進行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖6 各成分HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

然后，甲醇多次稀釋對照品溶液，以信噪比S／N＝3為檢測限，S／N＝10為定量限。結(jié)果，三七皂苷R1檢測限、 定量限分別為 2.448、 8.606 μg／mL，人參皂苷Rg1分別為0.628、 3.580 μg／mL， 人參皂苷 Re 分別為 3.720、 13.953 μg／mL、 人參皂苷Rb1分別為 0.102、 27.151 μg／mL。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液各10 μL， 在 “2.3.1” 項色譜條件下進樣測定 6次［16］， 測得三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1、 人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積RSD［17］分別為1.4%、1.2%、1.2%、0.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取批號170502樣品0.5 g，按 “2.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、 4、 8、 12、 24、 48 h在 “2.3.1” 項色譜條件下進樣10 μL測定［18］，測得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積RSD分別為1.6%、1.5%、1.5%、0.9%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 精密稱取批號170502樣品6份，每份0.5 g，按 “2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1” 項色譜條件下進樣測定［19］，測得三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷Rb1含有量RSD分別為1.4%、1.5%、13%、0.8%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取批號170529樣品6份，每份0.25 g，精密加入含三七皂苷 R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb11 982、4 054、 3 564、 3 784 μg／mL 的對照品溶液 0.2 mL及甲醇24.8 mL，按 “2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果 （n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.3.8 樣品含有量測定 將 3批樣品［13］按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定［9］，計算含有量，結(jié)果見表4。然后，按三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1平均含有量的80%設(shè)限，分別為0.30、1.60、1.30、3.00 mg／粒，擬規(guī)定樣品中［5，18］含西洋參、三七量以各成分總含有量計，不得少于6.0 mg／粒。

表4 各成分含有量測定結(jié)果 （n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3 討論

3.1 TLC條件篩選 川芎的TLC條件參照2015年版 《中國藥典》，采用乙醚回流提取作為提取方法；比較了硅膠G預(yù)制薄層板、硅膠H預(yù)制薄層板、高效硅膠G預(yù)制薄層板 （青島海洋化工廠）上，發(fā)現(xiàn)高效硅膠G板雖然斑點較清晰，但Rf值相對其他2種板稍遜，綜合考慮選擇硅膠G板作為點樣薄層板；考察了不同展開系統(tǒng)，最終采用正己烷-乙酸乙酯 （3∶1），此時斑點清晰，分離度好，Rf值適宜； 比較了點樣2、5、 8、10 μL， 發(fā)現(xiàn)點樣5 μL時斑點清晰可見，分離度良好，無拖尾現(xiàn)象；樣品放置24 h后再點樣，發(fā)現(xiàn)斑點仍清晰可見，表明穩(wěn)定性較好；溫度、濕度對川芎TLC定性鑒別的影響不顯著，兩者分別在15～22℃、38%～65%范圍內(nèi)時薄層層析結(jié)果穩(wěn)定，斑點清晰。

赤芍的TLC條件參照2015年版 《中國藥典》，采用乙醇超聲作為提取方法；比較了硅膠G預(yù)制薄層板 （青島海洋化工廠、德國MN公司）、高效硅膠G預(yù)制薄層板 （青島海洋化工廠），發(fā)現(xiàn)均能得到較好分離，主斑點清晰，其中MN硅膠G板的斑點清晰度優(yōu)于青島海洋硅膠G板，但Rf值較低，而后者雖然斑點略散，但Rf值較適中，故選擇青島海洋硅膠G板作為點樣薄層板；比較了不同展開系統(tǒng)，最終采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶20∶0.5），此時斑點清晰，分離度好，Rf值適宜； 比較了點樣2、5、8、10 μL， 發(fā)現(xiàn)點樣8 μL斑點清晰可見，分離度良好，無拖尾現(xiàn)象；樣品放置24 h后點樣，發(fā)現(xiàn)斑點仍清晰可見，表明穩(wěn)定性較好；溫度、濕度對赤芍TLC定性鑒別的影響不顯著，兩者分別在15～22℃、38%～65%范圍內(nèi)時薄層層析結(jié)果穩(wěn)定，斑點清晰。

西洋參、三七的TLC條件參考了2015年版《中國藥典》，由于前者含有擬人參皂苷F11，為其特異性成分，同時2種藥材中共有成分較多，以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1相對含有量較高，故選擇上述5種成分進行實驗；考察了不同提取方法，最終采用甲醇回流蒸干→加水溶解→正丁醇萃取→水洗作為提取方法；比較了硅膠G預(yù)制薄層板、硅膠H預(yù)制薄層板、高效硅膠G預(yù)制薄層板 （青島海洋化工廠），發(fā)現(xiàn)對照品在硅膠G、硅膠H板上均不能完全分離，而在高效硅膠G板上有較好分離，主斑點清晰，故選擇其作為點樣薄層板；比較了不同展開系統(tǒng)，最終采用三氯甲烷-無水乙醇-水 （20∶20∶2）；比較了點樣2、 5、 8、 10 μL， 發(fā)現(xiàn)點樣 5 μL時斑點清晰可見，分離度良好，無拖尾現(xiàn)象；樣品放置24 h后點樣，發(fā)現(xiàn)斑點然清晰可見，表明穩(wěn)定性較好。溫度、濕度對人參皂苷類成分TLC定性鑒別的影響較大，兩者分別在20℃以下、低于50%時薄層層析結(jié)果穩(wěn)定，斑點清晰。

3.2 HPLC條件篩選 參考2015年版 《中國藥典》，分別放置過夜、1 h后再回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者無明顯區(qū)別，故確定提取方法為取樣后加甲醇靜置1 h，80℃水浴下回流2 h，此時供試品溶液提取充分，簡便易行；以出峰數(shù)、相鄰對照品色譜峰之間的分離度為主要指標(biāo)，優(yōu)化色譜柱、柱溫、流動相、梯度洗脫程序、檢測波長，最終確定“2.3.1” 項下色譜條件［20］。