龔道鋒， 王甫成， 紀(jì)東漢， 秦慧欣，3

（1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所，安徽亳州236800；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽亳州236800；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230031）

天花粉為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.或雙邊栝樓Trichosanthes rosthornii Harms的干燥根，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有清熱生津、消腫排膿的功效，常用于熱病煩渴、肺燥咳血、瘡瘍腫毒等癥［1-3］，主要含有氨基酸、蛋白質(zhì)、皂苷和糖類等有效成分［4-5］。

天花粉中大量的氨基酸類成分對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義［6-7］，但2015版 《中國(guó)藥典》 （一部）僅以瓜氨酸為指標(biāo)性成分進(jìn)行薄層色譜定性鑒別，測(cè)定成分單一，缺乏多指標(biāo)成分評(píng)價(jià)天花粉藥材質(zhì)量。同時(shí)通過(guò)調(diào)研發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)流通天花粉主要產(chǎn)地來(lái)源為安國(guó)和亳州，安國(guó)產(chǎn)天花粉價(jià)格較高，普遍認(rèn)為質(zhì)量較好，但缺乏相應(yīng)的研究支撐。據(jù)此，本研究建立柱前衍生HPLC法同時(shí)測(cè)定天花粉中15種游離氨基酸，并結(jié)合主成分分析評(píng)價(jià)安國(guó)和亳州天花粉的質(zhì)量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Angilent Technologies 1260 Infinity（美國(guó)安捷倫公司）；Ultimate Amino Acid柱 ［4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技 （上海）股份有限公司］；島津AU-220D電子天平 （十萬(wàn)分之一，上海菁海儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器 （昆山市超生儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州市鞏義華玉儀器廠）；PH計(jì) （數(shù)顯精度0.01，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.2 試藥 15種氨基酸 （批號(hào)140624-201506）分別為門(mén)冬氨酸 （Asp）、谷氨酸 （Glu）、絲氨酸（Ser）、 甘氨酸 （Gly）、 組氨酸 （His）、 精氨酸（Arg）、 丙氨酸 （Ala）、 脯氨酸 （Pro）、 酪氨酸（Tyr）、 纈氨酸 （Val）、 異亮氨酸 （Ile）、 亮氨酸（Leu）、 苯丙氨酸 （Phe）、賴氨酸 （Lys）、瓜氨酸（Cit） （中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈 （色譜純，默克股份兩合公司）；三水合乙酸鈉 （分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；NaOH（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有新公司）；冰乙酸 （分析純，aladdin）；三乙胺 （分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；異硫氰酸苯酯 （分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；正己烷 （色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為純化水。

實(shí)驗(yàn)用天花粉藥材來(lái)源于安國(guó)和亳州，由亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院劉耀武教授鑒定為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。信息見(jiàn)表1。

2 方法［8-13］與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精密稱取15種氨基酸對(duì)照品適量，加水超聲溶解，制備成各氨基酸含有量均為12.5 μmol／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。另精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1 mL，用純化水定容至5 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

2.2 供試品溶液制備 精密稱取24批天花粉樣品粉末各3 g置于錐形瓶中，加10 mL蒸餾水后封口，超聲處理30 min，離心機(jī)處理10 min，過(guò)濾，濾液用蒸餾水定容至10 mL，即得。

2.3 衍生化試劑制備 衍生化試劑A，量取異硫氰酸苯酯1.2 mL，加乙腈定容至100 mL，制成0.1 mol／L異硫氰酸苯酯乙腈溶液；衍生化試劑B，量取三乙胺14 mL，加乙腈定容至100 mL，制成1 mol／L三乙胺乙腈溶液。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.4 衍生化反應(yīng) 精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液和水各320 μL，分別加入衍生試劑A溶液200 μL，再加入衍生試劑B溶液200 μL，使其充分混合，室溫下反應(yīng)60 min，加入正己烷溶液800 μL，振蕩5～10 s后室溫靜置使其分層，精密量取下層200 μL溶液，加入800 μL的水混合均勻，再取200 μL加入800 μL水混合均勻，用孔徑為0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，即得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液和空白的衍生化溶液。

2.5 色譜條件 Ultimate Amino Acid色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相 A （乙腈 ∶水＝80∶20） -B （0.1 mol／L乙酸鈉溶液 ∶乙腈＝93∶7）， 梯度洗脫； 柱溫 40 ℃； 體積流量1.0 mL／min； 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm； 進(jìn)樣量10 μL。 洗脫程序見(jiàn)表2。色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

圖1 各樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of various samples

2.6 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品母液1 mL，分別加純化水定容至5、10、25、50、100 mL，制得各種不同濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 “2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生后測(cè)定，測(cè)定值以濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3，表明各氨基酸在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生后連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，測(cè)得各氨基酸峰色譜面積RSD 0.08%～3.09%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取23號(hào)樣品溶液，按 “2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得各氨基酸峰色譜面積RSD 0.33%～3.54%，表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 各氨基酸線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various amino acids

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取23號(hào)樣品5份，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.4”項(xiàng)下方法衍生化，進(jìn)樣，測(cè)得各氨基酸峰面積RSD 0.17%～0.68%，各氨基酸含有量RSD 0.29%～0.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量17號(hào)樣品，共5份，各約3 g，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液160 μL，再加入 160 μL氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 （0.011～0.954 mg／mL），按 “2.4” 項(xiàng)下方法衍生化，進(jìn)樣，計(jì)算各氨基酸的RSD值和回收率。測(cè)得各氨基酸平均回收率 88.42% ～105%，RSD 0.34%～1.89%。

2.11 樣品含有量測(cè)定 取24批天花粉樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.4”項(xiàng)下方法衍生化，在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各氨基酸含有量測(cè)定結(jié)果 （mg／g，n＝3）Tab.4 Results of content determination of various amino acids （mg／g， n＝3）

3 主成分分析

鑒于24批樣品中絲氨酸、組氨酸、酪氨酸、異亮氨酸等4種氨基酸檢出率較低，因此選擇天花粉中另外已檢測(cè)的11種氨基酸進(jìn)行分析。應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件中的降維-因子分析對(duì)24批樣品中11種氨基酸的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

3.1 主成分降維分析條件檢驗(yàn) 通過(guò)KMO和Bartelett球形度檢驗(yàn)，結(jié)果顯示KMO統(tǒng)計(jì)量＝0.634，Bartelett球形度檢驗(yàn)卡方統(tǒng)計(jì)量＝183.347，自由度＝55，P＝0.000小于0.05，適于因子分析。

3.2 主成分篩選及其貢獻(xiàn)率 通過(guò)主成分分析法提取11種氨基酸公因子方差，每種氨基酸信息提取率均大于0.6。主成分的特征值、貢獻(xiàn)率見(jiàn)表5，從表中可知，前4個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到85.018% （大于85%），因此選擇前4個(gè)主成分，代表了11種氨基酸含有量的全部信息。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

由表5可知主成分F1的特征根為4.648，方差貢獻(xiàn)率為42.257%，另外由表6數(shù)據(jù)顯示甘氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸在主成分F1上有較高載荷；同理，主成分 F2特征根為2.357，方差貢獻(xiàn)率為21.431%，主要反映了精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的指標(biāo)信息；主成分F3特征根為1.297，方差貢獻(xiàn)率為11.793%，主要反映谷氨酸的指標(biāo)信息；主成分F4特征根為1.049，方差貢獻(xiàn)率為9.537%，主要反映門(mén)冬氨酸、脯氨酸的指標(biāo)信息。

3.3 綜合主成分分析 用表6中的數(shù)據(jù)除以主成分相對(duì)應(yīng)的特征值開(kāi)平方根得到4個(gè)主成分中每個(gè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的系數(shù)向量，見(jiàn)表7。將得到的系數(shù)向量與標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，得出4個(gè)主成分表達(dá)式為

F1＝0.162Z1＋0.15Z2＋0.429Z3＋0.423Z4－0.112Z5＋0.369Z6＋0.272Z7＋0.401Z8－0.01Z9＋0.221Z10＋0.392Z11；F2＝－0.261Z1－0.408Z2－0.098Z3－0.05Z4＋0.438Z5＋0.03Z6－0.023Z7＋0.126Z8＋0.548Z9＋ 0.463Z10＋0.173Z11；

F3＝0.451Z1＋0.557Z2－0.165Z3＋0.165Z4＋0.421Z5－0.176Z6－0.408Z7＋0.033Z8＋0.192Z9＋0.032Z10＋0.136Z11；

表6 主成分載荷矩陣Tab.6 Principal components matrix

F4＝0.608Z1－0.206Z2－0.114Z3－0.113Z4＋0.354Z5＋0.158Z6＋0.574Z7－0.204Z8－0.09Z9＋0.033Z10－0.173Z11； 其中 F1～F4為 4個(gè)主成分；Z1～Z10分別為樣品中門(mén)冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸含有量的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)值。

以每個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重得到綜合主成分表達(dá)式為 F合＝0.497F1＋0.252F2＋0.139F3＋0.112F4；其中F合為綜合主成分。根據(jù)上述表達(dá)式計(jì)算主成分及綜合主成分得分見(jiàn)表8。

表7 主成分系數(shù)向量值Tab.7 Vector of principal component factors

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，亳州產(chǎn)地11個(gè)樣本的F合平均值為－0.688，安國(guó)產(chǎn)地13個(gè)樣本F合平均值為0.582。應(yīng)用SPSS 23.0對(duì)亳州、安國(guó)天花粉氨基酸綜合主成分F合進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，結(jié)果表明安國(guó)產(chǎn)地天花粉氨基酸綜合主成分F合明顯高于亳州產(chǎn)地，見(jiàn)表9。

表8 主成分與綜合主成分得分及排序Tab.8 Principal components and sort results of the samples

表9 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)Tab.9 t-test of independent sample

4 討論

劉文、潘健等［14-15］采用柱前衍生反高效液相色譜法分別對(duì)天花粉中瓜氨酸、γ-氨基丁酸和天門(mén)冬氨酸、谷氨酸含有量進(jìn)行了測(cè)定，提供了2種氨基酸同時(shí)定量分析方法。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)異硫氰酸苯酯與氨基酸反應(yīng)生成苯氨基硫甲酰氨基酸衍生物在245 nm處有較好的紫外吸收的原理，選用Amino Acid色譜分析專用柱，建立了柱前衍生高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定天花粉中15種游離氨基酸，分離度好。該方法穩(wěn)定性好、精密度高，為天花粉中多指標(biāo)氨基酸類成分含有量測(cè)定提供參考。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明24批樣品中均檢測(cè)出瓜氨酸、精氨酸，且兩種氨基酸平均含有量占氨基酸總量的86.26%。文獻(xiàn)表明［16］瓜氨酸在防治前列腺疾病，精氨酸在維持心血管正常功能以及肥胖、糖尿病（消渴癥）的治療中發(fā)揮重要作用，故瓜氨酸、精氨酸是天花粉發(fā)揮臨床藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此選取瓜氨酸、精氨酸考察天花粉藥材質(zhì)量，對(duì)提升現(xiàn)行《中國(guó)藥典》僅以瓜氨酸為定性分析的標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。

通過(guò)對(duì)天花粉中15種游離氨基酸進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明安國(guó)產(chǎn)地天花粉中游離氨基酸綜合主成分評(píng)分明顯高于亳州產(chǎn)地。在 《中國(guó)藥典》以氨基酸為指標(biāo)性成分的背景下，分析結(jié)果與安國(guó)天花粉價(jià)格遠(yuǎn)高于亳州產(chǎn)地的現(xiàn)狀存在一定的相關(guān)性，也反映出兩產(chǎn)地天花粉的質(zhì)量差異，為天花粉中藥臨床選用提供參考。