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(1.廣西百色農(nóng)業(yè)學(xué)校,廣西百色 533000;2.曲靖師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,云南曲靖 655011)

滇黃精(PolygonatumkingianumColl. et Hem-sl)是百合科(Liliaceae)黃精屬(PolygonatumMill.)植物,主產(chǎn)于云南,在四川、貴州、廣西等地也有分布,生長在海拔2000～3900 m的陰濕林地和灌木叢中。滇黃精是中藥黃精的3個基源品種之一[1]。黃精是我國傳統(tǒng)中藥之一,自古為藥食兼用,2012年國家衛(wèi)計委公布黃精既為食品又是藥品。它的治療和保健作用已被我國兩千多年的臨床實踐所證實,主要功效為降血糖、降血脂、預(yù)防動脈粥樣硬化、保護心腦血管、補益腎精、滋陰潤肺、增強免疫功能、延緩衰老、改善記憶功能、防止老年癡呆、抗抑郁、抗炎等[2-6]。

生黃精會刺激咽喉,導(dǎo)致口舌麻木,故需炮制后入藥或食用,以消除其刺激性,降低毒性,使其滋而不膩,同時增強其補脾潤肺益腎的作用[7-9]。黃精經(jīng)過炮制后,糖性變濃,質(zhì)地變軟,略帶甜味,易吸潮,口感變好,可直接食用或泡水飲用。目前對黃精炮制后成分研究,集中在主要活性成分黃精多糖、黃精低聚糖及皂苷方面[10-11]。黃精多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃球菌均具有明顯的抑制作用[12-13],是興奮免疫的主要活性成分[14-15],還具有顯著的抗骨質(zhì)疏松作用和抑制α-葡萄糖苷酶的作用[16-18]。黃精的營養(yǎng)價值十分豐富,近年來在保健食品等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用逐漸增加[19],受到食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。滇黃精炮制宜直接蒸制加工成飲片[20],其工序短成本低,易推廣,為此本文研究了蒸制滇黃精的時間對色澤、可溶性成分、還原糖、葡萄糖、粗多糖的影響,同時試驗了模擬胃腸道環(huán)境后糖的變化情況,為炮制和深入開發(fā)功能性黃精產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滇黃精 云南曲靖市煜欣農(nóng)林生物科技有限公司藥材種植基地提供;胃蛋白酶 豬胃粘膜,Potency:1∶3000,USP,南京都萊生物技術(shù)有限公司;胰酶粉 Potency:1∶4000,BR,上海瑞永生物科技有限公司;葡萄糖、苯酚等試劑均為分析純。

TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;AL204-IC電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LD-4臺式離心機 常州天瑞儀器有限公司;QL-866漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;PS-40超聲波儀 深圳市超藝達科技有限公司;WHY-2往返水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市大地自動化儀器廠;DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;202-0恒溫干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;LC-ZFG002蒸飯柜 廣東樂創(chuàng)電器有限公司;安穩(wěn)免調(diào)碼血糖儀 三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 干燥及蒸制 新鮮滇黃精清洗干凈,切片(厚度約2 mm),日曬干燥,混勻,得滇黃精干片。取干片約500 g,粉碎,過80目篩,在105 ℃干燥箱中烘至恒重,得未蒸制檢測樣,放于干燥器中備用。取干片約2.5 kg,加入約5 kg純水,間隔約30 min翻動一次,吸完水后,放入蒸飯柜進行蒸制。蒸制到12、24、48、72、96 h時，混勻后分別取出約500 g，在105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干,粉碎,過80目篩,再在恒溫干燥箱中烘至恒重,得蒸制不同時間的檢測樣,放于干燥器中備用。

1.2.2 色澤試驗 分別準(zhǔn)確稱取1 g檢測樣,分別置于100 mL容量瓶中,加入50 mL純水,放入沸水浴中1 h,再放入240 W超聲儀中超聲處理20 min,冷卻定容,過濾(前約10 mL棄之),取0.5 mL濾液再定容到10 mL容量瓶,于200～600 nm掃描,確定最大吸光波長,同時檢測最大吸光波長下的吸光度和284 nm波長下的吸光度。

1.2.3 可溶性成分的檢測 參照GB 5009.3-2016。

醇可溶性成分含量的檢測:精密稱取3 g檢測樣,置于50 mL離心管中,加入80% vol乙醇30 mL,旋渦振蕩3 min,放入240 W超聲儀中超聲30 min,取出后離心15 min(4500 r/min),清液中含醇可溶性成分。不溶物再加入80%vol乙醇同法重復(fù)提取3次,合并乙醇清液到已在105 ℃恒重的150 mL燒杯中,放入70 ℃鼓風(fēng)干燥箱中除去乙醇后,再放入105 ℃恒溫干燥箱中烘至恒重,計算80% vol乙醇可溶性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

水可溶性成分含量的檢測:上段中得到的醇提不溶物用40 mL純水代替80% vol乙醇30 mL同法提取、除水、冷卻、稱重,直至恒重,得到水可溶性成分,計算水可溶性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。計算公式:

可溶性成分的含量(%)=[恒重后燒杯和可溶性成分的質(zhì)量(g)-恒重?zé)馁|(zhì)量(g)]/原料質(zhì)量(g)×100

殘渣含量的檢測:水提取后的不溶物轉(zhuǎn)入到105 ℃恒重后的稱量瓶中,在105 ℃干燥箱中烘至恒重,計算殘渣占檢測樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

試驗精密度為在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。結(jié)果取兩次獨立檢測結(jié)果的平均值。

1.2.4 淀粉、糊精的檢測 在50 mL離心管中稱取1.0 g未蒸制檢測樣干粉加水25 mL,沸水浴中加熱15 min,離心10 min(4500 r/min),取清液10 mL,加入1 d碘溶液搖勻,觀察是否有淀粉或糊精與碘溶液反應(yīng)后呈現(xiàn)的藍色或紅色。

1.2.5 葡萄糖、還原糖的檢測 精密稱取1 g檢測樣干粉,置于10 mL容量瓶,加約8 mL純水,超聲處理10 min,純水定容,用安穩(wěn)免調(diào)碼血糖儀檢測葡萄糖含量,精密度為在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%,平均值為檢測結(jié)果。

精密稱取1～1.5 g檢測樣干粉,置于250 mL容量瓶中,加50 mL純水,置于240 W超聲儀中超聲15 min,緩慢加入0.03% vol乙酸溶劑配制成的0.219 g/mL乙酸鋅溶液5 mL和0.106 g/mL的亞鐵氰化鉀溶液5 mL,加純水至刻度,混勻,靜置30 min,用濾紙過濾,棄去初濾液約10 mL,取后續(xù)濾液按照GB5009.7-2016中第一法檢測和計算還原糖含量。精密度為在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的5%,平均值為檢測結(jié)果。

1.2.6 模擬胃、腸道環(huán)境后葡萄糖、還原糖的檢測 參照文獻[21],精密稱取0.5～1 g待檢測樣干粉(未蒸制、蒸制12 h的稱0.8～1 g,蒸制24、48、72、96 h的稱0.5～0.8 g),置于100 mL組培瓶(稱重)中,加入人工胃液9 mL(人工胃液:取稀鹽酸16.4 mL(約2 mol/L),加水稀釋成1000 mL,加入胃蛋白酶10 g,搖勻后,即得)放入37 ℃的搖床水浴1 h取出。用濃度為0.5%的氫氧化鈉溶液調(diào)整pH=6.8后,加入人工腸液9 mL(取磷酸二氫鉀3.4 g,加水250 mL使溶解,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8;加水稀釋至500 mL,加入胰酶5 g,即得)。放入37 ℃的搖床,水浴1 h取出,補充水到50.00 g(除去組培瓶質(zhì)量)。用血糖儀檢測葡萄糖的含量。沒有加樣品的為空白,同法同步操作檢測葡萄糖含量,計算扣除。

同上述方法模擬胃、腸道環(huán)境處理后轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶,再同1.2.5中還原糖的檢測方法檢測還原糖含量。沒有加樣品的為空白,同法同步操作檢測還原糖,計算扣除。檢測精密度同1.2.5中要求。

1.2.7 粗多糖的檢測 參照SN/T 4260-2015中的方法,以每毫升葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)(μg),吸光度(A)為縱坐標(biāo),制定標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程:Y=0.0096X-0.0065,R2=0.9999。

1.2.7.1 測定液的制備 精密稱取0.5 g檢測樣,置于50 mL的離心管中,加純水5 mL旋渦振蕩使之充分分散潤均,然后加入20 mL無水乙醇(此時乙醇濃度為80% vol),旋渦振蕩5 min,然后放置于140 W的超聲儀中,超聲30 min后取出離心15 min(4500 r/min),不溶物加入80%vol乙醇15 mL同法旋渦振蕩分散、超聲、離心,不溶物再同法重復(fù)一次。不溶物用水洗出轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中,加水約至200 mL。然后放置于140 W的超聲儀中,超聲30 min,加水定容,濾紙過濾(初濾液10 mL棄之),得樣品測定液。

1.2.7.2 回收率檢測液的制備 分別精密稱取0.5 g蒸制12、48 h的檢測樣,同上述測定液處理方法操作,操作至不溶物用水洗出轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶后再在容量瓶中加入精密稱取的標(biāo)樣葡萄糖0.05 g,加水約至200 mL,然后超聲、定容、過濾(初濾液10 mL棄之),得回收率測定液。

1.2.7.3 回收率檢測確定空白樣 取蒸制12 h測定液各1 mL,分別置于20 mL具塞試管中按SN/T 4260-2015標(biāo)準(zhǔn)中“比色測定”進行檢測,空白樣分別采用純水、1.0 mL純水代替1.0 mL 5%的苯酚、1.0 mL純水代替1.0 mL測定液、5.0 mL純水代替硫酸、測定液1.0 mL加純水6.0 mL進行空白樣的考查?？瞻讟硬捎门c測定液相同的步驟平行進行處理后使用。分別計算葡萄糖含量。蒸制48 h的同法檢測考查空白樣。

取回收率測定液各1 mL,分別置于20 mL具塞試管中同測定液試驗方法進行檢測。通過使用上述中不同空白樣的檢測結(jié)果計算葡萄糖的回收率,從而確定最佳的空白樣。

1.2.7.4 粗多糖的檢測 取1 mL樣品測定液于20 mL具塞試管中按SN/T 4260-2015標(biāo)準(zhǔn)中“比色測定”進行檢測。未蒸制和蒸制12 h的空白樣用1.0 mL純水代替1.0 mL測定液,其余的空白樣則用1.0 mL純水代替1.0 mL 5%的苯酚,空白樣與試樣的測定平行進行,采用相同的分析步驟。檢測精密度控制在重復(fù)性條件下的兩次獨立檢測結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值的10%,平均值為檢測結(jié)果。

粗多糖計算公式:

注:W為粗多糖含量(g/100 g);m1為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算得到的糖量(μg);m2為樣品質(zhì)量(g);V1為樣品定容體積(mL);V2為比色測定所移取樣品測定液的體積(mL);0.9為葡萄糖換算成粗多糖的校正系數(shù)(計算回收率時用葡萄糖計,不乘0.9)。

1.2.7.5 模擬胃腸道環(huán)境后粗多糖的檢測 分別精密稱取0.2～0.5 g(未蒸制、蒸制12 h的精密稱0.2～0.3 g,蒸制24、48、72、96 h的精密稱0.3～0.5 g)待檢測樣于50 mL離心管中,同1.2.6的方法和步驟進行胃、腸道模擬過程,其中加入的人工胃液、人工腸液修改為3 mL。模擬胃、腸環(huán)境后在離心管中加入80% vol乙醇28 mL,旋渦振蕩混勻后置于140 W超聲儀中超聲30 min,取出離心15 min(4500 r/min),不溶物加入80% vol乙醇15 mL旋渦混勻后超聲處理10 min,取出離心15 min(4500 r/min),不溶物再同法重復(fù)一次。不溶物用50～100 mL水洗出轉(zhuǎn)移到250 mL錐形瓶中,以下步驟按SN/T 4260-2015中“比色測定”檢測粗多糖?？瞻讟?、精密度同上述粗多糖的檢測。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 檢測數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 21進行蒸制不同時間(同一列內(nèi))可溶性成分、糖含量的t檢驗分析。用Excel中無重復(fù)雙因素方差分析,模擬胃腸道環(huán)境前后(列間)的差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 色澤試驗結(jié)果與討論

黃精色澤隨蒸制時間的延長而變深,蒸制48 h后的黃精干片肉眼難以區(qū)分色澤差,見圖1。處理液通過紫外掃描比較,蒸制12 h后各樣品最大吸光度的波長向長波移動,蒸制12 h最大吸光度波長為279.5 nm,蒸制96 h為286.5 nm,吸光度值與蒸制時間成線性關(guān)系,表1中λmax的線性方程為y=0.0164x+0.1725(y為吸光度,x為蒸制時間),R2=0.9934,說明長波呈色物質(zhì)的含量隨蒸制時間的延長而增加。黃精蒸制會產(chǎn)生5-羥甲基糠醛,有報道5-羥甲基糠醛是一種對身體有害的物質(zhì)[22],但也有報道5-羥甲基糠醛在治療疾病藥物中的應(yīng)用[23-25]。5-羥甲基糠醛會進一步反應(yīng)生成一些結(jié)構(gòu)不明的黑色素(類黑精)[26],有研究表明黃精炮制后得到的類黑精類成分具有較好的抗氧化活性,有益腎、健脾的作用,增加了功能性成分的含量,增強了生理作用[27],文獻報道5-羥甲基糠醛在284 nm波長下具有非常好的線性關(guān)系[28],所以比較284 nm處吸光度值可說明生成5-羥甲基糠醛的變化。表1中λ(284 nm)的線性方程為y=0.0161x+0.1713(y為吸光度,x為蒸制時間),R2=0.9933。由此表明蒸制時間越長生成的長波呈色物質(zhì)越多,5-羥甲基糠醛也越多。從生理功能方面評價,蒸制時間的延長是有益的。

圖1 蒸制不同時間黃精色澤比較Fig.1 The color of Polygonatum kingianumof various streaming time

表1 色澤檢測結(jié)果Table 1 The results of color detection

2.2 可溶性成分含量檢測結(jié)果與討論

80%vol乙醇可溶解單糖、低聚糖、色素、氨基酸等。水可溶解粗多糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等。了解可溶性成分與蒸制時間的關(guān)系,對指導(dǎo)黃精炮制和產(chǎn)品開發(fā)有積極的意義。由表2可知,乙醇可溶性成分與水溶性成分含量隨蒸制時間的延長呈現(xiàn)相反的對應(yīng)關(guān)系。蒸制24、48 h乙醇可溶性成分最多,超過70%,蒸制12、24 h的差異極顯著(p<0.01),蒸制24、48 h的差異不顯著(p>0.05)。未蒸制的水溶性成分最高,蒸制導(dǎo)致水溶性成分先減少后增加,未蒸制到蒸制12 h時減少約7%,蒸制12～48 h繼續(xù)減少約15%,變化極顯著(p<0.01),蒸制24、48 h水溶性成分最少,低于10%,兩者之間差異不顯著(p>0.05),蒸制到72 h水提取物增加顯著(p<0.05)。醇、水不溶性殘渣在蒸制12 h時含量最高,差異極顯著(p<0.01)。繼續(xù)蒸制到24 h殘渣含量下降,差異極顯著(p<0.01),再繼續(xù)蒸制到48 h差異變化不顯著(p>0.05)。由表2可知需得到醇溶性成分高的滇黃精產(chǎn)品,蒸制時間應(yīng)控制在24～48 h,需得到水溶性成分多的產(chǎn)品不應(yīng)蒸制。蒸制會造成成分損失,由表2可知殘渣含量多,總質(zhì)量則相對低,蒸制時間對總質(zhì)量變化影響不顯著(p>0.05),通過乙醇提取物、水溶性提取物、殘渣和總質(zhì)量的考查可推測揮發(fā)性成分的變化情況,蒸制導(dǎo)致總質(zhì)量減少的原因有待深入研究。

表2 蒸制不同時間黃精可溶物及殘渣含量的檢測結(jié)果Table 2 The content results of soluble substance and residue of Polygonatum kingianum with various steaming time

2.3 葡萄糖、還原糖、淀粉、糊精、粗多糖檢測結(jié)果與討論

2.3.1 葡萄糖 糖尿病主要是遺傳和不良生活習(xí)慣導(dǎo)致的內(nèi)分泌疾病,是由于胰島素缺乏或者胰島功能受損,以及肝臟、骨骼肌、脂肪等靶組織對葡萄糖的攝取量減少,而引發(fā)的一系列以高血糖為特征的代謝紊亂綜合癥[29]。目前控制糖尿病的方法主要采用注射胰島素和控制葡萄糖的攝入量。如果功能性成分能增加胰島素的產(chǎn)生或降低腸道對葡萄糖的吸收，就可達到控制高血糖病癥的目的。由表3可知,蒸制48 h內(nèi)葡萄糖增加較快,從12～48 h,變化極顯著(p<0.01)。蒸制48 h后葡萄糖含量下降,原因可能是葡萄糖生成黑色素等成分所致。生黃精及其炮制品中含有小分子蔗糖和由半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖和葡萄糖組成的多糖[30-31],模擬胃腸道環(huán)境后可能產(chǎn)生葡萄糖。試驗表明模擬胃腸道環(huán)境后葡萄糖含量有所增加,但與未蒸制的組間比較變化不顯著(p=0.08)。蒸制96 h滇黃精再模擬胃腸道環(huán)境后的葡萄糖達到7.33%,與沒有蒸制的比較增加約7%,與未模擬胃腸道的比較增加約3.8%,但葡萄糖含量相比其他常見食材則要低很多[21],說明滇黃精加工的食品是糖尿病人的理想選擇。

表3 糖含量的檢測結(jié)果Table 3 The content results of sugar with various steaming time

2.3.2 還原糖 蒸制導(dǎo)致還原糖含量先增加后減少。蒸制到48 h還原糖含量達到最高47.84%,與沒有蒸制的比對增加約20倍,蒸制后還原糖含量變化都極顯著(p<0.01)。蒸制48 h后還原糖含量逐漸下降,減少原因可能是還原糖轉(zhuǎn)化為類黑精或揮發(fā)性成分所致。模擬胃腸道環(huán)境前后兩組間差異顯著(p=0.02),變化規(guī)律基本相同。

2.3.3 淀粉和糊精 檢測結(jié)果表明滇黃精中不含淀粉或糊精,符合SN/T4260中規(guī)定檢測粗多糖不能含淀粉、糊精的要求。有相關(guān)報道黃精中含淀粉[32],可能是其它品種的黃精。

2.3.4 粗多糖 黃精蒸制后呈現(xiàn)褐色,導(dǎo)致粗多糖樣品測定液有顏色,為此選擇蒸制12 h(色澤較淺)和蒸制48 h(色澤較深)檢測樣進行回收率的考查。用考查回收率的方法確定最佳使用的空白樣?？瞻撞捎眉兯?、1.0 mL純水代替1.0 mL 5%的苯酚、1.0 mL純水代替1.0 mL測定液、測定液1 mL加純水6 mL、5.0 mL純水代替硫酸。蒸制48 h黃精樣品中葡萄糖的平均回收率分別為107.22%、100.28%、104.89%、107.24%、107.21%,平均回收率RSD分別為2.62%、2.79%、2.74%、2.68%、2.67%。蒸制12 h黃精樣品葡萄糖的平均回收率分別為91.03%、90.69%、95.35%、91.04%、91.09%,平均回收率RSD分別為0.15%、0.15%、0.10%、0.15%、0.06%。為此最合理的空白選擇是,測定液顏色較深(蒸制24 h后)的應(yīng)選擇用1 mL水代替苯酚作為空白,未蒸制及蒸制12 h顏色淺的應(yīng)選擇1 mL水代替樣品作為空白。

有文獻報道滇黃精中黃精多糖含量最高7.265%,最低為3.124%,云南蒙自市、保山縣產(chǎn)的滇黃精中多糖含量分別為5.787%、3.124%[33],檢測結(jié)果表明云南曲靖市產(chǎn)的滇黃精粗多糖為7.37%,含量較高。

蒸制到12 h，粗多糖從7.37%增加到9.73%,變化顯著(p<0.05),繼續(xù)蒸制粗多糖含量快速降低,從蒸制12～24 h粗多糖含量下降到4.26%,變化極顯著(p<0.01)。蒸制24 h后隨蒸制時間的延長粗多糖含量變化不顯著(p>0.05),基本保持穩(wěn)定。多糖含量減少,主要是因為黃精中的糖類成分和氨基酸多肽蛋白類成分在高溫下發(fā)生了十分復(fù)雜的美拉德反應(yīng)所致[27]。模擬胃腸道環(huán)境前后粗多糖的組間差異性不顯著(p=0.18)。因此說明如果要在腸道中有更多具有降血糖功能性的粗多糖[19,34],則黃精的蒸制時間不宜超過12 h。

3 結(jié)論

滇黃精蒸制時間越長色澤越深、5-羥甲基糠醛越多,需要得到益腎、健脾功效的產(chǎn)品建議增加蒸制時間。蒸制48 h黃精可溶性成分及還原糖含量較高,是開發(fā)飲品類產(chǎn)品的好選擇。蒸制會導(dǎo)致黃精粗多糖含量顯著降低(p<0.05),如果開發(fā)粗多糖功效方面的產(chǎn)品蒸制時間應(yīng)控制在12 h內(nèi)。蒸制會導(dǎo)致供腸道吸收葡萄糖含量增加,但總量比其它常見食材的低。研究結(jié)果可供滇黃精的炮制和開發(fā)相關(guān)功能性產(chǎn)品提供蒸制時間的參考。