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(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330045;2.江西特色林木資源培育與利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心,江西南昌 330045;3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,江西南昌 330045)

α-葡萄糖苷酶是一類(lèi)糖類(lèi)外切酶,位于小腸的刷狀邊緣上,在體內(nèi)碳水化合物的消化和吸收中起著重要作用[1],是影響餐后血糖的關(guān)鍵酶,而α-葡萄糖苷酶抑制劑可以延緩腸道碳水化合物吸收而控制餐后血糖升高,因此,α-葡萄糖苷酶抑制劑被廣泛地應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的防治[2-3]。目前臨床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等。這些抑制劑能較好地控制餐后血糖升高,但長(zhǎng)期服用會(huì)引起腹瀉、腹脹等副作用,因而限制了其使用[4],開(kāi)發(fā)新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

齊墩果酸(OA)是一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物,廣泛存在于人參、甘草、三七等植物中,具有多種生物活性,如抗HIV[5]、抗癌[6-7]、抗菌[8]、降血糖[9-10]、抗炎[11]等。趙昱等[12]的研究表明,天然的和經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾的五環(huán)三萜類(lèi)化合物有一定的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾是發(fā)掘新型α-葡萄糖苷酶抑制劑的重要途徑,OA是一個(gè)很好的先導(dǎo)化合物,其能抑制小腸上皮的α-葡萄糖苷酶,但由于其水溶性差影響了作用效果[13],對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾有望獲得活性更好的α-葡萄糖苷酶抑制劑。目前,針對(duì)OA抑制α-葡萄糖苷酶活性的結(jié)構(gòu)修飾主要是對(duì)C-28、C-3和雙鍵進(jìn)行的,其中對(duì)C-28位的修飾主要形成是酯鍵和酰胺鍵[14],Nie等[15]在C-3和C-28位同時(shí)引入肉桂酰胺衍生物,得到了數(shù)個(gè)活性較強(qiáng)的衍生物,但在C-28位引入哌嗪進(jìn)行修飾,活性卻降低了;李文良等[16]在氨基酸和齊墩果酸之間引入一定長(zhǎng)度的碳鏈,活性測(cè)試表明,當(dāng)氨基酸連接較多親水基團(tuán)時(shí),抑制α-葡萄糖苷酶的活性有明顯提高。

陳玉華等[17]的研究結(jié)果表明,1-DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶具有很好的抑制作用,其水溶性高,但結(jié)構(gòu)上與葡萄糖非常相似,在體內(nèi)吸收速度快,很快地被代謝,因此體內(nèi)抑制餐后血糖升高的效果一般[18]。為提高OA對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果,本文在其分子結(jié)構(gòu)中引進(jìn)了另一個(gè)活性基團(tuán)——1-DNJ。針對(duì)OA和1-DNJ的特點(diǎn),基于拼接原理,通過(guò)2～6個(gè)碳長(zhǎng)的連接橋,在OA的C-28上引入了1-DNJ活性基團(tuán),合成了OA系列衍生物(OADs),研究了不同長(zhǎng)度的碳鏈連接橋?qū)ζ湟种苹钚缘挠绊?并據(jù)此探討了此類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)與α-葡萄糖苷酶之間的構(gòu)效關(guān)系,以期為新型α-葡萄糖苷酶抑制劑的研發(fā)提供思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase,EC3.2.1.20)、4-硝苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nortiphenyl-α-D-gluocpynoaside,PNPG)、對(duì)硝基苯酚(4-Nitrophenol) Sigma公司;阿卡波糖(Acarbose) 索萊寶公司;1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷、1,4-二溴丁烷、1,5-二溴戊烷、1,6-二溴己烷 天津希恩斯奧普德科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 西隴化工股份有限公司;其它藥品和試劑 均為分析純或化學(xué)純,所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

YM-10型Microcon超濾管 美國(guó)Millipore公司；Varian VNMR 500 MHz核磁共振儀 布魯克科技有限公司(TMS為內(nèi)標(biāo),氘代DMSO為溶劑);Finnigan Trace Ms質(zhì)譜儀 日本島津公司;Electrothermal數(shù)字熔點(diǎn)儀 北京泰克儀器有限公司;SpectraMax M2型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OADs的合成 合成路線圖如圖1所示。

圖1 齊墩果酸衍生物的合成路線Fig.1 Synthesis procedure of OADs

1.2.1.1 OADs中間產(chǎn)物1a～1e的合成 1a利用Cheng等[19]和Liu等[20]的方法合成,在100 mL的圓底燒瓶中加入2.28 g(5 mmol)齊墩果酸、1.38 g(10 mmol)碳酸鉀和50 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF),在室溫下攪拌30 min,再加入1.87 g(10 mmol)1,2-二溴乙烷,反應(yīng)液在室溫下攪拌12 h,反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液倒入水中,用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取,合并有機(jī)相,無(wú)水硫酸鈉干燥,脫溶拌樣,硅膠柱層析分離(洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯=20∶1)得到化合物1a。

在化合物1b～1e的合成中,將1,2-二溴乙烷分別換成 1,3-二溴丙烷、1,4-二溴丁烷、1,5-二溴戊烷、1,6-二溴己烷,其他步驟與1a相同。

1.2.1.2 OADs目標(biāo)化合物2a～2e的合成 在100 mL的圓底燒瓶中加入2.82 g(5 mmol)中間體1a、1.38 g(10 mmol)碳酸鉀、0.978 g(6 mmol)1-DNJ和50 mL N,N-二甲基甲酰胺,反應(yīng)液在50 ℃條件下攪拌12 h,反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液倒入水中,用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,合并有機(jī)相,無(wú)水硫酸鈉干燥,脫溶拌樣,硅膠柱層析分離(洗脫劑二氯甲烷/甲醇=20∶1)得到化合物2a。

在化合物2b～2e的合成中,將中間體1a分別換成1b、1c、1d、1e,其他步驟與2a相同。

1.2.2 OADs的結(jié)構(gòu)表征 所合成的所有中間化合物及目標(biāo)化合物均通過(guò)1H NMR、13C NMR和HRMS波普技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與表征，其中HRMS以甲醇為溶劑，1H NMR、13C NMR以TMS為內(nèi)標(biāo)，氘代DMSO為溶劑。

1.2.3 目標(biāo)化合物體外對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性及抑制動(dòng)力學(xué)檢測(cè)方法

1.2.3.1 PNP標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定曲線的制作 以磷酸緩沖液(PB)(pH6.8)配制一定濃度的對(duì)硝基苯酚(PNP)標(biāo)準(zhǔn)溶液,取不同體積加入到96孔板中,隨后每孔加入β-巰基乙醇溶液(1.5 μL,1.4 mol/L),再用PB補(bǔ)足至200 μL,得0、0.15、0.03、0.06、0.15、0.3、0.6、1.5、0.8、3、6、12、24、48、96(×10-6mmol)系列標(biāo)準(zhǔn)濃度,每一濃度設(shè)置3個(gè)平行,于λ=405 nm下測(cè)定吸光度值[21]。以O(shè)D值A(chǔ)λ=405 nm為橫坐標(biāo),PNP物質(zhì)的量n(×10-6mmol)為縱坐標(biāo),繪制測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為:y=77.218x,決定系數(shù)為:R2=0.9998。

1.2.3.2 目標(biāo)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶體外抑制活性檢測(cè) 采用微量α-葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)體系檢測(cè)模型[21],對(duì)系列目標(biāo)化合物進(jìn)行活性篩選,以O(shè)A和阿卡波糖為對(duì)照。具體操作如下:依次往各反應(yīng)孔中加入PB(158.5 μL,0.1 mmol/L,pH6.8)、β-巰基乙醇溶液(1.5 μL,1.4 mol/L)、α-葡萄糖苷酶(10 μL,1 U/mL),所需測(cè)定活性的樣品10 μL,混勻后置于37 ℃水浴中孵育20 min,隨后加入PNPG(20 μL,10 mmol/L),37 ℃水浴加熱5 min,在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,每個(gè)樣品濃度重復(fù)3次。待測(cè)樣品濃度設(shè)置0.75、0.5、0.25、0.1、0.05 mmol/L 5個(gè)水平,同時(shí)設(shè)置空白組(不添加抑制劑,用PB替代)。

1.2.3.3 目標(biāo)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)測(cè)定 采用微量α-葡萄糖苷酶-PNPG檢測(cè)模型進(jìn)行測(cè)定,將底物濃度設(shè)置為0.1、0.2、0.8、1、1.2、1.6、1.8、2、2.5、5 mmol/L,反應(yīng)時(shí)間為5 min,抑制劑濃度為0.25 mmol/L,測(cè)定α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)速度(每分鐘生成PNP的量)。采用Origin 8.4軟件,以S(底物濃度)為自變量、V(反應(yīng)速度)為因變量進(jìn)行非線性擬合,計(jì)算表觀Vmax和表觀Km。

1.2.4 分子對(duì)接方法 在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中,搜索來(lái)源于酵母的α-葡萄糖苷酶(PDB ID:2f6d),以Sybyl 2.0軟件來(lái)生成2b和阿卡波糖的初始結(jié)構(gòu),并運(yùn)用tripos力場(chǎng)和Gasteiger-marsili電荷優(yōu)化分子的幾何結(jié)構(gòu)。以AutoDock 4.2軟件對(duì)模建的α-葡萄糖苷酶與2b和阿卡波糖進(jìn)行分子對(duì)接。

根據(jù)ΔG=ΔH-TΔS公式進(jìn)行計(jì)算,其中ΔG表示結(jié)合自由能,用來(lái)評(píng)估配體-受體間的結(jié)合強(qiáng)度[22];ΔS表示在形成復(fù)合物過(guò)程中體系的熵變;ΔH表示配體-受體間的相互作用能,包括氫鍵作用、靜電作用、范德華力。

2 結(jié)果與分析

2.1 OADs中間產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物的合成及表征

本文嘗試以K2CO3為堿,DMF為溶劑,通過(guò)溴取代反應(yīng)擬在C-3號(hào)位引入不同長(zhǎng)度碳鏈合成目標(biāo)物,但經(jīng)1H NMR分析,發(fā)現(xiàn)C-3位的羥基還在,后又對(duì)反應(yīng)的堿和溶劑兩個(gè)重要條件進(jìn)行了改變,分別選擇了Na、NaH、Cs2CO3,和DMF、THF、丙酮、1,4-二氧六環(huán)四種溶劑進(jìn)行反應(yīng),經(jīng)1H NMR分析,均未能在C-3位羥基引入不同長(zhǎng)度的碳鏈,卻發(fā)現(xiàn)在C-28位羧基引入了碳鏈,可能是由于C-28位的羧基比C-3位的羥基更活潑,隨后,用芐基對(duì)羧基進(jìn)行保護(hù),以K2CO3為堿,DMF為溶劑,還是未能在C-3引入碳鏈,最后,選擇K2CO3為堿,DMF為溶劑,在C-28位引入碳鏈。在中間體1a～1e合成目標(biāo)產(chǎn)物的過(guò)程中,開(kāi)始最初以80 ℃的條件進(jìn)行反應(yīng),發(fā)現(xiàn)無(wú)新產(chǎn)物生成,后嘗試室溫下反應(yīng),也未發(fā)現(xiàn)有新產(chǎn)物生成,最后以50 ℃為反應(yīng)溫度,得到目標(biāo)產(chǎn)物,推測(cè),可能是在堿性條件下,溫度過(guò)低使得原料不反應(yīng),溫度過(guò)高導(dǎo)致酯鍵水解斷裂。

分別采用1H NMR、13C NMR 和HRMS對(duì)5個(gè)OADs中間體和5個(gè)OADs目標(biāo)化合物進(jìn)行表征,目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)如圖2,經(jīng)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,所有化合物的分子量均能匹配到,以化合物2a為例,在正離子模式下,所測(cè)相對(duì)分子量與計(jì)算值相差1,可以確定分子式正確,與齊墩果酸的氫譜數(shù)據(jù)相比較[23],δ4.3左右的羥基峰、δ5.20處峰對(duì)應(yīng)的雙鍵、1.09(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,H-27),0.88(6H,s,H-30,H-26),0.85(3H,s,H-29),0.68(3H,s,H-24),0.66(3H,s,H-25)處峰對(duì)應(yīng)的7個(gè)甲基峰均未消失,而δ 11.94左右的羧基峰消失,且δ 3.96(2H,s)、δ 2.85-2.73(2H,m)多出兩個(gè)-CH2-峰,說(shuō)明,碳鏈連接到了羧基上,在δ 4.75(2H,br s)處多了一個(gè)寬峰,說(shuō)明有活潑氫原子出現(xiàn),可能是1-DNJ上的活潑氫,證實(shí)化合物結(jié)構(gòu)正確,結(jié)果如下。

圖2 OADs目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The structures of target OADs

1a:白色固體,得率為90%,熔點(diǎn)為161～163 ℃。HRMS(ESI)m/z:563.3090[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.20(1H,s,H-12),4.75(2H,br s,H-34,H-36),4.65(1H,s,H-38),4.29(1H,s,-OH),4.10(1H,s,H-35)3.81(2H,d,J=9.5 Hz,H-31),2.77(2H,d,J=10.3 Hz,H-32),1.09(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,H-27),0.88(6H,s,H-30,H-26),0.85(3H,s,H-29),0.68(3H,s,H-24),0.66(3H,s,H-25);13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 176.75(C-28),143.63(C-13),122.57(C-12),77.28(C-3),64.19(C-31),55.26(C-5),47.52(C-9),46.65(C-17),45.81(C-19),41.70(C-14),41.34(C-18),39.40(C-8),38.85(C-1),38.57(C-4),37.03(C-10),33.64(C-21),33.21(C-29),32.84(C-7),32.52(C-22),30.84(C-20),28.69(C-23),27.76(C-15),27.64(C-32),27.43(C-2),26.07(C-27),23.81(C-30),23.41(C-16),22.96(C-11),18.47(C-6),17.18(C-26),16.49(C-25),15.57(C-24)。

1b:白色固體,得率為88%,熔點(diǎn)為146～148 ℃。HRMS(ESI)m/z:577.3235[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.20(1H,t,J=3.3 Hz,H-12),4.28(1H,s,-OH),4.13-3.95(2H,m,H-31),3.62-3.46(2H,m,H-33),3.00(1H,dd,J=10.0,5.6 Hz,H-3),1.10(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,CH3-27),0.89(6H,s,CH3-30,CH3-26),0.85(3H,s,CH3-29),0.68(3H,s,CH3-24),0.68(3H,s,CH3-25).13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 176.90(C-28),143.90(C-13),122.43(C-12),77.27(C-3),62.10(C-31),55.25(C-5),47.53(C-9),46.61(C-17),45.80(C-19),41.74(C-14),41.46(C-18),39.35(C-8),38.85(C-1),38.56(C-4),37.03(C-10),33.63(C-21),33.22(C-29),32.84(C-7),32.51(C-22),31.70(C-33),30.84(C-20),28.69(C-23),27.76(C-15),27.57(C-32),27.43(C-2),26.08(C-27),23.82(C-30),23.45(C-16),23.02(C-11),18.47(C-6),17.29(C-26),16.48(C-25),15.56(C-24)。

1c:白色固體,得率為85%,熔點(diǎn)為132～134 ℃。HRMS(ESI)m/z:591.3393[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.20(1H,t,J=3.3 Hz,H-12),4.28(1H,s,-OH),3.98(2H,t,J=6.2 Hz,H-31),3.54(2H,t,J=6.8 Hz,H-34),3.00(1H,dd,J=9.4,5.5 Hz,H-3),1.10(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,CH3-27),0.89(6H,s,CH3-30,CH3-26),0.86(3H. s,CH3-29),0.68(3H,s,CH3-24),0.67(3H,s,CH3-25).13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 176.99(C-28),143.91(C-13),122.42(C-12),77.28(C-3),63.45(C-31),55.25(C-5),47.53(C-9),46.53(C-17),45.88(C-19),41.72(C-14),41.39(C-18),39.37(C-8),38.85(C-1),38.55(C-4),37.05(C-10),34.88(C-34),33.65(C-21),33.22(C-29),32.84(C-7),32.58(C-22),30.84(C-20),29.72(C-33),28.69(C-23),27.77(C-15),27.56(C-32),27.39(C-2),26.09(C-27),23.82(C-30),23.40(C-16),23.04(C-11),18.46(C-6),17.23(C-26),16.49(C-25),15.55(C-24)。

1d:白色固體,得率為83%,熔點(diǎn)為123～125 ℃。HRMS(ESI)m/z:605.3549[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.20(1H,s,H-12),4.29(1H,s,-OH),4.06-3.86(2H,m,H-31),3.53(2H,t,J=6.6 Hz,H-33),3.09-2.93(1H,m,H-3),1.10(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,CH3-27),0.89(6H,s,CH3-30,CH3-26),0.85(3H,s,CH3-29),0.68(3H,s,CH3-24),0.67(3H,s,CH3-25).13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 177.06(C-28),143.93(C-13),122.38(C-12),77.28(C-3),63.95(C-31),55.25(C-5),47.52(C-9),46.53(C-17),45.89(C-19),41.72(C-14),41.38(C-18),39.37(C-8),38.85(C-1),38.54(C-4),37.04(C-10),35.46(C-34),33.66(C-21),33.22(C-29),32.84(C-7),32.59(C-22),32.20(C-35),30.85(C-20),28.69(C-23),27.70(C-15),27.57(C-32),27.42(C-2),26.08(C-27),24.74(C-33),23.83(C-30),23.42(C-16),23.03(C-11),18.46(C-6),17.19(C-26),16.49(C-25),15.55(C-24)。

1e:白色固體,得率為80%,熔點(diǎn)為118～119 ℃。HRMS(ESI)m/z:619.3707[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.29(1H,s,H-12),4.03(2H,t,J=6.3 Hz,H-31),3.42(2H,t,J=6.8 Hz,H-36),3.22(1H,d,J=9.6 Hz,-OH),2.93-2.81(1H,m,H-3),1.15(3H,s,CH3-23),1.00(3H,s,CH3-27),0.94(3H,s,CH3-29),0.91(6H,s,CH3-30,CH3-26),0.79(3H,s,CH3-24),0.75(3H,s,CH3-25).13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 177.07(C-28),143.97(C-13),122.33(C-12),77.27(C-3),64.02(C-31),55.24(C-5),47.50(C-9),46.52(C-17),45.89(C-19),41.73(C-14),41.40(C-18),39.36(C-8),38.85(C-1),38.53(C-4),37.04(C-10),35.40(C-35),33.65(C-21),33.21(C-29),32.85(C-7),32.67(C-22),30.85(C-20),28.70(C-23),28.40(C-32),27.75(C-15),27.56(C-34),27.42(C-2),26.06(C-27),25.17(C-33),23.81(C-30),23.41(C-16),23.03(C-11),18.45(C-6),17.23(C-26),16.50(C-25),15.54(C-24)。

2a:白色固體,得率為67%,熔點(diǎn)為215～217 ℃。HRMS(ESI)m/z:646.4602[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.20(1H,s,H-12),4.75(2H,s,H-34,H-36),4.65(1H,s,H-38),4.31(1H,d,J=5.0 Hz,-OH),4.09(1H,s,H-35),3.96(2H,s,H-31),3.59(1H,s,H-3),2.78(2H dd,J=21.1,11.0 Hz,H-32),1.10(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,H-27),0.89(6H,s,H-30,H-26),0.85(3H,s,H-29),0.68(3H,s,H-24),0.66(3H,s,H-25).13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 177.15(C-28),143.83(C-13),122.48(C-12),79.62(C-35),77.29(C-3),71.18(C-37),69.83(C-34),66.84(C-36),61.87(C-31),59.92(C-33),58.12(C-38),55.26(C-5),50.64(C-32),47.55(C-9),46.39(C-17),45.94(C-19),41.64(C-14),41.24(C-18),39.36(C-8),38.85(C-1),38.52(C-4),37.05(C-10),33.65(C-21),33.26(C-29),32.75(C-7),32.46(C-22),30.85(C-20),28.70(C-23),27.61(C-15),27.41(C-2),26.16(C-27),23.88(C-30),23.37(C-16),23.01(C-11),18.47(C-6),17.15(C-26),16.51(C-25),15.57(C-24)。

2b:白色固體,得率為78%,熔點(diǎn)為204～207 ℃。HRMS(ESI)m/z:660.4758[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.21(1H,s,H-12),4.71(2H,br s,H-35,H-37),4.68(1H,s,H-39),4.30(1H,d,J=5.1 Hz,-OH),4.11(1H,s,H-36)3.81(2H,d,J=9.5 Hz,H-31),3.25(1H,s,H-3),2.77(2H,d,J=10.3 Hz,H-33),1.09(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,H-27),0.88(6H,s,H-30,H-26),0.85(3H,s,H-29),0.68(3H,s,H-24),0.66(3H,s,H-25).13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 177.03(C-28),143.92(C-13),122.34(C-12),77.28(C-3),76.5(C-36),76.43(C-38),70.71(C-35),70.69(C-37),63.82(C-31),59.58(C-39),58.36(C-34),55.25(C-5),51.56(C-33),47.53(C-9),46.50(C-17),45.89(C-19),41.72(C-14),41.37(C-18),39.35(C-8),38.85(C-1),38.54(C-4),37.04(C-10),33.68(C-21),33.25(C-29),32.81(C-7),32.50(C-22),30.85(C-20),28.70(C-23),27.61(C-15),27.56(C-32)27.42(C-2),26.07(C-27),23.83(C-30),23.40(C-16),23.05(C-11),18.46(C-6),17.19(C-26),16.51(C-25),15.58(C-24)。

2c:白色固體,得率70%,熔點(diǎn)為116～117 ℃。HRMS(ESI)m/z:674.4913[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.18(1H,d,J=3.5 Hz,H-12),4.77(2H,br s,H-36,H-38),4.63(1H,s,H-40),4.32(1H,s,-OH),4.10(1H,s,H-37),4.03-3.86(2H,m,H-31),3.72(1H,d,J=11.1 Hz,H-3),3.07(2H,dd,J=17.9,10.8 Hz,H-34),1.10(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,CH3-27),0.88(6H,s,CH3-30,CH3-26),0.85(3H,s,CH3-29),0.68(3H,s,CH3-24),0.66(3H,s,CH3-25);13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 177.07(C-28),143.92(C-13),122.37(C-12),77.53(C-39),77.29(C-3),73.71(C-38),70.02(C-36),69.20(C-37),64.13(C-31),63.18(C-40),58.09(C-35),55.25(C-5),52.09(C-34),47.53(C-9),46.50(C-17),45.89(C-19),41.72(C-14),41.38(C-18),39.36(C-8),38.85(C-1),38.53(C-4),37.03(C-10),33.66(C-21),33.22(C-29),32.84(C-7),32.59(C-22),30.85(C-20),28.70(C-23),28.56(C-15),27.57(C-32),27.43(C-2),26.62(C-33),26.07(C-27),23.81(C-30),23.40(C-16),23.04(C-11),18.44(C-6),17.20(C-26),16.51(C-25),15.58(C-24)。

2d:白色固體,得率75%,熔點(diǎn)為75～76 ℃。HRMS(ESI)m/z:688.5069[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.19(1H,s,H-12),4.71(2H,br s,H-37,H-39),4.65(1H,s,H-41),4.30(1H,d,J=4.7 Hz,-OH),4.13(1H,s,H-38),3.94(2H,dd,J=12.1,5.9 Hz,H-31),3.20(1H,s,H-3),3.04-2.98(2H,m,H-35),1.10(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,CH3-27),0.89(6H,s,CH3-30,CH3-26),0.85(3H,s,CH3-29),0.68(3H,s,CH3-24),0.67(3H,s,CH3-25);13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 177.06(C-28),143.90(C-13),122.38(C-12),79.67(C-40),77.29(C-3),71.22(C-39),69.86(C-37),67.26(C-38),64.15(C-31),59.66(C-41),57.36(C-36),55.26(C-5),52.52(C-35),47.52(C-9),46.50(C-17),45.88(C-19),41.71(C-14),41.40(C-18),39.36(C-8),38.85(C-1),38.54(C-4),37.03(C-10),33.66(C-21),33.24(C-29),32.86(C-7),32.59(C-22),30.85(C-20),28.70(C-23),28.56(C-15),27.54(C-32),27.43(C-2),26.07(C-27),24.62(C-33),24.07(C-34),23.82(C-30),23.41(C-16),23.03(C-11),18.45(C-6),17.22(C-26),16.50(C-25),15.58(C-24)。

2e:白色固體,得率75%,熔點(diǎn)為61～63 ℃。HRMS(ESI)m/z:702.5226[M+H]+;1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 5.19(1H,s,H-12),4.77(3H,br s,H-38,H-40,H-42),4.30(1H,d,J=4.7 Hz,-OH),4.03(1H,dd,J=14.2,7.1 Hz,H-39),3.94(2H,s,H-31),3.58(1H,s,H-3),2.98(2H,dd,J=19.3,14.3 Hz,H-36),1.10(3H,s,CH3-23),0.90(3H,s,CH3-27),0.88(6H,s,CH3-30,CH3-26),0.85(3H,s,CH3-29),0.68(3H,s,CH3-24),0.66(3H,s,CH3-25);13C NMR(125 MHz,DMSO)δ 177.07(C-28),143.93(C-13),122.36(C-12),79.54(C-41),77.29(C-3),72.09(C-40),66.97(C-38),67.33(C-39),64.11(C-31),60.23(C-42),58.40(C-37),55.26(C-5),52.52(C-36),47.51(C-9),46.51(C-17),45.88(C-19),41.71(C-14),41.39(C-18),39.36(C-8),38.85(C-1),38.53(C-4),37.03(C-10),33.65(C-21),33.22(C-29),32.86(C-7),32.59(C-22),30.85(C-20),28.98(C-35),28.70(C-23),28.57(C-15),27.54(C-32),27.42(C-2),27.00(C-33),26.06(C-27),25.42,(C-34)23.80(C-30),23.41(C-16),23.02(C-11),18.46(C-6),17.20(C-26),16.50(C-25),15.58(C-24)。

2.2 OADs目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的體外抑制活性

本文以微量α-葡萄糖苷酶-PNPG檢測(cè)模型對(duì)所合成的系列化合物的活性進(jìn)行了檢測(cè)和評(píng)價(jià),并采用Spss Statistics 17.0 軟件計(jì)算了其對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50值,結(jié)果如表1所示。所合成的5個(gè)OADs的IC50較OA均有下降,推測(cè)可能是因?yàn)樗B接的1-DNJ本身具有較好的抑制活性,且其分子中含有多個(gè)羥基,使得 OADs 的親水性提高,因而提高了抑制α-葡萄糖苷酶的能力。本文的結(jié)果與李文良等[16]的報(bào)導(dǎo)相似,當(dāng)連接親水基團(tuán)時(shí),活性有明顯提高。在所合成的五個(gè)衍生物中,2b(OA與1-DNJ連接橋的碳鏈長(zhǎng)度為3)的活性明顯優(yōu)于OA,IC50值為0.786 mmol/L(OA的IC50=2.387 mmol/L);2a、2c、2d、2e的活性相對(duì)于OA也有一定的提高,但是提高程度不明顯,說(shuō)明連接橋碳鏈的長(zhǎng)短對(duì)衍生物的抑制活性影響較大。這可能是由于當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度為3時(shí),化合物的結(jié)構(gòu)與酶的活性中心能更好地相匹配,使得1-DNJ上的羥基能與酶的活性中心的氨基酸形成較多的化學(xué)鍵。

表1 OADs對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 1 Inhibitory activity of OADs on α-glucosidase

2.3 OADs目標(biāo)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

本文采用非線性擬合方法,獲得了在α-葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)體系中活性較好的衍生物2b,OA和阿卡波糖作用下的表觀Vmax和表觀Km值,并與空白模型進(jìn)行了比較,結(jié)果如表2和圖3所示。動(dòng)力學(xué)分析數(shù)據(jù)顯示,與空白組相比在阿卡波糖的作用下,模型的表觀Vmax沒(méi)有顯著變化,表觀Km值極顯著增大(p<0.01),因此屬于α-葡萄糖苷酶競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑,而在2b作用下,體系的表觀Km值極顯著增大(p<0.01),即該化合物使酶與底物的親和力變?nèi)趿?同時(shí)表觀Vmax也極顯著降低(p<0.01),表明2b為混合型抑制類(lèi)型;在OA作用下,表觀Km值無(wú)明顯變化,而表觀Vmax極顯著降低(p<0.01),表明OA為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制,與Ding等[24]的分析結(jié)果相同。

表2 2b、OA、阿卡波糖的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Enzyme reaction kinetic parameters of compounds 2b,OA and acarbose

圖3 化合物2b、OA和阿卡波糖的體外非線性擬合圖Fig.3 Fitting results of kinetic parameters of α-glucosidase-PNPG reaction in vitro under the inhibition of compound 2b,OA,and acarbose by Nonlinear Curve fit

2.4 OADs目標(biāo)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制

為了深入探索OADs與α-葡萄糖苷酶在分子水平上的作用機(jī)制,本文通過(guò)AutoDock 4.2軟件對(duì)模建的α-葡萄糖苷酶與活性較好的2b、活性一般的2e、OA與阿卡波糖進(jìn)行分子對(duì)接。由表3可知,ΔG<0說(shuō)明化合物與酶的結(jié)合是自發(fā)的,ΔH和ΔS均為負(fù)數(shù),表明化合物與酶的之間的作用力為氫鍵和范德華力,從圖 4中可知,OA中的一個(gè)羧基和一個(gè)羥基與R69、G140、E210形成了4個(gè)氫鍵,2e中三個(gè)羥基和羧基與G140、E210、E456形成了4個(gè)氫鍵,2b中四個(gè)羥基和一個(gè)氨基與R69、D70、L208、E210、R345形成7了個(gè)氫鍵;橋碳鏈長(zhǎng)短對(duì)化合物抑制活性有很大的影響,2b活性優(yōu)于2e和OA的主要原因可能是與酶形成氫鍵個(gè)數(shù)多于2e和OA。阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的相互作用主要通過(guò)與R69、D70、G140、L208、W209、E210、E211、R345形成8個(gè)氫鍵,與W139、Y351形成Π-Π相互作用,其形成氫鍵的主要作用部位是連接氨基的糖環(huán)，而1-DNJ的結(jié)構(gòu)與阿卡波糖的主要作用部位結(jié)構(gòu)相似[25],因此引入1-DNJ活性基團(tuán)合成OADs類(lèi)抑制劑是合理的。結(jié)合自由能大小:OA(-12.78 kJ/mol)>2b(-17.19 kJ/mol)>阿卡波糖(-21.01 kJ/mol),結(jié)合自由能越低,表明該對(duì)接位點(diǎn)的對(duì)接越緊密,抑制劑對(duì)位點(diǎn)的抑制作用越強(qiáng),活性越好,也可以解釋2b的活性高于OA。

表3 化合物2b、2e、OA和阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶模擬對(duì)接過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of the molecular docking between compound2b,2e,OA,acarbose and α-glucosidase

圖4 化合物阿卡波糖、OA、2b、2e與α-葡萄糖苷酶分子對(duì)接圖Fig.4 Diagrammatic sketch of molecular docking between the compound acarbose,OA,2b,2e and α-glucosidase注:(a)阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接圖;(b)OA與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接圖;(c)2b與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接圖;(d)2e與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接圖;虛線表示氫鍵。

3 結(jié)論

根據(jù)拼接原理,以O(shè)A為先導(dǎo)物,對(duì)C-28號(hào)位的羧基進(jìn)行修飾,通過(guò)溴代、氮代,引入了一個(gè)活性基團(tuán)—1-DNJ,設(shè)計(jì)合成了不同碳鏈長(zhǎng)度的OA-1-DNJ雜合體得到了5個(gè)新型的化合物,其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均高于先導(dǎo)物OA;碳鏈長(zhǎng)短對(duì)衍生物的抑制活性影響較大,碳鏈長(zhǎng)度為3時(shí)(化合物2b)活性最好,其IC50值為0.786 mmol/L,顯著優(yōu)于OA(IC50=2.387 mmol/L);氫鍵和范德華力是該類(lèi)化合物與酶結(jié)合的主要作用力,氫鍵個(gè)數(shù)越多,抑制效果越好。