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(蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所,甘肅蘭州 730000)

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(plant growth regulator,PGR)是人工合成的激素類(lèi)化合物,屬于農(nóng)藥,對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)起到增產(chǎn)、催熟、增色等作用,但具有一定的毒性[1-3]。近年來(lái),隨著科技的發(fā)展以及人們對(duì)水果的質(zhì)和量需求的增長(zhǎng),濫用及盲目改變植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用劑量常有發(fā)生,影響到果蔬的食用安全,由此導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題備受關(guān)注[3-4,15-17]。

國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)只有針對(duì)單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的且主要對(duì)象為出口食品,國(guó)內(nèi)外已有研究多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的氣相色譜法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法[3,5-14],其中液相色譜-質(zhì)譜法為熱點(diǎn)方法,解決了雜質(zhì)的干擾、靈敏度低等問(wèn)題,但針對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用較頻繁的漿果、瓜果類(lèi)的專屬檢測(cè)方法未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)前期進(jìn)行了田間及農(nóng)藥使用的實(shí)地考察,將葡萄、草莓、西瓜等水果中使用的PGR范圍縮減為矮壯素、縮節(jié)胺(甲哌鎓)、脫落酸(S-誘抗素)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆、胺鮮酯(DA-6)、吲哚乙酸、赤霉素、5-硝基愈創(chuàng)木酚、氯吡脲、吲哚丁酸、1-萘乙酸(1-萘乙酸鈉)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、4-氯苯氧乙酸、蕓苔素內(nèi)酯(油菜素內(nèi)酯)、四烯雌酮、多效唑、烯效唑、調(diào)節(jié)膦(安果),針對(duì)以上生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,本文詳細(xì)對(duì)其前處理、儀器方法等進(jìn)行了研究,選用HPLC-MS/MS建立了測(cè)定方法,旨在為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的標(biāo)準(zhǔn)建立提供理論基礎(chǔ),為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)急檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吲哚乙酸、吲哚丁酸、1-萘乙酸、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、四烯雌酮、氯吡脲、多效唑、矮壯素、烯效唑、噻苯隆、調(diào)節(jié)膦、縮節(jié)胺/甲哌鎓、5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、赤霉素、4-氯苯氧乙酸 來(lái)源為Dr.Ehrenstorfer.Gmbh;脫落酸、蕓苔素內(nèi)酯/油菜素內(nèi)酯 上海安譜科技有限公司;胺鮮酯 北京曼哈格,以上對(duì)照品純度均大于96%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸 均為色譜純,德國(guó)Merck公司;乙酸銨 HPLC級(jí),美國(guó)Sigma公司;封端十八烷基(C18)粉末、N-丙基乙二胺(PSA)粉末、石墨化炭黑(GCB)粉末、增強(qiáng)基質(zhì)去除(EMR)粉末 美國(guó)Agilent公司;無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸氫二鈉、檸檬酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水 由超純水系統(tǒng)制備。

6460三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀,配有1260HPLC 美國(guó)Agilent公司;5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;Milli Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;B-400均質(zhì)儀 美國(guó)BUCHI公司;EVA50A氮吹儀 普立泰科公司;MS3 渦旋混勻器 美國(guó)IKA公司;十萬(wàn)分之一、萬(wàn)分之一電子天平 德國(guó)Sartorius公司;KS 501振蕩器 美國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 提取:準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品5 g,加入10.0 mL 1%乙酸乙腈溶液,振蕩(300 Mot/min)15 min,以提高提取率,然后加入脫水試劑(含4 g無(wú)水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸氫二鈉、0. 5g檸檬酸鈉),立即渦旋混合1 min,在4 ℃、4000 r/min離心5 min,使得乙腈和水相完全分離。取5.0 mL上清液用于凈化。

凈化:加入裝有填料的凈化管中,渦旋振蕩2 min,于4 ℃、10000 r/min離心5 min,取上清液2.0 mL氮吹至凈干,用50%的甲醇水溶液復(fù)溶至1.0 mL后,過(guò)0.2 μm濾膜過(guò)濾后,上機(jī)測(cè)定。對(duì)比凈化填料的不同組成及配比,以各目標(biāo)物的回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo),凈化填料組成及配比的方案見(jiàn)表1。

表1 凈化填料的組成及配比Table 1 Composition and proportion of purifying filler

1.2.2 液相色譜條件 液相色譜的流動(dòng)相比較了a. 乙腈-水、b.乙腈-0.1%甲酸水溶液、c.乙腈-5 mmol乙酸銨溶液三種組成,通過(guò)各目標(biāo)物色譜峰面積大小確定最佳流動(dòng)相組成。

色譜柱:Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)。流動(dòng)相A:0.1%甲酸水,流動(dòng)相B:乙腈;梯度洗脫程序如下表2。流速:0.2 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

表2 流動(dòng)相梯度條件Table 2 Gradient elution condition for liquid phase

1.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件 采用濃度0.1～0.5 μg/mL的目標(biāo)物單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件的確定,分別通過(guò)自動(dòng)軟件優(yōu)化、手動(dòng)優(yōu)化兩種方法。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件:ESI源,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM),噴嘴電壓:30 psi,干燥氣溫度:350 ℃,干燥氣流速:13 L/min,毛細(xì)管電壓:4000 V。各生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜條件Table 3 Mass spectrometric parameters of the growth regulators

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證 用空白葡萄基質(zhì)配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以化合物濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的混標(biāo)溶液取1.0 mL,加入陰性葡萄樣品中,按1.2.1方法進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),得到目標(biāo)化合物的濃度與3倍信噪比(S/N)比較,調(diào)整各目標(biāo)化合物的加標(biāo)量,得到各目標(biāo)物響應(yīng)為3倍信噪比(S/N)時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品濃度,由此得到各目標(biāo)物的方法檢出限,以目標(biāo)化合物響應(yīng)為10倍信噪比(S/N)時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品濃度計(jì)算各化合物的定量限。

分別取葡萄、草莓、西瓜的空白基質(zhì),添加40.0、100.0、200.0 μg/kg三個(gè)水平的19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,批內(nèi)6次平行,按1.2.1方法進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度低會(huì)影響碎片離子的判斷)進(jìn)行質(zhì)譜條件的確定,分別通過(guò)自動(dòng)軟件優(yōu)化、手動(dòng)優(yōu)化兩種方法。實(shí)驗(yàn)得出:使用軟件自動(dòng)優(yōu)化時(shí),縮節(jié)胺、4-氯苯氧乙酸、2,4-D僅有1對(duì)碎片離子,手動(dòng)優(yōu)化可找到定性離子;1-萘乙酸(鈉)僅有1對(duì)碎片離子。其次,6-BA、噻苯隆、氯吡脲、吲哚乙酸、吲哚丁酸、脫落酸在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng),但是在正離子模式下豐度明顯較高,因此赤霉素、2,4-D、5-硝基愈創(chuàng)木酚、4-氯苯氧乙酸為負(fù)離子模式,其它目標(biāo)物均為正離子模式。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇 流動(dòng)相比較了:a.乙腈-水、b.乙腈-0.1%甲酸水溶液、c.乙腈-5 mmol乙酸銨溶液,當(dāng)流動(dòng)相為b、c時(shí),二者對(duì)各目標(biāo)物的峰形及響應(yīng)影響不大,優(yōu)選不含鹽的弱洗脫相0.1%甲酸水溶液。比較a、c兩種流動(dòng)相,對(duì)目標(biāo)物的峰形、分離度沒(méi)有影響;對(duì)保留時(shí)間有較小的影響:a條件下矮壯素、縮節(jié)胺、6-BA、胺鮮酯保留時(shí)間延后;對(duì)各目標(biāo)物的響應(yīng)(以峰面積表示)影響較大,a、b條件下各生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的峰面積對(duì)比見(jiàn)圖1(取5次測(cè)定的平均值為結(jié)果)。由圖1可知,水作為弱洗脫相時(shí),赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、油菜素內(nèi)酯無(wú)響應(yīng);吲哚丁酸、調(diào)節(jié)膦的響應(yīng)不受影響,其它目標(biāo)物的響應(yīng)均在水作為弱洗脫相時(shí)較高,且5-硝基創(chuàng)愈木酚在乙腈-水條件下的響應(yīng)較乙腈-0.1%甲酸水溶液條件下高25倍。除赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸(均為負(fù)離子模式),其它16種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在流動(dòng)相(水和乙腈)下響應(yīng)較高。綜合考慮,19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的流動(dòng)相為:0.1%甲酸水溶液和乙腈。

圖1 不同流動(dòng)相組成對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑峰面積的影響Fig.1 Effects of different mobile phase compositions on growth regulator peak area

2.2.2 流動(dòng)相梯度條件的確定 色譜柱及流動(dòng)相的梯度條件對(duì)多目標(biāo)組分的分離有較大影響。本文比較了Waters Acquity HSS T3色譜柱、Agilent Eclipse Plus C8 RRHD色譜柱、Agilent XDB-C18色譜柱,在Waters Acquity HSS T3色譜柱條件下,目標(biāo)物的分離度、峰形和靈敏度都較好。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),流動(dòng)相起始的比例對(duì)目標(biāo)物的分離有較大的影響,圖2為三種梯度條件下19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的總離子流圖。由圖2可知,A(起始比例為0.1%甲酸水97%)和B(起始比例為乙腈90%)條件下,所有目標(biāo)物出峰時(shí)間重疊,影響峰形,且無(wú)法分段采集,導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)降低。當(dāng)水相起始比例為30%時(shí),各化合物在11 min內(nèi)依次分離(見(jiàn)圖2中C)。泵壓在17 min時(shí)達(dá)到平衡。因此,本實(shí)驗(yàn)色譜柱確定為Waters Acquity HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm),流動(dòng)相的梯度條件如表2所示。19種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of the 19 plant growth regulators

圖2 不同梯度條件的流動(dòng)相對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑出峰的影響Fig.2 Effects of that gradient condition on the peak of the growth regulator注:圖A～C流動(dòng)相起始比例分別為：0.1甲酸水∶乙腈=97%∶3%、90%∶10%、70%∶30%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋溶劑的確定

對(duì)照品均易溶于甲醇,用甲醇配制一級(jí)儲(chǔ)備液(1 mg/mL)?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的配制溶劑對(duì)目標(biāo)物出峰有影響。比較不同(甲醇+水)溶液的濃度:100%、70%、50%、20%、0%,對(duì)各目標(biāo)物響應(yīng)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知,調(diào)節(jié)膦在甲醇+水濃度為50%～20%時(shí)響應(yīng)較好,使用100%甲醇在色譜柱中不保留,無(wú)響應(yīng);胺鮮酯、脫落酸受配制溶液濃度的影響較大,隨著甲醇-水溶液濃度降低,響應(yīng)降低;赤霉素在70%的甲醇+水溶液中的響應(yīng)較50%的小;其它生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)受配制溶液濃度的影響較小。綜合考慮,當(dāng)甲醇+水的比例為50%時(shí),各化合物均能保證較好的響應(yīng)值,因此選擇50%的甲醇+水為對(duì)照溶液及樣品上機(jī)前的復(fù)溶溶液。

圖4 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋溶劑對(duì)19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑峰面積的影響Fig.4 Effects of different concentrations of standard solution on the peak area of 19 growth regulators

2.4 樣品提取溶劑的優(yōu)化

乙腈極性大,對(duì)農(nóng)藥殘留的提取有較好的效果,且考慮到甲醇的危害性,所以提取溶劑以乙腈為主,在其他前處理?xiàng)l件不變的方法下,選取不同的提取溶劑:乙腈、70%乙腈水溶液、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈,通過(guò)比較回收率確定樣品的提取溶劑。19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在不同提取溶劑的回收率對(duì)比見(jiàn)圖5。由圖5可知,乙腈或1%乙酸乙腈提取效果較好,均在70%～110%之間,而70%乙腈水溶液、1%甲酸乙腈對(duì)多組分的提取效果不均衡,吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸的回收率較低;乙腈和1%乙酸乙腈提取條件下的平均回收率分別為81.3%和87.0%,綜合考慮選用1%乙酸乙腈為提取溶劑。因?yàn)樗嵝詶l件抑制了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中羧酸的電離,從而增加其在乙腈中的溶解度[18]。漿果類(lèi)、瓜果類(lèi)水果的水分含量為85%～90%,用1%乙酸乙腈提取時(shí),形成酸化乙腈水的體系,對(duì)不同極性的目標(biāo)物有較好的提取率。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇用1%乙酸乙腈為提取溶劑。

圖5 不同提取溶劑對(duì)19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑回收率的影響Fig.5 Effects of different solvent on recovery of 19 growth regulators

2.5 凈化條件的優(yōu)化

蔬菜水果中的農(nóng)藥殘留凈化過(guò)程主要使用PSA、GCB、C18、EMR。本試驗(yàn)選取了以上5種方案(表1),通過(guò)回收率確定凈化的填料及配比,5種凈化方案對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑回收率的影響見(jiàn)圖6。PSA可去除樣品中的有機(jī)酸、糖等干擾物,對(duì)4-氯苯氧乙酸、2,4-D有一定的吸附,但與PSA的使用量有關(guān),方案3、4中PSA僅為100 mg,由圖6可知,對(duì)目標(biāo)物的回收率影響不大。C18在方案1、2中為150 mg,此使用量對(duì)6-BA、矮壯素的回收率有降低的影響;當(dāng)GCB的使用量從15 mg升至30 mg時(shí),對(duì)6-BA、矮壯素的回收率有降低的影響。19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑回收率在70%～110%之間的為方案3,且方案3去除漿果類(lèi)的花色苷效果最佳,因此選方案3為本實(shí)驗(yàn)的凈化填料及配比。

圖6 不同凈化條件對(duì)19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑回收率的影響Fig.6 Effects of different purification conditions on recovery rate of 19 growth regulators

2.6 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限及定量限

不同的樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)值會(huì)有增強(qiáng)或抑制的作用,為基質(zhì)效應(yīng)。本試驗(yàn)分別比較了葡萄、草莓、西瓜的空白基質(zhì)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和50%甲醇水溶液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過(guò)基質(zhì)標(biāo)樣的響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)樣的響應(yīng)值,得到78%的目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)值小于1,即表現(xiàn)為基質(zhì)抑制作用。因此使用空白樣品基質(zhì)配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

用空白葡萄基質(zhì)配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的系列,以濃度為橫坐標(biāo),色譜峰峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行一次線性回歸計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.9902。由1.2.4方法得到方法檢出限和定量限,檢出限為0.09～16.8 μg/kg,定量限為0.27～50.4 μg/kg,具體見(jiàn)表4。

表4 19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限及定量限Table 4 Standard curves,correlation coefficients,LODs and LOQs for 19 growth regulators

2.7 不同基質(zhì)的回收率和精密度

分別取葡萄、草莓、西瓜的空白基質(zhì),添加低、中、高三個(gè)水平的19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行前處理,測(cè)定回收率,每個(gè)水平均測(cè)定6次,計(jì)算RSD,結(jié)果見(jiàn)表5,19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的回收率為69.4%～106.2%,RSD為1.1%～12.5%。

表5 不同基質(zhì)中19種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 5 Average recoveries and RSDs of 19 growth regulators in diffient matrix(n=6)

續(xù)表

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)市售漿果類(lèi)、瓜果類(lèi)水果200種,檢出率為6.3%,其中葡萄、櫻桃、草莓、獼猴桃中的分別檢出矮壯素、氯吡脲、赤霉素、5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉、脫落酸,最大濃度分別為30.45±0.11、1.22±0.01、18.41±0.04、2.03±0.01、8.97±0.02 μg/kg,西瓜、香瓜中僅在西瓜中檢出氯吡脲,濃度為(2.86±0.01) μg/kg，其中檢出胺鮮酯的樣品和空白樣品的總離子流圖見(jiàn)圖7。對(duì)于果蔬類(lèi)中殘留的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)人體的危害需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖7 檢出胺鮮酯的樣品和空白樣品的總離子流圖Fig.7 Total ion flow diagrams of samples and blank samples were obtained

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定漿果類(lèi)、瓜果類(lèi)水果中19種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品采用含1%乙酸的乙腈提取,無(wú)水硫酸鎂-石墨化炭黑(GCB)-(PSA)分散固相萃取凈化。液相色譜采用Waters Acquity HSS T3色譜柱,乙腈和 0.1%甲酸水溶液作流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜分析采用電噴霧多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。19種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在各自濃度范圍內(nèi)線性良好,線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于 0.9902,檢出限為0.09～16.8 μg/kg,定量限為0.27～50.4 μg/kg。以葡萄、草莓、西瓜為代表性基質(zhì)進(jìn)行三水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),回收率為69.4%～106.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.1%～12.5%之間。本方法簡(jiǎn)便快速,靈敏度和準(zhǔn)確性高,應(yīng)用于日常檢測(cè)可以縮短檢測(cè)周期,降低檢測(cè)成本,對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留檢測(cè)具有重要意義。