,,,,,,

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東青島 266042)

溶菌酶可催化降解細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的β-1,4-糖苷鍵以發(fā)揮抗菌作用[1],它廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物中,是脊椎動(dòng)物體內(nèi)重要的免疫因子。溶菌酶被廣泛用于食品防腐保鮮[2-3]、疾病(白血病、腎病、腦膜炎、腫瘤等)的臨床診斷[4-7]、眼部和口腔等的抗菌藥物[8]以及抗腫瘤藥物等[9-10]。

然而,游離溶菌酶的穩(wěn)定性較差,且分離純化成本高,使其應(yīng)用受到極大限制,而將溶菌酶固定化則可部分解決上述問(wèn)題。溶菌酶的固定化方法一般包括物理法和化學(xué)法。物理法盡管也可獲得較好的固定化效果[11-12],但穩(wěn)定性普遍較化學(xué)法低?；瘜W(xué)法以共價(jià)法為主,如將溶菌酶共價(jià)固定于羊毛載體[13]、介孔硅[14]、殼聚糖[15]、氧化石墨烯[16]、AB-8大孔樹(shù)脂[17]、聚四氟乙烯膜[18]、尼龍66[19]、纖維素膜[20]等。

殼聚糖是甲殼素部分脫乙酰的衍生物,具有生物相容性、低毒性和抗菌活性[21-22],其分子中的游離氨基可通過(guò)雙功能試劑戊二醛與溶菌酶發(fā)生偶聯(lián)。但殼聚糖溶于酸性溶液[23],不利于溶菌酶(最適pH為酸性)的固定化,因此,本文將甲殼素顆粒進(jìn)行表面脫乙酰,得到具有一定機(jī)械強(qiáng)度的不溶性固定化載體,并將溶菌酶固定于表面脫乙?；募讱に仡w粒上,與載體一起共同構(gòu)成環(huán)境友好型抗菌材料,旨在用于食品包裝、清潔用品、創(chuàng)口輔料等中,以延長(zhǎng)其保藏期。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲殼素(來(lái)源于雪蟹) 山東萊州市海力生物制品有限公司;溶菌酶(E.C.3.2.1.17,來(lái)源于蛋清,活力153000 U/mg) Sigma-Aldrich(L2879)公司;3-甲基-2-苯丙噻唑啉酮腙(MBTH) Sigma-Aldrich公司;二硫蘇糖醇(DTT)、半脫乙酰殼聚糖(脫乙酰度為49.8%,1H-NMR) 實(shí)驗(yàn)室自制[24];其它試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SHZ-82水浴恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司;FE 20數(shù)字酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司;UNICO 2100紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;移液器 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 底物溶液的配制與固定化方法

1.2.1 底物溶液的配制 以2 mg/mL的半脫乙酰度殼聚糖底物溶液為例,稱取200 mg半脫乙酰度殼聚糖于燒杯中,用0.2 mol/L、pH為4.5的HAc-NaAc緩沖溶液充分溶解,調(diào)節(jié)pH至4.5,用容量瓶定容至100 mL,轉(zhuǎn)移至試劑瓶中于4 ℃儲(chǔ)藏備用。

1.2.2 固定化方法

1.2.2.1 甲殼素載體的活化 將甲殼素顆粒(20～40目)按1∶20 (w/v)的比例置于20% NaOH中,于90 ℃水浴分別加熱一定時(shí)間后,立即用流水冷卻至室溫,抽濾,用蒸餾水反復(fù)洗滌以脫除NaOH,抽干后,將其浸泡在0.2 mol/L的乙酸溶液中過(guò)夜,然后用蒸餾水洗至中性,抽干,按照1∶20 (g/mL)的比例浸入一定濃度、一定pH的戊二醛溶液中,于25 ℃恒溫水浴中反應(yīng)3 h,而后置于冰箱中14 h,用水反復(fù)洗滌以除去殘留戊二醛,抽干備用。

1.2.2.2 酶偶聯(lián) 將已活化的載體按1∶20 (g/mL)浸入溶菌酶溶液中,于4 ℃過(guò)夜,過(guò)濾(取濾液測(cè)定殘留蛋白濃度),用緩沖液洗滌固定化酶,直至濾液中蛋白濃度為0。

1.2.2.3 固定化條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)前期的研究結(jié)果[24-25],分別以脫乙酰時(shí)間(A)、戊二醛濃度(B)、載體活化pH(C)為三因素,根據(jù)表1的水平設(shè)置,按照1.5.1和1.5.2的方法進(jìn)行溶菌酶的固定化,以蛋白利用率、活力回收率、保藏穩(wěn)定性經(jīng)過(guò)歸一化處理后計(jì)算得到的綜合評(píng)分Y′作為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn),以優(yōu)化載體活化條件。給酶量為0.5 mg/mL,酶液pH為4.5。

表1 載體活化正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal test for activation of carrier

1.3 蛋白濃度的測(cè)定與蛋白利用率的計(jì)算

1.3.1 蛋白濃度的測(cè)定 按照Folin酚法[26]配制Folin甲和Folin乙,取1 mL蛋白溶液與5 mL Folin甲充分混勻,于25 ℃下反應(yīng)10 min,再加入0.5 mL Folin乙,立即混勻,于25 ℃反應(yīng)30 min后,測(cè)定750 nm處吸光度值。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 首先配制250 μg/mL牛血清白蛋白溶液,繼而將其稀釋并配成0、25、50、100、150、200、250 μg/mL蛋白溶液,根據(jù)1.3.1的方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 蛋白利用率的計(jì)算 蛋白利用率是指固定化過(guò)程中結(jié)合蛋白質(zhì)的量占總給酶蛋白的百分比。

蛋白利用率(%)=(酶液中酶蛋白初始總質(zhì)量-固定化后殘液中酶蛋白質(zhì)量)/酶液中酶蛋白初始總質(zhì)量×100

式(1)

1.4 酶活力的測(cè)定方法

1.4.1 N-乙酰氨基葡萄糖濃度的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[27]的方法,稍加修改。取2 mL葡萄糖溶液于試管中,加入2 mL,0.5 mol/L NaOH的溶液,充分混勻后,取三個(gè)1.2 mL作三個(gè)平行樣,分別加MBTH試劑600 μL,混勻,于80 ℃水浴加熱,趁熱加入1.2 mL的硫酸鐵銨試劑,充分混勻,冷卻至室溫于620 nm測(cè)吸光度值。

首先配制19.25 mg/mL N-乙酰氨基葡萄糖溶液,繼而將其配制成0、12.43、24.86、37.30、49.73、62.16、74.59、87.03 μmol/L 8個(gè)稀釋梯度的N-乙酰氨基葡萄糖溶液,根據(jù)上述方法測(cè)定吸光度值,作濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 游離溶菌酶活力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)的方法[28]稍加修改。將預(yù)熱至35 ℃的9.9 mL的底物溶液與0.1 mL,0.5 mg/mL(以0.2 mol/L的HAc-NaAc溶解)的溶菌酶溶液混合,置于35 ℃水浴搖床中酶解30 min后,從中取2 mL酶解液迅速加入到2 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中以終止酶解反應(yīng),按照1.4.1的方法測(cè)還原糖濃度。以9.9 mL殼聚糖溶液和0.1 mL,0.2 mol/L的HAc-NaAc溶液為空白對(duì)照。

溶菌酶活力單位被定義為在上述條件下,每分種內(nèi)轉(zhuǎn)化成1 μmol/mL相當(dāng)于N-乙酰氨基葡萄糖的量為1個(gè)酶活力單位。

1.4.3 固定化溶菌酶活力的測(cè)定 在錐形瓶中,按照1 g固定化酶/20 mL底物溶液的比例加入已預(yù)熱至35 ℃的底物溶液,置于35 ℃的水浴搖床中酶解30 min,從中取上清液2 mL迅速加入到2 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中,充分混勻,按照1.4.1的方法測(cè)定還原糖濃度。以底物溶液代替酶解液重復(fù)如上操作作為酶解空白。

1.4.4 活力回收率計(jì)算 活力回收率是指固定化酶的活力所占給酶總活力的百分比。

式(2)

1.4.5 保藏穩(wěn)定性計(jì)算 保藏穩(wěn)定性是指固定化酶在保存15 d后所占初始固定化酶活力的百分比。

式(3)

1.5 綜合評(píng)分的計(jì)算

為使正交試驗(yàn)結(jié)果的各指標(biāo)處于同一數(shù)量級(jí)，消除各指標(biāo)量綱，以便綜合評(píng)分，需首先分別進(jìn)行歸一化處理[29]。設(shè)同一指標(biāo)中，最大值為Ymax，對(duì)應(yīng)100分；最小值為Ymin，對(duì)應(yīng)0分，則相應(yīng)的指標(biāo)值：

式(4)

1.6 固定化對(duì)溶菌酶性質(zhì)的影響

1.6.1 固定化對(duì)溶菌酶最適pH的影響 參照1.4.3的方法,分別測(cè)定固定化酶在pH為3、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5條件下的酶活力;參照1.4.2的方法,分別測(cè)定游離溶菌酶在pH為3.5、4、4.5、5四個(gè)條件下的酶活力。以相對(duì)酶活力為指標(biāo)對(duì)比固定化前后最適pH的改變。

1.6.2 固定化對(duì)溶菌酶最適溫度的影響 參照1.4.3的方法,分別測(cè)定固定化酶在溫度為35、45、55、65、70、75、80、85、90條件下的酶活力;參照1.4.2的方法,分別測(cè)定游離溶菌酶在溫度為55、60、65、70、75、80、90條件下的酶活力。以相對(duì)酶活力為指標(biāo)對(duì)比固定化前后最適溫度的改變。

1.6.3 固定化對(duì)溶菌酶Km值的影響 根據(jù)1.6.1和1.6.2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以及Lineweaver-Burk[30]的原理,作1/v-1/s圖,通過(guò)線性回歸計(jì)算并求得Km值。

1.6.4 相對(duì)酶活力計(jì)算 相對(duì)酶活力值是指設(shè)最大酶活力為100%,求其他酶活力值相對(duì)于最大酶活力值的相對(duì)比值。

式(5)

1.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016和SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

評(píng)價(jià)酶固定化效率的高低包括蛋白利用率、酶活力回收率及固定化酶的穩(wěn)定性,其中涉及蛋白濃度的測(cè)定和溶菌酶活力的測(cè)定,分別采用Folin酚法和MBTH法。盡管Folin酚法比紫外法操作繁瑣,但可避開(kāi)雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾,其用于蛋白濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,其在0～0.25 mg/mL線性范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.316x+0.0276,R2=0.9912。在酶活力測(cè)定方面,與常用的溶壁微球菌法相比,MBTH法采用在堿性條件下可溶的半脫乙酰殼聚糖為底物,以MBTH試劑取代常用的DNS試劑,使方法更靈敏、更準(zhǔn)確、更便捷,其用于酶活力計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示,其在0～87.03 μmol/L線性范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0101x+0.0095,R2=0.9992。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

圖2 N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 N-acetylglucosamine standard curve

2.2 載體活化條件優(yōu)化

用于酶固定化的載體必須具有良好的機(jī)械性能、生物相容性和含有一定反應(yīng)性的官能團(tuán)。來(lái)源于蟹殼的甲殼素基本具備上述三個(gè)條件,但由于甲殼素結(jié)構(gòu)中,乙?；枯^高,其脫乙酰度,即氨基含量，基本在20%以下,不利于戊二醛與其偶聯(lián)而形成希夫堿,而將甲殼素顆粒脫乙?；瘎t可解決上述問(wèn)題。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,由R值可得,三個(gè)因子對(duì)指標(biāo)值的影響次序?yàn)锳>B>C;由k值可得,最優(yōu)組合為A3B3C2,恰為正交實(shí)驗(yàn)中的第9組。方差分析見(jiàn)表3,脫乙酰時(shí)間影響顯著(p<0.05),而戊二醛濃度和載體活化pH影響不顯著(p>0.05),這與正交試驗(yàn)的分析結(jié)果一致。從9號(hào)試驗(yàn)組得知,溶菌酶固定化的直觀最優(yōu)條件分別為:脫乙酰時(shí)間(A)為25 min,戊二醛濃度(B)為5%,載體活化pH(C)為5.0,在此條件下測(cè)得的蛋白利用率為28.7%,活力回收率為91.0%,保藏穩(wěn)定性為66.0%。由此看來(lái),在固定化實(shí)驗(yàn)中,給酶量(0.5 mg/mL)和酶液pH(4.5)的設(shè)定均合理。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9(34)orthogonal test results

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Analysis of variance of overall index score

2.3 固定化對(duì)溶菌酶活力的影響

溶菌酶經(jīng)過(guò)固定化后其最適的酶解pH和溫度都有可能會(huì)發(fā)生偏移[31],根據(jù)其酶學(xué)性質(zhì)的變化可推測(cè)溶菌酶與載體的結(jié)合方式及其對(duì)酶活性中心的影響。

2.3.1 固定化對(duì)溶菌酶最適pH的影響 結(jié)果如圖3所示,游離溶菌酶的最適pH為4,稍有偏離,其活力即明顯下降;而固定化后,盡管溶菌酶的最適pH為3.5,向酸性偏移了0.5個(gè)單位,但是,它在較寬的pH范圍內(nèi)仍能體現(xiàn)酶活力。這是因?yàn)闅ぞ厶菫殛?yáng)離子載體,在將溶菌酶固定化后會(huì)使酶微環(huán)境的pH增大,只有降低外圍環(huán)境的pH抵消這一影響,才能使酶反應(yīng)的微環(huán)境達(dá)到最適的pH。此現(xiàn)象與其它以殼聚糖為載體的酶固定化結(jié)果相一致[32]。Jiang等[33]將溶菌酶物理吸附于幾丁質(zhì)晶須,并考察了其抗菌活性,該文采用的固定化溶菌酶的活力測(cè)定方法為溶壁微球菌法,文中并無(wú)相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)研究,而本文以半脫乙酰殼聚糖為底物研究固定化溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)尚屬首例。

圖3 固定化對(duì)溶菌酶最適pH的影響Fig.3 Effect of immobilization on the optimum pH of lysozyme

2.3.2 固定化對(duì)溶菌酶最適溫度的影響 如圖4所示,游離溶菌酶的最適溫度為75 ℃,在70～75 ℃范圍內(nèi)保持較高活力;而固定化溶菌酶的最適溫度為80 ℃,且在70～90 ℃范圍內(nèi)維持較高的活力達(dá)95%,體現(xiàn)較高的溫度穩(wěn)定性。這可能是由于酶與載體的共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)使溶菌酶的活性中心在高溫下仍能維持應(yīng)有的空間構(gòu)象，從而使溶菌酶發(fā)揮較高活力。郭慶啟等[17]以戊二醛為交聯(lián)劑,將溶菌酶固定于AB-8大孔樹(shù)脂上,其最適溫度雖然也升高5 ℃,但45 ℃后酶活力顯著降低。潘軍軍等[34]將溶菌酶固定于羊毛織物上,但并未研究固定化酶的最適溫度,考察了固定化溶菌酶在40 ℃下的熱穩(wěn)定性,保溫100 min后仍保持96%的熱穩(wěn)定性。

圖4 固定化對(duì)溶菌酶最適溫度的影響Fig.4 Effect of immobilization on the optimum temperature of lysozyme

2.3.3 固定化對(duì)溶菌酶Km值的影響 Km值表示酶對(duì)底物的親和力,Km值越小說(shuō)明酶對(duì)底物的親和力越大,越有利于溶菌酶發(fā)揮催化活力。如圖5所示,溶菌酶經(jīng)固定化后,其表觀Km值(2.69 mg/mL)比游離酶的(1.75 mg/mL)明顯增大。說(shuō)明溶菌酶分子表面的固定位點(diǎn)較多,固定化后一定程度上束縛了酶與底物之間的相互作用,這是共價(jià)固定化酶的普遍現(xiàn)象,但本實(shí)驗(yàn)中Km值的變化幅度并不大,如圖5所示,因此,可認(rèn)為固定化結(jié)合位點(diǎn)及其數(shù)量既達(dá)到了提高溶菌酶熱穩(wěn)定性的作用,又沒(méi)有顯著影響溶菌酶的酶解性能。目前尚未發(fā)現(xiàn)與本文所做的固定化溶菌酶的Km值測(cè)定類似的報(bào)道。

圖5 固定化對(duì)溶菌酶Km值的影響 Fig.5 Effect of immobilization on the Km of lysozyme

3 結(jié)論

本文以具有一定機(jī)械性能的雪蟹甲殼素顆粒為載體,對(duì)其表面部分脫乙酰,使其與戊二醛發(fā)生交聯(lián)后再固定溶菌酶,固定化的最佳脫乙酰時(shí)間(A)為25 min,戊二醛濃度(B)為5%,載體活化pH(C)為5.0,且其影響因素A>B>C。所得到的固定化酶的表觀最適pH由4.0降至3.5;最適溫度由75 ℃升高至80 ℃,且在70～90 ℃仍保持95%活力;Km為2.69 mg/mL明顯大于游離酶的1.75 mg/mL;且15 d穩(wěn)定性保持66%。其兼顧了溶菌酶的抗菌、穩(wěn)定與應(yīng)用性能,與載體一起共同構(gòu)成環(huán)境友好型抗菌材料,使其在食品包裝、清潔用品、創(chuàng)口輔料[35]等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。