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(1.西安悟空檢測科技有限公司,陜西西安 710065;2.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,陜西西安 710048)

茯磚茶是黑茶的一種,是全發(fā)酵茶[1]。齊祖同等[2]人在上世紀(jì)九十年代將茯磚茶發(fā)酵過程中產(chǎn)生黃色閉囊殼的有益菌鑒定為散囊菌屬,細(xì)分為冠突散囊菌。因該菌在茯磚的茶渥堆過程中發(fā)酵生長,可產(chǎn)生金黃色的閉囊殼,外觀呈黃色,被俗稱“金花”[3]。該菌在茯磚茶的發(fā)酵過程中可產(chǎn)生纖維素酶[4]、吲哚生物堿[5]、阿魏酸酯[6]、消化酶[7]、降脂類物質(zhì)[8-10]等物質(zhì),發(fā)花過程中可有效減少茯磚茶中的多酚類物質(zhì)、氨基酸、黃酮類物質(zhì)、水溶性蛋白及可溶性糖,這些呈味物質(zhì)和功能成分含量的變化,對茯磚茶的湯色、氣味和口感有很大的改變作用[11-13]。

茯磚茶中散囊菌種類較多[14],菌體活性的高低決定了其生長速率,所以需要根據(jù)不同的茶葉品種制定不同的渥堆發(fā)酵條件,讓冠突散囊菌在茶葉基質(zhì)中保持良好的活性,進(jìn)一步增加子囊孢子的產(chǎn)出率,增加“金花”數(shù)量,提高茯磚茶品質(zhì)。陜西作為茯磚茶的發(fā)源地,生產(chǎn)工藝久遠(yuǎn),而目前的檢測過程中,偶有發(fā)現(xiàn)“金花”含量不滿足標(biāo)準(zhǔn)要求,或者伴有其他雜菌生長的現(xiàn)象,所以對陜西地區(qū)茯磚茶中“金花”含量的分布情況檢測評價,對工業(yè)化生產(chǎn)過程具有一定的指導(dǎo)意義。

本文采購陜西地區(qū)市場內(nèi)50份茯磚茶產(chǎn)品,分別對其中“金花”含量進(jìn)行檢測,并對各試樣中菌落形態(tài)進(jìn)行對比,通過結(jié)果對陜西地區(qū)茯磚茶中“金花”含量進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯磚茶,共50份,編號為FZC-1～FZC-50 陜西市場市售;孟加拉紅培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;PDA培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;冠突散囊菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

MJ-160BSH-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;AESAP1064拍擊式均質(zhì)器 梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;BHC-1300Ⅱ A2生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;UPH-3-20T純水機(jī) 四川優(yōu)普超純科技有限公司;QL-901渦旋振蕩器 其林貝爾儀器制造有限公司;CX41顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司;EVOSf1萬能熒光數(shù)碼顯微鏡 美國AMG公司。

1.2 實驗方法

參照GB/T 9833.3-2013《緊壓茶 第三部分:茯磚茶》[15]的方法要求,具體方法如下。

1.2.1 取樣及制樣 取樣:a. 茶餅取樣[16]:取樣器分別于四個角及中心,五個點取樣,所取樣品混合后,作為檢樣。b. 袋裝或已分解樣品:混合均勻后,作為檢樣。

制樣:稱取25 g茶葉樣品,置于盛有225 mL無菌水的帶濾膜均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器于5000 r/min拍打2 min。為防止茶葉樣品刺破均質(zhì)袋,可浸泡3 min后再進(jìn)行拍擊混勻。

1.2.2培養(yǎng)及計數(shù) 稀釋:制樣完成后記為10-1稀釋液,取1 mL該稀釋液注入含有9 mL無菌水的試管中,混合均勻,記為10-2稀釋液,依次逐步稀釋至10-5。

傾注培養(yǎng)基:孟加拉紅培養(yǎng)基于(46±1) ℃水浴保溫。選擇10-3、10-4及10-5三個稀釋液為試樣樣液,分別吸取1 mL加入無菌培養(yǎng)皿中,每個稀釋液做兩個平行。將20～25 mL孟加拉紅培養(yǎng)基傾注于平皿中,緩緩轉(zhuǎn)種平皿使其混勻。

培養(yǎng):培養(yǎng)基凝固后,倒置于(28±1) ℃培養(yǎng)5 d,觀察菌落計數(shù)。

菌落計數(shù):選擇適宜計數(shù)范圍(兩個平行平板菌落平均數(shù)為10～150 CFU)內(nèi)平板進(jìn)行觀察,記錄各系列稀釋度平板上全部“金花”含量,若兩個連續(xù)的梯度平均菌落數(shù)均10～150 CFU之間,按照下列公式計算。并記錄雜菌生長情況。

其中,N-樣品中菌落數(shù);C-平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和;n1-第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個數(shù);n2-第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個數(shù);d-稀釋因子(第一稀釋度)。

1.2.3 菌落形態(tài)觀察 培養(yǎng)條件同1.2.2,即(28±1) ℃培養(yǎng)5 d,后觀察各試樣上“金花”的分布情況,對比1～50個試樣“金花”菌落的形狀、大小、色澤及析出物狀態(tài)。

1.2.4 菌體形態(tài)觀察 將冠突散囊菌標(biāo)準(zhǔn)菌株,接種至PDA培養(yǎng)基上,于(28±1) ℃培養(yǎng)5 d,用接種針挑取黃色菌絲體置于滴加無菌水的載玻片上,普通顯微鏡觀察,尋找菌絲體及分生孢子。于(28±1) ℃培養(yǎng)9 d后,用接種針挑取菌落中褐色菌絲體置于滴加無菌水的載玻片上,萬能熒光數(shù)碼顯微鏡觀察,尋找閉囊殼和菌絲體。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每樣品采用三個梯度,每個梯度兩個平行,同時做樣品平行,每個樣品共計三梯度四平行。按照15～150 CFU/皿的適宜計數(shù)范圍,選取平行平板進(jìn)行計數(shù)并分析。將平行樣品的不同含量計算,并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誤分析。

數(shù)據(jù)分析軟件采用EXCEL 2016,繪圖軟件采用Origin 2018。

2 結(jié)果及分析

2.1 50份茯磚茶樣品中“金花”含量

從表1中可以看出,茯磚茶產(chǎn)品中“金花”含量的多少與茯磚茶凈含量和保存時間均無直接聯(lián)系。這也反映出微生物生長的不確定性,生長基質(zhì)的種類及培養(yǎng)環(huán)境條件的變化,才是影響茯磚茶產(chǎn)品中“金花”含量的主因。FZC-1～FZC-48共48份茯磚茶樣品中“金花”生長良好,FZC-49和FZC-50中除了“金花”生長外,還存在其他雜霉的生長,故在此不做計數(shù)。其中“金花”含量最高的為FZC-35,為350×104CFU/g;含量最低的為FZC-2和FZC-4,均為20×104CFU/g。胡治遠(yuǎn)等人[14]對湖南地區(qū)采集18種不同品種茯磚茶樣品檢測,其中最高含量為2.8×106CFU/g干茶,最低含量為2.8×104CFU/g干茶。陳然等人[17]對六堡茶中真菌進(jìn)行檢測,真菌總數(shù)在102～103CFU/g干茶?？梢钥闯?陜西地區(qū)茯磚茶中的“金花”含量略高于其他地區(qū)磚茶。

表1 50份茯磚茶樣品中“金花”含量檢測結(jié)果Table 1 Test results of “Golden Flower” in 50 samples

2.2 50份茯磚茶中“金花”含量分布

從圖1可以看出,48份可計數(shù)茯磚茶中“金花”含量均符合GB/T 9833.3-2013《緊壓茶 第三部分:茯磚茶》中對冠突散囊菌含量的要求(20×104CFU/g);44份茯磚茶中“金花”含量符合DBS61/0006-2014 《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 涇陽茯磚茶》[18]中對冠突散囊菌含量的最低要求(30×104CFU/g)。其中,含量大于200×104CFU/g的樣品為11個,小于30×104CFU/g的樣品為4個。

圖1 50份茯磚茶中“金花”含量分布圖Fig.1 Distribution of “Golden Flower” content in 50 samples

2.3 各試樣中“金花”菌落形態(tài)

從圖2中可以看出,各茯茶中“金花”的菌落形態(tài)各有差異,在5 d的培養(yǎng)時間后,各菌落的生長速率有所差異。其中FZC-49和FZC-50兩種茯茶中有其他雜菌出現(xiàn)。FZC-1～FZC-48為最終計數(shù)時各樣品的菌落圖,可從FZC-1～FZC-48中觀察出不同品種茶葉基質(zhì)上的冠突散囊菌在同一培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及數(shù)量分布,菌落可呈現(xiàn)亮黃色、暗黃色、褐色或淡黃色。辛樂等人[16]采用孟加拉紅培養(yǎng)基對茯磚茶中金花含量進(jìn)行檢測,培養(yǎng)5～6 d后,菌落有褐色出現(xiàn),邊緣黃色。

圖2 “金花”形態(tài)計數(shù)圖Fig.2 Colony morphology of “Golden Flower” in 50 samples注:1～50:分別表示FZC-1～FZC-50的菌落分布圖。

金花含量的多少影響茯磚茶的品質(zhì),而渥堆是茯磚茶生產(chǎn)過程的重要環(huán)節(jié),菌落的繁殖在這個過程中發(fā)生,需要根據(jù)不同的茶葉品種優(yōu)化不同的渥堆發(fā)酵條件,使得冠突散囊菌在茶葉基質(zhì)中保持良好的活性,迅速繁殖。

圖3 冠突散囊菌在PDA上菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of Eurotium cristatum in PDA注:a:PDA上培養(yǎng)5 d;b:PDA上培養(yǎng)9 d。

2.4 冠突散囊菌特征

將冠突散囊菌接種于PDA培養(yǎng)基,置于(28±1) ℃培養(yǎng)5 d后,形狀近圓形,較整齊,中心橄欖褐色,有液體滲出,周圍培養(yǎng)基變色;9 d后,菌落形態(tài)趨于圓形,整齊,中心褐色范圍擴(kuò)大。

“金花”菌繁殖過程分為有性繁殖和無性繁殖,兩者伴隨產(chǎn)生。培養(yǎng)后期,有性繁殖可產(chǎn)生大量的閉囊殼(圖4c),球形,閉囊殼成熟后破裂(圖4d),釋放出子囊;無性繁殖會產(chǎn)生分生孢子頂囊,連接分生孢子梗及分生孢子,分生孢子呈球狀(圖4e,圖4f)。此結(jié)果同彭曉赟等人[19]、陳桂梅等人[20]及譚玉梅等人[21]對冠突散囊菌繁殖過程的增殖方式研究相符,均在培養(yǎng)過程中描述了冠突散囊菌有性繁殖和無性繁殖的狀態(tài),閉囊殼和子囊孢子明顯。

圖4 冠突散囊菌不同繁殖特性Fig.4 Characteristics of Eurotium cristatum注:c:閉囊殼及菌絲;d:閉囊殼釋放子囊;e:菌絲體;f:分生孢子頭及分生孢子。

3 結(jié)論

對陜西省地區(qū)50份茯磚茶樣品中“金花”含量進(jìn)行檢測,其中有48份茯磚茶樣品中“金花”生長良好,生長過程中伴隨無性繁殖和有性繁殖階段,菌落可呈現(xiàn)亮黃色、暗黃色、褐色或淡黃色?！敖鸹ā焙孔罡叩臑镕ZC-35,為350×104CFU/g;含量最低的為FZC-2和FZC-4,均為20×104CFU/g。有48份茯磚茶中“金花”含量均符合GB/T 9833.3-2013《緊壓茶 第三部分:茯磚茶》中對冠突散囊菌含量的最低要求(20×104CFU/g);44份茯磚茶中“金花”含量符合DBS61/0006-2014《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 涇陽茯磚茶》中對冠突散囊菌含量的最低要求(30×104CFU/g)。兩份茶葉中“金花”含量符和標(biāo)準(zhǔn)要求,但伴有雜菌生長。陜西地區(qū)茯磚茶中“金花”含量符和標(biāo)準(zhǔn)要求,對于雜菌情況需要更進(jìn)一步的把控,確保質(zhì)量安全。

“金花”作為茯磚茶中的特征菌,其含量決定了茯磚茶的品級。不同茶葉品種基質(zhì)茯磚茶中的冠突散囊菌在相同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)有所差異,選擇良好的培養(yǎng)基質(zhì)是關(guān)鍵。在工業(yè)化生長的過程中,使其大量產(chǎn)生子囊孢子的同時,需防止其他雜菌的生長。茯磚茶生產(chǎn)工藝比較成熟,但還應(yīng)研究不同類型冠突散囊菌的繁殖機(jī)理,控制良好的培養(yǎng)條件,進(jìn)一步增加子囊孢子的產(chǎn)出率。尤其是針對新的茯磚茶培養(yǎng)基質(zhì)種類的不斷增加,深入優(yōu)化該菌的生長條件更為重要。