周 琪，陳 晨,2,*，周福慧，胡文忠,2，趙 蕾，許源源

（1.大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600；2.生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600）

鮮切蘋果清脆多汁且富含多種抗氧化營養(yǎng)物質，是餐飲行業(yè)、學校營養(yǎng)配餐以及家庭消費中廣受歡迎的鮮切產品之一；其目前在歐洲、美國、日本等發(fā)達國家已經實現(xiàn)系統(tǒng)化、規(guī)范化生產，在鮮切市場中占有重要地位[1]。然而鮮切機械操作破壞了蘋果細胞結構的完整性，使得本來因區(qū)域化分布而被分隔開的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和酚類物質接觸，誘發(fā)了酶促褐變反應，從而降低鮮切蘋果的貯藏品質，嚴重影響其商品價值[2-3]。短波紫外線（ultraviolet-C，UV-C）處理被認為是一種安全的殺菌技術，目前已允許其用于食品表面的殺菌[4]。本課題組前期研究以及文獻報道均表明適宜劑量的UV-C處理可以有效控制鮮切蘋果貯藏期間的褐變，同時保持其營養(yǎng)品質[5-7]；但UV-C處理并不能抑制PPO活力或降低總酚含量[5]，因此推測UV-C可能是通過其他途徑抑制鮮切蘋果的褐變。

近年來，越來越多研究表明酶促褐變不僅與酚類物質含量以及PPO活力有關，還受細胞膜透性以及膜脂過氧化等多因素影響。例如Toivonen[8]、Cantos[9]、Li Zhenghong[10]等的研究均表明細胞膜的完整性是影響鮮切果蔬褐變速率的關鍵因素。UV-C處理有助于提高鮮切楊桃貯藏過程中細胞膜的完整性，進而控制其褐變反應[11]。細胞膜被破壞除了是鮮切處理帶來的直接機械損傷外，更主要是機械損傷引發(fā)大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生，引起了細胞膜的氧化損傷和破壞，最終導致細胞膜的區(qū)室化功能喪失，從而加快了酶促反應的發(fā)生。提高抗氧化能力、緩解ROS引發(fā)的氧化損傷及膜脂過氧化，進而維持細胞膜的完整性，可以有效控制鮮切果蔬貯藏過程中的褐變進程[5,12-13]。由此可見，鮮切果蔬褐變反應與ROS代謝有著密切的關系[14]。研究發(fā)現(xiàn)適宜劑量的UV-C處理能維持草莓果實采后ROS代謝通暢，抑制膜脂過氧化反應發(fā)生，延緩果實衰老的發(fā)生。但UV-C控制鮮切蘋果褐變與其ROS代謝相關性仍缺乏系統(tǒng)研究。

本研究以鮮切蘋果為研究對象，分析UV-C處理后鮮切蘋果在貯藏過程中ROS水平、抗氧化相關酶活力、抗氧化物質含量以及非酶抗氧化能力的變化，系統(tǒng)研究UV-C處理對鮮切蘋果褐變控制與ROS代謝的相關性，為鮮切蘋果的貯藏保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富士蘋果購于大連經濟技術開發(fā)區(qū)樂購超市。L-蛋氨酸、氮藍四唑、聚乙烯吡咯烷酮、亞油酸鈉、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、冰醋酸、核黃素、濃氨水、濃硫酸、四氯化鈦、無水乙醇、丙酮等（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

CR400/CR410型色差計 日本Konica Minolta公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋、恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；AL240電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；UV-C-9200紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；T-25勻漿機 德國IKA公司；DHG-9053A電熱BR4i臺式高速冷凍離心機 法國Jouan公司；SiM-F140制冰機 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預處理

蘋果經自來水清洗后，在滅菌砧板上用滅菌的削皮刀削皮去除果核，切割成約1 cm3的小塊，采用4.5 kJ/m2的UV-C對鮮切蘋果進行輻照處理5 min[5]，以未處理的樣品作為對照，將對照樣品和處理后的樣品均勻放入一次性托盤中并用聚乙烯保鮮膜包好，置于4 ℃冷庫中貯藏10 d，每2 d取樣用于分析生理生化變化。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 褐變指數(shù)

采用色差計測定L*、a*、b*值，褐變指數(shù)根據(jù)下式計算[15]。

1.3.2.3 VC含量

VC含量的測定采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[17]。

1.3.2.4 抗氧化酶酶活力

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化酶（ascorbate peroxidase，APX）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活力測定參考閆媛媛等[18]的方法，谷胱甘肽還原酶（glutathion reductase，GR）活力測定參考Zhang Jie等[19]的方法。

1.3.2.5 抗氧化活力

抗氧化活力的測定采用DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力以及還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）3 種方法，具體方法參考文獻[20]。以水溶性VE（Trolox）為標準抗氧化物質，樣品的抗氧化活力以每克樣品中Trolox的物質的量表示。

1.3.2.6 丙二醛含量

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定參考Ren Yali等[21]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、主成分分析（principal component analysis，PCA），顯著性分析采用鄧肯氏多重比較法，采用Pearson相關性分析，采用Origin 8.0軟件做圖。

2 結果與分析

2.1 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中褐變程度的影響

圖 1 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中褐變的控制效果Fig. 1 Effect of UV-C on browning index of fresh-cut apples during storage

鮮切蘋果貯藏期間的褐變程度用褐變指數(shù)表示，褐變指數(shù)值越大表示褐變程度越嚴重。如圖1所示，對照組和UV-C處理組鮮切蘋果在貯藏過程中褐變指數(shù)值均呈現(xiàn)上升趨勢，但UV-C處理組樣品的褐變指數(shù)上升較慢，且在10 d的貯藏過程均顯著低于對照組（P＜0.05），說明UV-C處理能夠有效控制鮮切蘋果貯藏期間的褐變。

2.2 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中·產生速率、H2O2含量的影響

圖 2 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中·產生速率（A）及H2O2含量（B）的影響Fig. 2 Effect of UV-C on · production rate (A) and HO content (B)22 of fresh-cut apples during storage

2.3 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中膜脂過氧化的影響

圖 3 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中LOX活力（A）及MDA含量（B）的影響Fig. 3 Effect of UV-C on LOX activity (A) and MDA content (B) of fresh-cut apples during storage

LOX能夠催化多聚不飽和脂肪酸的過氧化反應，從而啟動膜脂過氧化，破壞膜結構與功能[10]。如圖3A所示，對照組鮮切蘋果貯藏過程中LOX活力呈先上升后下降又上升的波浪式變化，UV-C處理組樣品LOX活力變化趨勢與對照組相似，但UV-C處理能夠延遲LOX活力的升高，且在10 d的貯藏過程中LOX活力顯著低于對照組（P＜0.05）。MDA是植物細胞膜膜脂過氧化產物，MDA可使膜中的酶蛋白發(fā)生交聯(lián)、聚合反應，引起細胞膜的損傷和破壞，最終導致細胞膜的區(qū)室化功能喪失，從而加快酶促反應的發(fā)生[17]。如圖3B所示，對照組和UV-C處理組鮮切蘋果在貯藏過程中MDA含量逐漸上升，UV-C處理組從貯藏的第6天開始顯著低于對照組（P＜0.05）。由此可見，UV-C處理可以抑制鮮切蘋果的LOX活力，降低膜脂過氧化程度以及MDA的積累，有助于維持膜結構的完整性，進而控制褐變反應。

2.4 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中抗氧化酶活力的影響

SOD、CAT、APX和GR是植物體內重要的抗氧化酶。研究表明UV-C處理能夠提高鮮切紫甘藍[19]和鮮切石榴[22]的抗氧化酶活力。UV-C處理對鮮切蘋果抗氧化酶活力的影響如圖4所示，對照組和UV-C處理組鮮切蘋果在貯藏過程中SOD活力均呈先下降后上升的趨勢，在貯藏第4天時活力最低（圖4A）。UV-C處理組樣品SOD活力在貯藏4～10 d內均顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖4B所示，對照組鮮切蘋果貯藏過程中CAT活力呈逐漸下降趨勢，UV-C處理能減緩鮮切蘋果CAT活力下降，當貯藏至第10天時，與第0天相比，對照組鮮切蘋果的CAT活力下降了62.34%，而UV-C處理組樣品CAT活力僅下降了10.86%。UV-C處理對鮮切蘋果APX和GR活力的影響分別如圖4C、D所示，二者在貯藏過程中均呈先上升后下降的趨勢，在貯藏第2天時達到最大值，UV-C處理能夠顯著提高鮮切蘋果APX和GR的活力。上述研究結果表明，UV-C處理能夠提高鮮切蘋果貯藏過程中抗氧化酶的活力，這樣有助于及時清除因機械損傷和組織氧化而產生的過量ROS，對延緩鮮切蘋果氧化損傷及組織褐變具有積極作用。

圖 4 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中SOD（A）、CAT（B）、APX（C）和GR（D）活力的影響Fig. 4 Effect of UV-C on SOD (A), CAT (B), APX (C) and GR (D)activities of fresh-cut apples during storage

2.5 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中VC含量的影響

圖 5 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中VC含量的影響Fig. 5 Effect of UV-C on vitamin C content of fresh-cut apples during storage

VC是鮮切水果中重要的抗氧化物質，具有清除ROS的能力，同時，在VC-谷胱甘肽循環(huán)中，APX以VC為基質將H2O2轉化為H2O[23]。如圖5所示，對照組和UV-C處理組鮮切蘋果的VC含量在貯藏過程中均逐漸下降，但UV-C處理組樣品VC含量在貯藏10 d內均顯著高于對照組，UV-C處理能夠有效抑制VC在鮮切蘋果貯藏過程中的氧化損失，更好地保持其抗氧化能力，保護細胞組織免受氧化損害而延緩果實衰老。

2.6 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中抗氧化能力的影響

圖 6 UV-C處理對鮮切蘋果貯藏過程中DPPH自由基（A）和ABTS陽離子自由基（B）清除能力以及FRAP（C）的影響Fig. 6 Effect of UV-C on DPPH (A) and ABTS (B) radical scavenging activities and reducing power (C) of fresh-cut apples during storage

UV-C處理對鮮切蘋果抗氧化能力的影響分別采用ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力、FRAP 3 種方法來評價。如圖6A、B所示，對照組和UV-C處理組鮮切蘋果對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力在貯藏過程中均呈下降趨勢，UV-C處理組樣品對ABTS陽離子自由基的清除能力在貯藏后期（6～10 d）下降速率減慢，清除能力顯著高于對照組；而對DPPH自由基的清除能力在貯藏10 d過程中均顯著高于對照組（P＜0.05）。對照組鮮切蘋果的FRAP在貯藏過程也呈下降趨勢，但經UV-C處理后，貯藏前8 d鮮切蘋果的FRAP無顯著變化，且顯著高于對照組（圖6C），隨后急劇下降，貯藏至第10天時，與對照組無顯著差異（P＞0.05）。UV-C處理能夠不同程度地減緩鮮切蘋果貯藏期間對ABTS陽離子自由基和DPPH自由基的清除能力以及還原能力的下降。同時，研究表明UV-C處理可以提高多種鮮切果蔬的抗氧化能力[24-27]，抗氧化能力的升高在一定程度上提高了鮮切果蔬的ROS代謝能力，從而減輕ROS對組織產生的氧化損傷。

2.7 PCA結果

圖 7 鮮切蘋果貯藏過程中褐變指數(shù)及ROS代謝相關指標的PCA（A）及綜合得分（B）Fig. 7 Principal component analysis (A) of BI, ROS metabolismassociated indices and comprehensive scores (B) of fresh-cut apples during storage

PCA是多元統(tǒng)計中的一種數(shù)據(jù)挖掘技術，其將多個變量的信息綜合到較少的幾個變量上，這些新的變量即為主成分[28]。對UV-C處理組和對照組鮮切蘋果貯藏過程中褐變指數(shù)及ROS代謝相關指標進行PCA，結果表明主成分1貢獻率為72.03%，主成分2貢獻率為15.40%，累積貢獻率達到87.43%；因此，可將以上13 個測定指標綜合成2 個主成分。如圖7A所示，第一主成分與VC含量、FRAP、ABTS陽離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、APX和CAT活力呈正相關，與·產生速率、H2O2和MDA含量呈負相關；第二主成分與SOD活力呈正相關，與LOX活力呈負相關。以第一主成分為X軸，第二主成分為Y軸建立的主成分載荷、得分綜合坐標系，可反映隨貯藏時間延長，鮮切蘋果的ROS代謝總體趨勢，即位于X軸右方和Y軸上方表示酶與非酶抗氧化能力較強，而位于X軸左方以及Y軸下方表示ROS積累較多，氧化損傷程度較深。與對照組相比，UV-C處理組樣品主要位于X軸右方和Y軸上方，由此可見，UV-C處理后樣品具有較強的抗氧化能力，而對照組樣品在貯藏過程中氧化損傷較嚴重。通過計算綜合得分（圖7B），整個貯藏期間，對照組和UV-C處理組的鮮切蘋果綜合得分呈逐漸下降趨勢，說明鮮切蘋果的ROS代謝能力逐漸下降，但UV-C處理可顯著減緩下降速率，并且綜合評分始終高于對照組。進一步說明UV-C處理能夠提高鮮切蘋果的抗氧化能力，使ROS代謝暢通，從而減少ROS的積累，減輕氧化損傷。

表 1 褐變指數(shù)與·產生速率、H2O2含量、MDA含量以及酶與非酶抗氧化能力的相關性分析Table 1 Pearson correlation coef fi cients of BI, · production rate, HOcontent, MDA content, enzymatic and non-enzymatic antioxidants and 22 antioxidant capacities of fresh-cut apples during storage

表 1 褐變指數(shù)與·產生速率、H2O2含量、MDA含量以及酶與非酶抗氧化能力的相關性分析Table 1 Pearson correlation coef fi cients of BI, · production rate, HOcontent, MDA content, enzymatic and non-enzymatic antioxidants and 22 antioxidant capacities of fresh-cut apples during storage

注：*.顯著相關（P＜0.05），**.極顯著相關（P＜0.01）。

指標 褐變指數(shù) O2-·產生速率 1.000 0.903** 0.245 -0.780** -0.890** -0.733** 0.045 0.888** -0.961** -0.924** -0.902** -0.909**H2O2含量 1.000 0.371 -0.939** -0.742** -0.715** -0.239 0.799** -0.867** -0.920** -0.721** -0.816**SOD活力 1.000 -0.417 0.058 -0.599* -0.614* 0.348 -0.187 -0.440 -0.281 -0.252 APX活力 1.000 0.588* 0.725** 0.381 -0.772** 0.730** 0.855** 0.616* 0.736**CAT活力 1.000 0.573 -0.362 -0.782** 0.877** 0.692* 0.801** 0.806**GR活力 1.000 0.090 -0.848** 0.746** 0.760** 0.806** 0.798**LOX活力 1.000 0.066 -0.113 0.191 -0.168 -0.129 MDA含量 1.000 -0.847** -0.895** -0.822** -0.913**DPPH自由基清除能力 1.000 0.888** 0.929** 0.950**ABTS陽離子自由基清除能力 1.000 0.798** 0.908**FRAP 1.000 0.901**VC含量 1.000-·產生速率 H2O2含量 SOD活力 APX活力 CAT活力 GR活力 LOX活力 MDA含量 DPPH自由基清除能力 ABTS陽離子自由基清除能力 FRAP VC含量褐變指數(shù) 1.000 0.924** 0.845** 0.107 -0.721** -0.829** -0.606* 0.071 0.829** -0.955** -0.903** -0.831** -0.929**O2

2.8 相關性分析結果

3 討 論

鮮切水果的酶促褐變是一個復雜的過程，一般認為鮮切處理使水果組織結構和細胞空間區(qū)域化喪失，使原來的PPO與底物多酚的分區(qū)定位遭到破壞，導致酶與底物接觸，誘發(fā)了酶促褐變反應[29-30]；同時，切割帶來的機械損傷也會誘導產生大量的ROS，例如·和H2O2，過量的ROS會攻擊細胞膜脂，導致膜脂過氧化加劇，使膜透性增大，破壞酚-酚酶的區(qū)域性結構，進而加劇酶促反應的發(fā)生[31]。本研究中，鮮切蘋果的·產生速率和H2O2含量分別從貯藏0、2 d后開始升高，說明其體內ROS代謝系統(tǒng)的平衡逐漸被破壞，不斷產生ROS。而膜脂過氧化產物MDA含量也在貯藏過程中升高，表明隨著貯藏時間的延長，鮮切蘋果的細胞膜完整性逐漸被破壞，相關性分析結果顯示鮮切蘋果的MDA含量與·產生速率以及H2O2含量呈顯著正相關。UV-C處理組鮮切蘋果貯藏期間ROS和MDA含量顯著低于對照組，結合PCA結果，顯示對照組樣品貯藏過程中氧化損傷程度高于UV-C處理組樣品，說明UV-C處理可減少鮮切蘋果ROS的積累，抑制膜脂質過氧化的發(fā)生，從而維持膜的完整性，保持細胞空間的區(qū)域化，進而延緩褐變反應的發(fā)生。同時，相關性分析結果顯示鮮切蘋果褐變程度（褐變指數(shù)）與ROS和MDA含量呈極顯著正相關，進一步證實了鮮切蘋果的褐變與ROS代謝密切相關，即UV-C處理通過調節(jié)ROS代謝控制鮮切蘋果的褐變。

ROS的大量積累會加劇鮮切蘋果的酶促褐變，但水果體內具有一套完整的抗氧化酶防御系統(tǒng)，包括SOD、CAT、APX、GR等[32]，可以有效清除ROS，減緩氧化損傷。本研究中鮮切蘋果的CAT、APX和GR活力在貯藏的前2 d內升高，隨后逐漸下降。研究表明機械損傷初期誘導產生的ROS可以作為一種信號分子上調防御系統(tǒng)來抵御逆境傷害[33]；因此，鮮切蘋果貯藏初期產生的ROS可能作為信號分子誘導CAT、APX和GR活力提高，但是SOD活力在貯藏初期逐漸下降，可以推測在鮮切蘋果中CAT、APX和GR對ROS的清除作用要大于SOD，相關性分析也顯示CAT、APX和GR活力與ROS水平呈極顯著負相關。隨著貯藏時間的延長，ROS水平逐漸上升，ROS積累引起的氧化脅迫導致鮮切蘋果代謝失調，使CAT、APX和GR對ROS的清除能力減弱，從而加劇了氧化損傷[35]。與之相反的是，SOD活力在貯藏4 d后逐漸升高，SOD的主要功能是清除·；因此在貯藏后期（6 d以后）·產生速率逐漸減緩。UV-C處理能夠提高鮮切蘋果SOD、CAT、APX和GR活力，在貯藏過程中這4 種抗氧化酶活力均顯著高于對照組樣品，相關性分析顯示鮮切蘋果抗氧化酶（除SOD）活力與褐變指數(shù)呈負相關（r＝-0.606～-0.721）；因此，可以推測UV-C處理通過提高鮮切蘋果的抗氧化酶活力，緩解由ROS引起的氧化損傷，進而控制貯藏過程中的褐變反應。

DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力和FRAP是評價非酶抗氧化能力常見的3 種方法。在貯藏過程中鮮切蘋果對自由基的清除能力以及FRAP逐漸減弱，抗氧化防御系統(tǒng)功能的下降加劇了鮮切蘋果的褐變。相關性分析顯示鮮切蘋果的抗氧化能力與褐變指數(shù)呈極顯著負相關（r＝-0.831～-0.955）。同時，許多研究表明鮮切水果的抗氧化能力與VC含量相關[17,32,35]，這與本研究相關性分析結果一致：鮮切蘋果的抗氧化能力（DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力和FRAP）與VC含量呈顯著正相關。UV-C處理能夠提高鮮切蘋果的VC含量以及抗氧化能力；由此可見，UV-C處理組樣品中較高的VC含量使其具有較強抗氧化能力，從而加速ROS代謝，緩解ROS對鮮切蘋果產生的氧化損傷。

綜上所述，UV-C處理通過提高鮮切蘋果的抗氧化防御系統(tǒng)（酶和非酶抗氧化能力），維持細胞內ROS的代謝平衡，減少ROS的積累，從而降低了ROS對組織產生的氧化損傷，保持膜的完整性，延緩PPO與酚類物質的反應，進而控制褐變。