樊曉嵐，李月圓，張引引，韓云云，李 玲，閆師杰,*，肖麗霞*

（1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；4.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384；5.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv. Yali）是薔薇科梨屬植物，因果柄突起形似鴨頭而得名，屬中國白梨[1]。鴨梨屬耐貯運(yùn)梨品種，適時（9月中旬）采后適當(dāng)處理并貯于0 ℃可延長貯藏期至次年的5～6月份，但是流通環(huán)節(jié)中發(fā)生的果心褐變現(xiàn)象（黑心病）很大程度影響了其商品價值[2-3]。鴨梨在入庫后30～50 d開始出現(xiàn)果心褐變，至150～180 d時褐變大規(guī)模爆發(fā)[4]，其中30～50 d出現(xiàn)的褐變稱為早期褐變，此時鴨梨果心部位出現(xiàn)少量褐變[5]，但果肉仍為雪白色，認(rèn)為是機(jī)體組織冷耐受能力不足引起的低溫傷害，而貯藏晚期150～180 d褐變組織逐漸發(fā)展至果肉部位，直至果實組織全部褐變，完全失去銷售價值，此時發(fā)生的褐變多歸納為衰老造成的機(jī)體紊亂。在一些對植物抗冷品種選育的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物細(xì)胞膜脂中不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFA）含量高時，機(jī)體表現(xiàn)出對低溫的適應(yīng)性[6]。同時在一些對易發(fā)生冷害熱帶水果的研究中也發(fā)現(xiàn)，隨冷藏時間延長，機(jī)體UFA與飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）的比率降低，認(rèn)為UFA含量與冷害發(fā)生密切相關(guān)[7]。脂肪酸去飽和酶（fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）能催化機(jī)體內(nèi)SFA特定位置形成雙鍵以形成UFA，在一些模式作物中過表達(dá)ω-3FAD可以大大提高植株中UFA含量[8]，從而顯著提高其抗冷性[9]。對桃果實的研究顯示，ω-3FAD基因轉(zhuǎn)錄本含量的下降是果實冷害發(fā)生的重要原因[10]。另外，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）在高等植物中存在較多，其能催化一些多不飽和脂肪酸（一般是順,順-1,4戊二烯結(jié)構(gòu)）轉(zhuǎn)變?yōu)镾FA，參與了機(jī)體多種氧化、過氧化作用，被認(rèn)為是調(diào)控機(jī)體成熟衰老的關(guān)鍵酶[11-12]。楊青珍[13]研究了獼猴桃以兩種降溫方式降至貯藏溫度后，貯藏期間其冷害與LOX活性的關(guān)系。目前關(guān)于ω-3FAD的研究多集中在番茄[14]、桃[15]、香蕉[16]、石榴[17]等果實采后貯藏中的參與機(jī)制等，但在鴨梨中鮮見報道；LOX表達(dá)與鴨梨褐變形成的相關(guān)性已得到證實，但其作用機(jī)制仍不清楚。

因此本實驗擬通過研究不同方法降溫后鴨梨貯藏期間果心褐變指數(shù)、果心脂肪酸組成、FAD基因表達(dá)情況、LOX活力與LOX基因表達(dá)情況，從抗冷性角度解釋緩慢降溫減少鴨梨褐變的深層機(jī)理，為鴨梨采后貯藏研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨梨采自河北省石家莊市深州市大城北村，于2015年9月13日采摘（根據(jù)農(nóng)戶大量采收經(jīng)驗，9月中旬為適時采收），選擇單果質(zhì)量約（230±10）g、無蟲害、無機(jī)械損傷的果實進(jìn)行實驗。采摘后套網(wǎng)套裝入內(nèi)襯微孔膜（大小80 cm×75 cm、厚度0.05～0.06 mm、孔徑15～20 μm，由國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心生產(chǎn)），分裝60 箱，每箱25 個果實。將實驗材料用廂式貨車裝載，常溫運(yùn)輸?shù)教旖蜣r(nóng)學(xué)院。

常用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser）、熒光定量試劑盒（RR820A TB Green? Premix Ex Taq? II） 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；引物由上海生工公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo 2000c型紫外分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific科技有限公司；PX2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Thermo公司；LX-200迷你離心機(jī) 海門市其林貝爾儀器公司；CFX Connect溫度梯度定量PCR儀、ChemiDoc X RST凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；A11 BS25分析研磨機(jī)德國IKA公司；雪花狀制冰機(jī) 上海迭戈生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

分別采用急速降溫和緩慢降溫對鴨梨進(jìn)行處理。30 箱急速降溫處理（0 ℃預(yù)冷24 h，此時微孔膜敞開）后，直接放入（0.0±0.5）℃貯藏（此時微孔膜蓋上）；另外30 箱緩慢降溫處理果實于12 ℃預(yù)冷24 h，待果品溫度為12 ℃開始降溫，每5 d降2 ℃，共30 d降至0 ℃貯藏。每貯藏30 d進(jìn)行一次實驗，隨機(jī)從每個處理分別選取45 個果實，30 個用于觀察果心褐變情況，另15 個取果心組織進(jìn)行液氮冷凍，并于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩①A藏0 d的鴨梨果實（即為剛采摘的新鮮鴨梨）相應(yīng)處理作為對照材料。

1.3.2 果心褐變指數(shù)測定

熟悉常用量具的性能和使用方法，掌握產(chǎn)品各項技術(shù)指標(biāo)，嚴(yán)格執(zhí)行企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、檢驗規(guī)程，進(jìn)行產(chǎn)品加工過程的質(zhì)量檢驗和控制，以及產(chǎn)品的實驗和測試，對生產(chǎn)加工過程中出現(xiàn)的產(chǎn)品質(zhì)量問題進(jìn)行處理和分析，并及時反饋，針對現(xiàn)場做好制程解析，并進(jìn)行改善活動，嚴(yán)格執(zhí)行各項規(guī)章制度和工作紀(jì)律，樹立服務(wù)生產(chǎn)的意識。

隨機(jī)選擇的30 個果實，每10 個為一組，共3 組。沿果實赤道部位橫切，依據(jù)果心橫切面褐變面積和程度劃分褐變級別，褐變級別與計算方法參考何利華等[18]的方法。

1.3.3 鴨梨果心部位脂肪酸含量的測定與雙鍵指數(shù)的計算

果心組織脂肪酸的提取和含量測定參考何子順等[19]的方法。雙鍵指數(shù)（double binding index，DBI）計算參考Shen Wenyun等[20]的方法。

1.3.4 LOX活力的測定

LOX酶液制備及活力測定參照閆師杰等[2]方法。以每毫克果肉每分鐘在234 nm波長處吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U），單位為U/mg。

1.3.5 鴨梨果心部位總RNA的提取及檢測

參考何利華[18]、Gasic[21]等的方法提取RNA，使用核酸蛋白儀測定波長260 nm和280 nm處吸光度，檢測總RNA純度；經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。如果電泳圖完整且OD260nm/OD280nm均在1.9～2.1之間，說明提取的總RNA質(zhì)量高，適合用于下一步實驗。

引物參考美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）登錄的中國白梨基因組信息，使用Primer premier 5軟件在FAD1、FAD2、FAD3基因保守區(qū)設(shè)計一對跨內(nèi)含子引物；LOX引物參照本實驗室已獲得的鴨梨LOX片段序列設(shè)計[22]；內(nèi)參基因引物為鴨梨PbActin。實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄（quantitative real time reverse transcription， qRT）-PCR引物序列見表1。

表 1 qRT-PCR特異性引物序列Table 1 Speci fi c primer sequences used for qRT-PCR

1.3.7 cDNA第一條鏈獲取與熒光定量PCR

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA第一條鏈，第一步去除基因組DNA，反應(yīng)體系包括500 ng/μL RNA、2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser，加RNase Free dH2O至10 μL，42 ℃孵育2 min；第二步反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系包括10 μL第一步反應(yīng)液、1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix1、1 μL RT Primer Mix、4 μL 5×PrimeScript Buffer 2、4 μL RNase Free dH2O，總體積為20 μL；反應(yīng)液混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37 ℃孵育15 min，85 ℃熱激5 s。cDNA溶液于-20 ℃保存或立即用于PCR反應(yīng)。

熒光定量PCR使用熒光定量試劑盒。qRT-PCR反應(yīng)采用25 μL體系：12.5 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）、2 μL上引物、2 μL下引物（10 μmol/L）、1 μL cDNA模板(100 ng/μL)、7.5 μL ddH2O；qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共30 個循環(huán)。

以鴨梨PbActin基因為內(nèi)參基因，以降溫前（貯藏0 d）樣品中相關(guān)基因表達(dá)量為標(biāo)尺，采用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 16.0軟件對以上實驗所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用Duncan法比較平均值之間的差異性，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。用Excel 2010軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同降溫方式對鴨梨貯藏過程中果心褐變指數(shù)的影響

圖 1 不同降溫方式對鴨梨冷藏期間果心褐變指數(shù)的影響Fig. 1 Effect of different cooling methods on core-browning index of Yali pears during cold storage

由圖1可知，鴨梨急速降溫組與緩慢降溫組分別于貯藏30 d和60 d開始出現(xiàn)果心褐變。隨著貯藏時間的延長，鴨梨果心褐變指數(shù)呈不同程度增長趨勢。其中，緩慢降溫組褐變指數(shù)增長趨勢比急速降溫組緩和，同一貯藏期，在60～180 d急速降溫組褐變指數(shù)極顯著大于緩慢降溫組（P＜0.01）。貯藏結(jié)束時（180 d），緩慢降溫組的褐變指數(shù)僅0.05%，而急速降溫組高達(dá)0.31%。以上結(jié)果說明，對于適時采收的鴨梨（9 月中旬），采用緩慢降溫處理方法能有效延緩果實衰老，抑制鴨梨果心褐變。

2.2 不同降溫方式對鴨梨貯藏過程中果心脂肪酸含量的影響

膜脂上脂肪酸分布影響著細(xì)胞膜流動性，UFA比例越高流動性越好。在遇到低溫環(huán)境時，較高的膜流動性保證了細(xì)胞正常的物質(zhì)交換，機(jī)體的抗冷性也就越高[23]。本實驗檢測到鴨梨果心部脂肪酸主要包括硬脂酸（C16:0）、棕櫚酸（C18:0）、油酸（C18:1）、亞油酸（C18:2）、亞麻酸（C18:3）。經(jīng)兩種降溫處理后鴨梨貯藏期間果心部位脂肪酸分布如表2所示。鴨梨果心的SFA以棕櫚酸為主，UFA以亞油酸和亞麻酸為主。鴨梨果心中UFA含量最高的是亞油酸，其次是油酸、亞麻酸。貯藏30 d，緩慢降溫組果心中3 種UFA含量均顯著高于急速降溫組（P＜0.05）；貯藏60～180 d期間急速降溫組果心亞麻酸含量均顯著高于緩慢降溫組（P＜0.05）。整體來看，緩慢降溫很好地保持了貯藏初期（0～30 d）鴨梨果心部位UFA含量，而急速降溫由于直接置于0 ℃，機(jī)體通過一系列調(diào)控作用產(chǎn)生更多的UFA來增強(qiáng)抗冷性，以適應(yīng)溫度驟變，這是植物體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生的低溫應(yīng)答機(jī)制[24]。

表 2 不同降溫方式下鴨梨貯藏過程中果心部位各種脂肪酸含量及雙鍵指數(shù)的變化Table 2 Change in fatty acid contents and double-binding index in core tissue of pears subjected to different cooling treatments

DBI是衡量組織中脂肪酸不飽和度的重要指標(biāo)。如表2所示，貯藏期間鴨梨果心DBI整體呈先增加后下降的變化趨勢，緩慢降溫組和急速降溫組分別在貯藏的120 d和60 d出現(xiàn)最大值。與急速降溫組比較，緩慢降溫組的DBI變化相對平緩，較好地維持了果實品質(zhì)。在貯藏期間，急速降溫組鴨梨果心脂肪酸不飽和度均顯著大于緩慢降溫組，冷藏環(huán)境誘導(dǎo)了機(jī)體的抗冷反應(yīng)；而相比緩慢降溫，急速降溫使鴨梨抗冷反應(yīng)更劇烈，果心中UFA總含量、脂肪酸不飽和度均顯著高于緩慢降溫的鴨梨，導(dǎo)致果實出現(xiàn)冷害癥狀，果心褐變嚴(yán)重。

2.3 不同降溫方式對鴨梨貯藏過程中果心部位FAD相對表達(dá)量的影響

圖 2 不同降溫方式對鴨梨貯藏過程中果心部位FAD相對表達(dá)量的影響Fig. 2 Relative expression levels of FAD gene in core tissue of Yali pears during cold storage after different cooling treatments

目前經(jīng)全基因組測序確定白梨ω-3FAD共3 個，本實驗根據(jù)中國白梨基因組信息中3 個ω-3FAD基因序列設(shè)計引物，為FAD1、FAD2、FAD3。由圖2A可知，急速降溫果實FAD1在0～30 d時明顯上調(diào)，120 d達(dá)到峰值（4.3），120～180 d下降至初始值附近。緩慢降溫組FAD1基因在貯藏30～150 d不活躍。由圖2B可知，F(xiàn)AD2基因在貯藏期間是受到抑制的，經(jīng)急速降溫與緩慢降溫處理后，貯藏各時期FAD2相對表達(dá)量均低于初始值，且同一貯藏時間急速降溫的FAD2相對表達(dá)量顯著高于緩慢降溫（P＜0.05）。由圖2C可知，F(xiàn)AD3在鴨梨貯藏中較為活躍，貯藏前30 d，相對表達(dá)量明顯上調(diào)，30 d時緩慢降溫組和急速降溫組分別為初始表達(dá)量的2.0、5.4 倍，且貯藏30～150 d，急速降溫組FAD3相對表達(dá)量顯著高于緩慢降溫組（P＜0.05）?？傊瑢τ? 個ω-3FAD，貯藏30～180 d中，急速降溫組中3 個基因都被低溫誘導(dǎo)，在120 d達(dá)到峰值后下降并趨于平緩，與果心褐變指數(shù)120 d達(dá)到最大值相吻合，這與魏雯雯[15]在桃中研究結(jié)果相一致。而緩慢降溫組，因為經(jīng)過梯度降溫，在貯藏期間（30～180 d）鴨梨受冷害情況有所緩解，在貯藏結(jié)束180 d時，3 個基因相對表達(dá)量才達(dá)到最大值，這在葡萄柚[25]的貯藏實驗中也有相同的發(fā)現(xiàn)。

2.4 不同降溫方式對鴨梨貯藏過程中果心部位LOX活力及LOX基因相對表達(dá)量的影響

LOX廣泛存在于植物體內(nèi)，啟動生物膜上UFA發(fā)生過氧化反應(yīng)，生成一系列生物活性物質(zhì)，在植物生長發(fā)育、果實成熟衰老和脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要功能[26]。由圖3A可知，兩個處理組的鴨梨LOX活力均為先上升后下降然后上升的趨勢。其中，在貯藏0～90、150～180 d，急速降溫組的LOX活力都高于緩慢降溫組。貯藏0 d，由于田間熱未散去，且鴨梨衰老度低，LOX活力處于較低水平。在0～30 d，緩慢降溫經(jīng)歷30 d梯度降溫，溫度較高，使鴨梨保持較高的生理代謝水平，受到冷害脅迫不嚴(yán)重，因此LOX活力水平低于急速降溫處理，這與韓云云等[27]的研究結(jié)果一致。隨著貯藏時間的延長，緩慢降溫與急速降溫組在60 d時LOX活力達(dá)到峰值，此時在30～60 d果心褐變指數(shù)都有不同程度的升高（圖1），這是因為0 ℃低溫脅迫誘導(dǎo)LOX活力升高，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)完整性下降，加劇了低溫對鴨梨果實的傷害，但是由于緩慢降溫的LOX活力稍低于急速降溫處理，因此果心褐變沒有急速降溫處理嚴(yán)重。

圖 3 不同降溫方式對鴨梨貯藏過程中果心部位LOX活力（A）及LOX基因相對表達(dá)量（B）的影響Fig. 3 LOX activity (A) and relative expression level of LOX gene (B) in core tissue of Yali pears during cold storage after different cooling treatments

由圖3B可知，兩個處理組LOX基因相對表達(dá)量均呈現(xiàn)先緩慢上升至高峰后逐漸下降，貯藏末期又上升的趨勢。貯藏0～30 d，急速降溫組LOX相對表達(dá)量急劇升高，可能是由于鴨梨從室溫下突然進(jìn)入（0±1）℃的冷庫環(huán)境，受到的冷害脅迫激活了LOX基因的表達(dá)，加速了膜脂過氧化。貯藏30～150 d期間，急速降溫組的LOX相對表達(dá)量高于緩慢降溫組，說明緩慢降溫處理抑制了LOX基因的表達(dá)，從而延緩鴨梨果心褐變的發(fā)生。

3 討 論

減少鴨梨果心褐變發(fā)生一直都是研究鴨梨貯藏的熱點(diǎn)問題。有研究指出緩慢降溫處理適時采收的鴨梨，可以有效抑制其果心褐變，延長貯藏期，提高貯藏品質(zhì)[28]，這是因為適時采收的鴨梨抗冷能力較差，急速降溫處理會使果實發(fā)生冷害，導(dǎo)致果心褐變[29]。本實驗中的鴨梨采于9月中旬，屬于適時采收，采用緩慢降溫處理降低了果心褐變指數(shù)，這與以往的研究結(jié)果相一致。

低溫貯藏可延緩成熟衰老進(jìn)程，是維持采后果實品質(zhì)最有效的方法之一。然而冷敏果實在低溫貯藏過程中易發(fā)生生理失調(diào)，造成冷害，導(dǎo)致品質(zhì)下降[30]。植物冷害主要涉及膜流動性改變[31]、代謝酶活性降低[32]等；因此當(dāng)植物處于低溫時，會啟動對低溫脅迫的響應(yīng)，體內(nèi)為了防止細(xì)胞大量失水調(diào)節(jié)滲透勢，減少酶活力的降低程度，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)使其處于穩(wěn)定狀態(tài)。相應(yīng)地，細(xì)胞膜組成成分也發(fā)生改變，UFA含量增加，有利于植物抗冷[33-34]；因此急速降溫處理中，受到低溫誘導(dǎo)，果心中UFA含量增加，以適應(yīng)環(huán)境溫度驟變。ω-3FAD基因也受冷害誘導(dǎo)，急速降溫組相對表達(dá)量變化較大，而緩慢降溫由于程序降溫，減少了冷害傷害，這與對番茄[35]、蜜瓜[36]的研究結(jié)果相一致。LOX能夠催化膜脂過氧化作用，增加脂質(zhì)的不飽和度，改變細(xì)胞膜的流動性，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性的損失和透過性加大，造成細(xì)胞膜區(qū)室化的打破，為多酚氧化酶與酚類底物提供反應(yīng)場所，使組織產(chǎn)生不可逆的損傷，最終引起褐變等代謝紊亂[37-38]。另外在荔枝[39]、香蕉[40]、龍眼[41]和皇冠梨[42]中也發(fā)現(xiàn)，LOX作用于細(xì)胞膜，造成膜脂降解和區(qū)室化分布被打破，從而引起果實褐變。本實驗中，由于急速降溫組中LOX活力以及相對表達(dá)量在貯藏大部分時期高于緩慢降溫組；因此急速降溫的果心褐變情況比緩慢降溫嚴(yán)重，也印證了上述觀點(diǎn)。因此，對于9月中旬（適時采收）的鴨梨，采用緩慢降溫的方法貯藏，能顯著降低果心褐變指數(shù)，較好地維持貯藏品質(zhì)。

4 結(jié) 論

本實驗采用急速降溫和緩慢降溫方式對采后鴨梨進(jìn)行處理，通過測定果心褐變指數(shù)、果心中脂肪酸含量、3個ω-3FAD基因相對表達(dá)量、LOX活力和LOX基因相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)急速降溫導(dǎo)致鴨梨果心褐變嚴(yán)重，同時為了抵御低溫脅迫，相應(yīng)的UFA含量增加，受冷害影響貯藏期間ω-3FAD表達(dá)量增加，LOX活力升高，導(dǎo)致膜完整性下降，并且低溫激活LOX基因表達(dá)，加速了膜脂過氧化，降低鴨梨貯藏品質(zhì)。因此，對于適時（9月中旬）采收的鴨梨，可以采用緩慢降溫的方法維持鴨梨的品質(zhì)。