孫鳳杰，羅淑芬，顏廷才，胡花麗，周宏勝，張雷剛，李鵬霞,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）為睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬（Nelumbo），是一種重要的水生經(jīng)濟(jì)植物，兼具觀賞、食用、藥用等方面的價(jià)值，在我國分布較廣[1]。鮮食蓮子因其口感甜脆、肉質(zhì)嬌嫩[2]、富含多種微量元素及生物活性成分等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者青睞，市場發(fā)展前景十分廣闊[3-4]。但是，蓮蓬采后呼吸極其旺盛，常溫下放置一段時(shí)間就喪失脆嫩的口感，商品價(jià)值迅速降低，嚴(yán)重制約了鮮食蓮蓬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，蓮蓬采后貯藏保鮮常用的方法主要有低溫貯藏、保鮮劑法和氣調(diào)保鮮等。例如，高建曉等[5]發(fā)現(xiàn)漆蠟涂膜可減輕鮮蓮蓬采后褐變，從而保持鮮蓮蓬較好的貯藏品質(zhì)；王建輝等[6]利用低溫對(duì)湘蓮進(jìn)行貯藏，發(fā)現(xiàn)4 ℃條件可減緩鮮蓮組織水分、蛋白等散失，大幅保留其營養(yǎng)價(jià)值和食用品質(zhì)；此外，朱雁青等[7]采用不同透氣性薄膜包裝蓮蓬，發(fā)現(xiàn)高二氧化碳滲透袋可有效降低鮮蓮蓬的褐變指數(shù)、總酚含量及褐變相關(guān)酶活性。同時(shí)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1-甲基環(huán)丙烯可通過抑制蓮蓬呼吸及乙烯產(chǎn)生來延緩其采后衰老[8]；6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）處理可通過保持淀粉-蔗糖代謝中蔗糖合酶活性和抑制淀粉酶活性來維持蓮子的淀粉和蔗糖含量[9]?？傮w來說，目前有關(guān)蓮蓬采后保鮮的報(bào)道仍較少；因此，探究蓮蓬保鮮新技術(shù)仍有較大的空間。

氯吡苯脲（1-(2-chloropyridin-4-yl)-3-phenylurea，CPPU）又名氯吡脲、KT-30等，是細(xì)胞分裂素類的一種植物生長調(diào)節(jié)劑，在采前具有誘導(dǎo)愈傷組織生長、促進(jìn)芽發(fā)育等作用；在采后，對(duì)控制多種果蔬采后葉片黃化和采后病害等具有顯著作用[10]，例如，CPPU對(duì)延緩菜心葉片[11]、水稻葉片[12]等黃化方面具有顯著效果；張魯斌等[13]發(fā)現(xiàn)外源CPPU處理可有效降低杧果果實(shí)在貯藏期間的病害指數(shù)，推遲其乙烯生成高峰出現(xiàn)，降低其多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）和內(nèi)切葡聚糖酶（β-1,4-endoglucanase，Cx）活性。此外，Huang Hua等[14]用不同濃度CPPU處理西蘭花和香蕉，發(fā)現(xiàn)其不僅能延緩香蕉和西蘭花的成熟和軟化，還能保持色澤，抵御真菌感染，延長保質(zhì)期；也有研究發(fā)現(xiàn)適宜濃度的CPPU處理能較好地維持獼猴桃細(xì)胞壁及膜的完整性，減緩其膜結(jié)構(gòu)的氧化作用[15]。細(xì)胞壁由果膠、纖維素、半纖維素及少量蛋白和木質(zhì)素組成，纖維素是細(xì)胞壁的骨架，它的降解意味著細(xì)胞壁的解體和果實(shí)的軟化；半纖維素以單分子層與纖維素微纖絲間以氫鍵相連，構(gòu)成細(xì)胞壁模型；果實(shí)未成熟時(shí)，大多數(shù)果膠類物質(zhì)以共價(jià)鍵的形式與細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等大分子締合成共價(jià)結(jié)合果膠，維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。一旦果膠結(jié)構(gòu)破壞，共價(jià)結(jié)合果膠會(huì)降解為水溶性果膠和離子結(jié)合果膠，引起果蔬細(xì)胞壁的分解。然而，迄今尚鮮見有關(guān)CPPU處理在蓮子采后細(xì)胞壁多糖降解特性的相關(guān)研究。

本課題組前期研究結(jié)果表明，CPPU處理對(duì)蓮蓬及蓮子的品質(zhì)具有較好的保持效果[16]。本實(shí)驗(yàn)從蓮子多糖含量和其相關(guān)酶活性，以及細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)角度出發(fā)，進(jìn)一步探討CPPU處理對(duì)蓮子采后衰老的影響機(jī)制，旨在為蓮蓬貯藏保鮮及CPPU的實(shí)際應(yīng)用提供理論及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)的蓮蓬品種為‘太空蓮36號(hào)’，于2017年7月25日采摘于江蘇省淮安市金湖縣荷盛蓮業(yè)合作社，采后2 h內(nèi)運(yùn)回江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所果蔬保鮮與加工實(shí)驗(yàn)室。挑選大小均勻、無明顯機(jī)械傷、無病蟲害、成熟度一致的蓮蓬作為實(shí)驗(yàn)材料。

CPPU、咔唑 上海瑞永生物科技有限公司；濃硫酸、甲醇 南京化學(xué)試劑股份有限公司；蒽酮、戊二醛國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙酮、氯仿 成都市科龍化工試劑廠；羧甲基纖維素鈉（化學(xué)純） 北京索萊寶科技有限公司；濾布 德國默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1102紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；A11 Basic型液氮研磨器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；Seven multi pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；CM100透射電子顯微鏡 荷蘭Philips公司；Nicolet iS50型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國Thermo Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，清水浸泡處理對(duì)鮮蓮蓬和蓮子無保鮮效果，且5 mg/L CPPU對(duì)蓮蓬保鮮效果較好[16]。本實(shí)驗(yàn)分別選擇5 mg/L CPPU和清水（CK組）對(duì)蓮蓬浸泡處理10 min（CPPU處理組和CK組各150 個(gè)蓮蓬，每10 個(gè)蓮蓬為1 個(gè)平行），于室溫（23～27 ℃）條件下晾干后置于對(duì)角帶孔（孔徑1 cm）的樂扣箱中，于溫度（25±1）℃條件下貯藏8 d。隔天取樣1 次，取樣方法為：CPPU處理組和CK組分別隨機(jī)從15 個(gè)平行中抽取3 組（共30 個(gè)蓮蓬），測定呼吸強(qiáng)度，拍攝表型照片后，立即去蓮房、蓮皮，然后切除蓮子兩端（約2 mm），去除蓮心，用液氮速凍后于-70 ℃下保存，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)

參考Luo Shufen等[9]的方法，評(píng)分小組由10 個(gè)經(jīng)培訓(xùn)的成員組成，于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所感官評(píng)審室按表1分別從蓮蓬褐變程度（褐變面積）、籽粒脫離蓮房程度、蓮房失水皺縮程度、蓮子褐變程度（褐變蓮子比例）及蓮子質(zhì)地、口感5 個(gè)方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)?？偡?00 分，每項(xiàng)分值20 分，且分4 個(gè)等級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終得分為5 項(xiàng)得分的總和，得分越高表示評(píng)價(jià)越好。

表 1 蓮蓬感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of lotus seeds

1.3.3 蓮子細(xì)胞壁物質(zhì)的提取及FTIR分析

參照茅林春等[17]的方法進(jìn)行蓮子細(xì)胞壁物質(zhì)提取。取蓮子20 g，加180 mL、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液煮沸30 min，用濾布過濾，殘?jiān)?00 mL沸騰乙醇沖洗后用50 mL體積分?jǐn)?shù)90%二甲基亞砜溶液浸提放置過夜。過濾，殘?jiān)来斡?00 mL無水乙醇、200 mL氯仿-甲醇（1∶1，V/V）和200 mL丙酮洗滌，30 ℃烘箱干燥后得到細(xì)胞壁物質(zhì)，經(jīng)80 目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩篩選，保存于干燥器中備用。

使用FTIR儀對(duì)提取好的細(xì)胞壁物質(zhì)進(jìn)行分析，掃描32 次，分辨率4 cm-1，測量范圍4 000～500 cm-1。掃描背景單通道光譜每間隔1 h掃描1 次背景，消除外界信息干擾，保證光譜的穩(wěn)定性以減少實(shí)驗(yàn)誤差。每個(gè)品種收集3 次光譜取平均值，基線校準(zhǔn)，以平均數(shù)作為光譜強(qiáng)度分析。按McCann等[18]的方法進(jìn)行處理得到紅外差譜。

1.3.4 細(xì)胞壁多糖物質(zhì)成分的分離和含量的測定

參照Carvajal等[19]的方法分離細(xì)胞壁物質(zhì)，依次得到水溶性果膠、離子結(jié)合果膠、共價(jià)結(jié)合果膠和半纖維素。水溶性果膠、離子結(jié)合果膠和共價(jià)結(jié)合果膠含量測定采用咔唑比色法。1 mL果膠物質(zhì)提取液加入濃硫酸6 mL，然后沸水浴20 min，取出冷卻至室溫，加入0.2 mL 2 g/L的咔唑溶液，暗處放置30 min，測定反應(yīng)液在530 nm波長處的吸光度，結(jié)果以每克細(xì)胞壁干物質(zhì)中果膠的質(zhì)量表示。半纖維素含量測定采用蒽酮比色法，纖維素含量測定參照李合生[20]的方法。

1.3.5 細(xì)胞壁多糖降解酶活性的測定

外切葡聚糖酶（cellobiohydrolase，C1）和β-葡萄糖苷酶活力的測定參照辜青青等[21]的方法，C1和β-葡萄糖苷酶活力以每克鮮質(zhì)量樣品每分鐘形成還原糖的質(zhì)量表示。Cx活力以每克鮮質(zhì)量樣品每小時(shí)生成1 μmol葡萄糖的量為1 個(gè)酶活力單位，結(jié)果以U/g表示。果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）和PG活力測定參照吳雪瑩等[22]的方法，PME活力以每毫克鮮質(zhì)量樣品每分鐘內(nèi)消耗0.01 mol/L NaOH的體積表示；PG活力以每克鮮質(zhì)量樣品每小時(shí)生成1 μmol半乳糖醛酸的量為1 個(gè)酶活力單位，結(jié)果以U/g表示。

1.3.6 透射電子顯微鏡樣品制備及超微結(jié)構(gòu)觀察

參照Khaliq等[23]的方法并略有改動(dòng)，取蓮子樣品各10 顆，將蓮子去除蓮子殼，用雙面刀片快速切取蓮子0.5～1.0 mm3的小塊，迅速投入已預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛（100 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制，pH 7.2，含體積分?jǐn)?shù)2%多聚甲醛）固定液中并抽真空直至組織塊完全浸入固定液中，固定4 h（4 ℃）后用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）沖洗3 次，每次15 min。之后加入體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸溶液固定2.5 h，再用磷酸鹽緩沖液清洗3 次，每次15 min。接著用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，之后用丙酮樹脂浸透包埋，60 ℃聚合，然后進(jìn)行修塊、超薄切片、染色、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)平行測定3 次，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，顯著性采用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏多重差異性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPPU處理對(duì)鮮蓮蓬和蓮子貯藏過程中感官評(píng)分及表型的影響

貯藏期間，蓮蓬和蓮子表型、口感均發(fā)生不同程度的下降。如圖1、2顯示，蓮蓬在剛采收時(shí)，蓮房呈翠綠色，蓮子飽滿、肉質(zhì)清脆、口感極佳。在采后第2天，CK組和CPPU處理組蓮房表型無明顯變化，蓮子由綠色變?yōu)辄S綠色。在4 d時(shí)，CK組蓮房出現(xiàn)輕微褐變，蓮子出現(xiàn)明顯褐變，口感明顯下降，感官得分下降至57.32 分，而此時(shí)CPPU處理組中蓮房及蓮子仍保持較綠的外觀及鮮嫩的口感，感官得分為80.20 分；到6 d時(shí)，CK組蓮房出現(xiàn)大面積褐變，蓮子口感急劇下降，CPPU處理組蓮房開始出現(xiàn)褐斑，蓮子褐變程度遠(yuǎn)低于CK組，并仍保持較好口感；到第8天時(shí)，CK組中蓮子已出現(xiàn)大面積褐變，蓮子出現(xiàn)明顯松軟現(xiàn)象，并發(fā)生腐爛，失去食用價(jià)值，此時(shí)CPPU處理組中蓮房也出現(xiàn)明顯褐變，蓮子表皮雖褐變明顯，但仍保持較硬的質(zhì)地，具有一定食用價(jià)值。上述結(jié)果表明，CPPU處理可有效保持鮮蓮蓬和蓮子的表型及口感。

圖 1 CPPU處理對(duì)鮮蓮蓬感官評(píng)分的影響Fig. 1 Effect of CPPU treatment on sensory score of fresh lotus pods

圖 2 CPPU處理鮮蓮蓬和蓮子表型的影響Fig. 2 Effect of CPPU treatment on phenotype of fresh lotus pods and seeds

2.2 蓮子細(xì)胞壁物質(zhì)的FTIR分析

蓮子不同貯藏期間的細(xì)胞壁物質(zhì)FTIR光譜如圖3A所示，細(xì)胞壁多糖的紅外吸收峰主要在1 800～700 cm-1區(qū)域內(nèi)[24-26]。1 740、1 630 cm-1處分別為甲酯化果膠酯基伸縮振動(dòng)峰及反對(duì)稱伸縮振動(dòng)特征峰[27]；果膠的其他特征峰還有1 440、1 230 cm-1和1 015 cm-1，其中1 015 cm-1峰吸收強(qiáng)度最強(qiáng)，對(duì)應(yīng)果膠C—C和C—O的伸縮振動(dòng)及骨架振動(dòng)；以1 316、1 057 cm-1和899 cm-1為中心的波段是與纖維素相關(guān)特征基團(tuán)的吸收峰，其中1 057 cm-1為纖維素的C—O和C—C伸縮振動(dòng)峰；以1 147 cm-1和936 cm-1為中心的波段是與半纖維素相關(guān)的吸收峰，936 cm-1為半纖維素的環(huán)形振動(dòng)。此外，某種物質(zhì)的某些波段可能是重疊的，并受相鄰位置波段的影響，而900～1 200 cm-1的區(qū)域，其特征是出現(xiàn)多種不同多糖吸收峰[28]。

蓮子細(xì)胞壁物質(zhì)相對(duì)含量最高的為果膠，其次是纖維素。從圖3A～E中可以看出，CPPU處理組的蓮子細(xì)胞壁物質(zhì)在1 100～1 060 cm-1波長區(qū)間的吸收峰面積明顯高于CK組，此結(jié)果初步說明，CPPU處理組蓮子中果膠（1 015 cm-1）含量較CK組中高，纖維素多糖碳鏈結(jié)構(gòu)（1 057 cm-1）較CK組完整，這種差異在貯藏第4天最為明顯。半纖維素（936 cm-1）特征峰面積在紅外譜圖上差異不明顯，初步說明CPPU處理組與CK組之間蓮子細(xì)胞壁半纖維含量無明顯差異。

圖 3 不同貯藏時(shí)間蓮子細(xì)胞壁物質(zhì)的FTIR光譜圖與差譜圖Fig. 3 FTIR spectra and differential spectra of CWM extracted from lotus seeds at different storage times

2.3 CPPU處理對(duì)貯藏過程中蓮子細(xì)胞壁果膠含量的影響

圖 4 CPPU處理對(duì)蓮子水溶性果膠（A）、離子結(jié)合果膠（B）和共價(jià)結(jié)合果膠（C）含量的影響Fig. 4 Effect of CPPU treatment on the contents of water-soluble pectin (A), ion-bound pectin (B) and covalently bound pectin (C) in lotus seeds

果實(shí)中的果膠類型主要分為水溶性果膠、離子結(jié)合果膠和共價(jià)結(jié)合果膠，它們的含量變化可以間接反映果實(shí)的成熟度。從圖4A可以看出，蓮子的水溶性果膠含量在貯藏過程中呈上升趨勢，蓮子水溶性果膠含量前期（0～6 d）上升較快，特別是CK組，采后第2天水溶性果膠含量上升至0 d的1.85 倍，而CPPU處理組水溶性果膠僅較0 d高0.07 倍，且在整個(gè)貯藏期間CK組的水溶性果膠含量始終顯著高于CPPU處理組（P＜0.05）。

如圖4B所示，蓮子的離子結(jié)合果膠含量在貯藏過程中也呈上升趨勢。CK組與CPPU處理組的離子結(jié)合果膠含量在0～2 d差異不顯著，但CK組在4～8 d顯著高于CPPU處理組（P＜0.05），特別是第6天，CK組的離子結(jié)合果膠含量比CPPU處理組高27.78%。

如圖4C所示，共價(jià)結(jié)合果膠含量則是隨著貯藏時(shí)間延長逐漸下降，與CK處理組相比，CPPU處理推遲了共價(jià)結(jié)合果膠含量的下降，例如在第4天，CK組和CPPU處理組分別較第2天分別下降了25.83%、2.68%。整個(gè)貯藏期間，CPPU處理組的共價(jià)結(jié)合果膠含量始終高于CK組，且在第4、6天差異顯著（P＜0.05）。由此可見，CPPU處理可較好地抑制蓮子共價(jià)結(jié)合果膠含量降解，及水溶性果膠、離子結(jié)合型果膠積累。

2.4 CPPU處理對(duì)細(xì)胞壁果膠降解酶活力的影響

圖 5 CPPU處理對(duì)蓮子PME（A）和PG（B）活力的影響Fig. 5 Effect of CPPU treatment on the activity of PME (A) and PG (B)in lotus seeds

細(xì)胞壁中果膠的降解是多種酶作用的結(jié)果，但一般認(rèn)為PME、PG是導(dǎo)致果膠降解的關(guān)鍵酶。由圖5A可以看出，PME活力在貯藏期間先上升后下降，且在0～2 d上升幅度較大。CPPU處理組的PME活力始終低于CK組，并在第6～8天達(dá)到顯著差異（P＜0.05）。由圖5B可以看出，在貯藏期間，蓮子PG活力在0～2 d下降較快，2～6 d變化較小，且CK組與CPPU處理組無明顯差異。到第6～8天，CPPU處理組仍保持平緩的變化，而CK組的PG活力迅速上升，到第8天，CK組的PG活力是CPPU處理組的1.71 倍，達(dá)到顯著水平（P＜0.05）?？梢钥闯?，CPPU處理可有效抑制PME活力，而對(duì)PG活力的抑制作用主要體現(xiàn)在貯藏后期。

2.5 CPPU處理對(duì)蓮子纖維素和半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

纖維素和半纖維素是維持細(xì)胞壁形態(tài)的關(guān)鍵成分，由圖6A可知，蓮子纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在貯藏前期明顯上升，4 d后開始下降，CK組下降較快，4～8 d期間下降了10.92%，而CPPU處理組僅下降5.60%；在整個(gè)貯藏期間，CPPU處理組的纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終顯著高于CK組（P＜0.05）。由圖6B可知，CPPU處理組和CK組的半纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～2 d都迅速下降，之后含量呈小幅波動(dòng)變化，但整體呈下降趨勢，且在整個(gè)貯藏期間CPPU處理組的半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于CK組，并在4～8 d差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，CPPU處理可更好地維持蓮子的纖維素和半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖 6 CPPU處理對(duì)蓮子纖維素（A）和半纖維素（B）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig. 6 Effect of CPPU treatment on the contents of cellulose (A) and hemicellulose (B) in lotus seeds

2.6 CPPU處理對(duì)細(xì)胞壁纖維素降解酶活力的影響

C1、β-葡萄糖苷酶和Cx共同構(gòu)成細(xì)胞壁降解的酶系。由圖7A可以看出，CK組與CPPU處理組C1活力變化趨勢一致，均在0～2 d急劇下降后，在2～8 d呈上升趨勢，在第8天，CK組的C1活力顯著高于CPPU處理組（P＜0.05）。

由圖7B可知，β-葡萄糖苷酶活力在貯藏期間整體呈現(xiàn)下降趨勢，前期（0～4 d）下降速率較快；后期CK組的β-葡萄糖苷酶活力呈波動(dòng)變化，而CPPU處理組變化幅度不明顯。在第4天時(shí)，CK組的β-葡萄糖苷酶活力比CPPU處理組高出55.92%（P＜0.05）。

圖7C顯示，采后0～2 d，蓮子Cx活力下降很快，2 d后緩慢上升，但CK組上升速度大于CPPU處理組，第6～8天顯著高于CPPU處理組（P＜0.05），第8天時(shí)，CK組的Cx活力比CPPU處理組高出56.04%。上述結(jié)果表明，CPPU處理可抑制細(xì)胞壁纖維素降解酶活力。

圖 7 CPPU處理對(duì)蓮子C1（A）、β-葡萄糖苷酶（B）和Cx（C）活力的影響Fig. 7 Effect of CPPU treatment on the activity of C1 (A),β-glucosidase (B) and Cx (C) in lotus seeds

2.7 CPPU處理對(duì)蓮子細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)及纖維素微絲結(jié)構(gòu)的影響

如圖8所示，蓮子細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)在貯藏過程中發(fā)生了明顯的變化，貯藏初期（0 d），細(xì)胞壁較厚、輪廓清新，細(xì)胞膜光滑，尚未發(fā)生質(zhì)壁分離且結(jié)構(gòu)致密，中膠層電子密度較高。至貯藏第4天時(shí)，CK組蓮子的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)輕微質(zhì)壁分離，中膠層發(fā)生降解；此時(shí)CPPU處理組的蓮子細(xì)胞壁狀態(tài)與0 d時(shí)無明顯差別。到第6天時(shí)，CPPU處理組的蓮子開始出現(xiàn)質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，中膠層仍結(jié)構(gòu)緊密，瓦解的現(xiàn)象不明顯；而此時(shí)，CK組蓮子細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯質(zhì)壁分離，中膠層松散，發(fā)生瓦解。貯藏末期（8 d），CK組蓮子細(xì)胞壁質(zhì)壁分離嚴(yán)重，中膠層進(jìn)一步瓦解；相比而言，此時(shí)CPPU處理組的蓮子細(xì)胞壁質(zhì)壁分離尚不明顯，中膠層降解程度明顯低于CK組，仍保持了較完整的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。

植物細(xì)胞壁的纖維素主要以小微纖絲的形式存在，通過對(duì)蓮子細(xì)胞壁纖維素微纖絲的觀察（圖9）可以看出，0 d的蓮子細(xì)胞壁纖維素微纖絲排列緊密、形態(tài)清晰、粗糙不透明。CK組蓮子細(xì)胞壁纖維素微纖絲在4 d后出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)松散、軟化和排列不規(guī)則現(xiàn)象，且隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸惡化；而CPPU處理組的蓮子細(xì)胞壁在第8天時(shí)纖維素微纖絲仍保持排列緊密、粗糙不透明的形貌。由此可知，CPPU處理可有效保持蓮子細(xì)胞壁纖維素微纖絲的形態(tài)和排列緊密、規(guī)則的狀態(tài)。

圖 8 CPPU處理對(duì)蓮子細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)的影響（×2 000～3 000）Fig. 8 Effect of CPPU on cell wall ultrastructure of lotus seeds (× 2 000-3 000)

圖 9 CPPU處理對(duì)蓮子纖維素微纖絲結(jié)構(gòu)的影響（×11 000～13 000）Fig. 9 Effect of CPPU on the ultrastructure of cellulose microfibrils in lotus seeds (× 11 000-13 000)

3 討 論

CPPU屬于苯基脲型細(xì)胞分裂素類的植物生長調(diào)節(jié)劑，其也可用于調(diào)控果蔬采后衰老，如Huang Hua等[14]的研究結(jié)果表明，CPPU可以延緩香蕉和西蘭花的衰老，推遲其表面顏色變化，抑制呼吸速率和褐變，減少質(zhì)量損失，并推測CPPU對(duì)質(zhì)量損失的控制與其增加角質(zhì)層含量、維持細(xì)胞膜完整性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CPPU處理亦可有效保持蓮蓬及蓮子的表型及脆嫩的口感，延長其常溫保質(zhì)期。

果膠是果實(shí)細(xì)胞壁中膠層的主要組分，而纖維素是細(xì)胞壁的骨架，植物衰老過程中，細(xì)胞壁中纖維素、半纖維和果膠等多糖降解會(huì)直接影響細(xì)胞的完整性，從而使細(xì)胞中VC、酚類物質(zhì)等滲出，與空氣接觸發(fā)生氧化，進(jìn)而影響果蔬品質(zhì)及口感，加速衰老[29]。本實(shí)驗(yàn)采用FTIR對(duì)蓮子細(xì)胞壁物質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)CPPU處理對(duì)蓮子細(xì)胞壁果膠、纖維素類和半纖維素相關(guān)官能團(tuán)有較好的保持作用，尤其是保持了多糖C—C鏈骨架的完整性。在細(xì)胞壁降解過程中起關(guān)鍵作用的酶包括由PME和PG組成的果膠降解酶，以及由Cx、C1和β-葡萄糖苷酶等組成的纖維素降解酶系[30-31]。其中，PME使果膠去甲酯化，是PG活動(dòng)的必要前提，PG水解果膠分子多聚半乳糖醛酸鏈，使細(xì)胞壁解體。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CPPU處理對(duì)這兩類酶的活力均有不同程度的抑制作用，從而維持蓮子更高的纖維素、半纖維素和共價(jià)結(jié)合果膠的含量，延緩水溶性和離子結(jié)合果膠的累積。類似的研究也發(fā)現(xiàn)，外源CPPU處理能夠有效延緩采后杧果PG和Cx活力升高，從而有利于保持果實(shí)的風(fēng)味[13]。

與此結(jié)果相印證，蓮子細(xì)胞壁及纖維素微纖絲的觀察結(jié)果顯示，CPPU處理可保持蓮子纖維素微纖絲排列緊密、規(guī)則，延緩松弛變軟現(xiàn)象出現(xiàn)，從而維持蓮子完整的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保持蓮子新鮮、脆嫩的口感。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，6-BA[32]、CPPU[16]等細(xì)胞分裂素可提高蓮子自由基清除能力，降低其采后膜脂過氧化程度。而劉瑩等[33]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜脂過氧化會(huì)引起細(xì)胞壁降解酶活力的升高，導(dǎo)致細(xì)胞壁降解。由此推測，CPPU處理抑制蓮子細(xì)胞壁降解，延緩蓮子衰老，可能與其作為細(xì)胞分裂素可提高蓮子自由基清除能力，保護(hù)膜完整性有關(guān)，該結(jié)論與文獻(xiàn)[34-35]所得結(jié)論相似。

綜上所述，CPPU處理可通過抑制PEM和PG等果膠水解酶和Cx、C1和β-葡萄糖苷酶等纖維素水解酶活力，以延緩蓮子細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合果膠和纖維素、半纖維素等多糖的降解，從而維持蓮子細(xì)胞壁完整的結(jié)構(gòu)，使蓮子保持新鮮、脆嫩的口感，進(jìn)而達(dá)到延緩蓮蓬及蓮子衰老的目的。