張紊瑋，王艷玲，薛華麗，畢 陽,*

（1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅農業(yè)大學理學院，甘肅 蘭州 730070）

單端孢霉烯族毒素是由鐮刀菌屬（Fusarium）、單端孢霉屬（Trichthecium）、漆斑霉屬（Myrothecium）、葡萄穗霉屬（Stachybotrys）等絲狀真菌產生的有毒的次級代謝產物[1]，其不僅廣泛存在于小麥、大麥、玉米等禾谷類作物籽粒中[2-6]，也存在于蘋果、梨、馬鈴薯、葡萄等果蔬[7-8]以及肉、蛋、奶等畜產品中[3,9-10]。單端孢霉烯族毒素種類繁多，目前已超過200 種[11]，典型的共同特征是具有C9,10-雙鍵和C12,13-環(huán)氧化的倍半萜烯骨架結構。根據化學結構的不同，單端孢霉烯族毒素可分為A型、B型、C型、D型4 類（圖1、表1），A型在C8位上有羥基（—OH）或酯基（—COOR）相連，主要包括T-2毒素（T-2 toxin，T-2）、HT-2毒素（HT-2 toxin，HT-2）、二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇（diacetoxyscirpenol，DAS）、新茄病鐮刀菌烯醇（neosolaniol，NEO）等；B型在C8位上連接羰基（—C＝O），主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-acetyldeoxynivalenol，15-ADON）等；C型在C7、C8位上環(huán)氧化，如扁蟲菌素；D型在C4、C15位上連接一個大環(huán)，如疣皰菌素A、桿孢菌素E等。

圖 1 單端孢霉烯族毒素的基本結構[1]Fig. 1 Chemical structures of trichothecenes[1]

表 1 A型和B型單端孢霉烯毒素取代基的區(qū)別Table 1 Comparison of substituent groups in type A and type B trichothecenes

鐮刀菌產生的單端孢霉烯族毒素主要由A型和B型組成。A型以T-2為代表，其是目前污染最廣、毒性最強的真菌毒素之一；B型以DON及乙?；腄ON為代表，是存在最為廣泛的真菌毒素[12]。單端孢霉烯族毒素能夠抑制真核細胞蛋白質、DNA和RNA的合成，破壞細胞分裂、線粒體和膜功能，對造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有很強的毒性，具有致畸、致癌、致突變作用[13-16]。鑒于鐮刀菌單端孢霉烯族毒素污染的普遍性，以及其對人類健康和糧食安全形成的巨大威脅，真菌毒素的控制顯得尤為重要。從基因水平研究毒素的代謝及調控，掌握真菌毒素的生物合成途徑，可為毒素防控、毒素脫除技術的發(fā)展提供理論支撐。因此，本文對鐮刀菌單端孢霉烯族毒素的生物合成途徑、功能基因及相關代謝調控的機理進行了綜述，并結合自身相關研究基礎提出了展望，以期為更好地理解和深入探究鐮刀菌單端孢霉烯族毒素產毒機理和調控機制提供理論依據。

1 單端孢霉烯族毒素生物合成的相關基因

近年來，禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）全基因組序列的公布為基因水平研究鐮刀菌真菌毒素的代謝提供了便利[17]。隨著單端孢霉烯族毒素合成基因和基因簇不斷被發(fā)掘和研究，單端孢霉烯族毒素的生物合成途徑已經較為清楚[17-20]。單端孢霉烯族毒素合成過程中至少有15 個基因參與毒素合成[11]，在擬枝孢鐮刀菌（Fusarium sporotrichioides）和F. graminearum中發(fā)現(xiàn)12 個Tri相關基因（Tri5、Tri4、Tri6、Tri3、Tri11、Tri12、Tri7、Tri10、Tri13、Tri8、Tri9和Tri14）組成Tri5基因簇[18]，排列在一個長25 kb的DNA片段上，具有相似的結構和高度的保守性（圖2）。目前已經發(fā)現(xiàn)與單端孢霉烯族毒素合成相關的基因中有3 個基因家族：Tri5基因簇、Tri1～Tri16基因簇和Tri101基因簇，這3 個基因簇不僅位于不同的位置，而且在不同的染色體上[11,18]。參與單族毒素合成的絕大部分基因的序列及功能已經清楚（表2），包括編碼單端孢霉二烯合酶的Tri5、編碼P450單加氧酶的Tri4、Tri11和Tri13、編碼轉錄調控因子的Tri6和Tri10、編碼乙?；D移酶的Tri7、Tri3、Tri16和Tri101、編碼酯酶的Tri8、編碼羥化酶的Tri1、編碼毒素輸出泵的Tri12。另外，Tri9編碼一個由43 個氨基酸組成的蛋白，與現(xiàn)有的任何蛋白都沒有同源性，到目前為止功能未知[20]；Tri14對于毒素的合成不是必須的，且功能未知，但是在侵染小麥時與高致病性及毒素合成相關，表明Tri14在特定條件下影響單端孢霉烯族毒素的合成[21]。

表 2 單端孢霉烯族Tri5基因簇、Tri1～Tri16基因簇、Tri101基因簇基因及其功能[18]Table 2 Functions of Tri genes in Tri5, Tri1-16 and Tri101 gene clusters[18]

在產不同毒素類型的鐮刀菌中，個別Tri基因也有一些差異[11]。Tri1在產T-2的F. sporotrichioides和產DON、NIV毒素的F. graminearum中只有59%的同源性，共同編碼羥化酶，但是具有不同的功能。F. graminearum TRI1催化C7和C8位羥基化，F(xiàn). sporotrichioides TRI1只催化C8位羥基化。Tri16最初發(fā)現(xiàn)在F. sporotrichioides Tri1～Tri16基因簇內位于Tri1基因的下游，編碼一種乙?；D移酶，催化C8位形成酯基，是合成T-2、HT-2等A型毒素特有的Tri基因。在F. graminearum中，Tri16假基因與Tri1毗鄰，位于Tri1上游，且不具有功能活性。在T-2、NIV毒素產生菌中，Tri13編碼細胞色素P450單加氧酶，催化C4位羥基化，Tri7編碼乙?；D移酶，催化C4位乙?；?；在DON產生菌中，Tri13、Tri7不具有功能活性；在產NIV的DON產生菌中，Tri13、Tri7具有功能活性，催化底物C4位羥基乙?；瘡亩M入NIV合成途徑。這表明F. graminearum中Tri13、Tri7基因可能是導致不同類型菌株產生不同類型毒素的關鍵，Tri13、Tri7基因被用于區(qū)分DON和NIV毒素化學型及不同的鐮刀菌。另外，在F. graminearum中構建Tri7缺失突變體，結果積累了HT-2而沒有合成T-2，表明Tri7基因與C4位上加氧乙?；嚓P，Tri7基因可能是導致A型毒素菌株產生不同毒素的一個關鍵基因。

圖 2 產不同毒素的鐮刀菌單端孢霉烯族毒素合成基因簇的比較[18]Fig. 2 Comparison of trichothecene gene clusters in different chemotype strains of Fusarium[18]

2 單端孢霉烯族毒素生物合成途徑及相關酶

單端孢霉烯族毒素的生物合成起始于tFPP環(huán)化形成單端孢霉二烯，再經過一系列的加氧、異構化、環(huán)化和酯化反應最終形成不同結構的單端孢霉烯族毒素（圖3）。不同種的鐮刀菌具有相同的單端孢霉烯族毒素合成途徑[17-18]。單端孢霉烯具有法尼基焦磷酸合成的骨架，法尼基焦磷酸是一種普遍的中間代謝產物，是固醇、輔酶Q、多萜醇等眾多重要化合物的中間代謝物[22]，由異戊二烯焦磷酸縮合而成。Tir5基因編碼的單端孢霉二烯合酶催化tFPP環(huán)化形成單端孢霉二烯，其是開始合成單族毒素的第1個前體物質，該反應為單端孢霉烯族毒素合成途徑的第1個限速步驟[23-24]。

圖 3 鐮刀菌單端孢霉烯族毒素生物合成途徑[1]Fig. 3 Proposed trichothecene biosynthetic pathway in Fusarium[1]

緊接著單端孢霉二烯在Tri4基因編碼的多功能P450單加氧酶催化下經由4 步加氧反應合成異單端孢霉烯三醇，其中首先在單端孢霉二烯的C2位上加羥基，接著在C12和C13位上環(huán)氧化、C11位上羥基化，最后在C3位上羥基化[25]。隨后發(fā)生兩步非酶促反應：第1步，通過異構化反應，異單端孢霉烯三醇C9位羥基取代了C11位羥基，形成單端孢霉烯三醇；第2步，單端孢霉烯三醇C2位氧原子與C11位之間環(huán)化成一個吡喃環(huán)生成異單端孢霉菌醇，成為第1個具有三環(huán)核心結構和C12,13-環(huán)氧化結構的單端孢霉烯族化合物的骨架結構[11]。

異單端孢霉菌醇在Tri101基因編碼的乙酰基轉移酶作用下C3位羥基乙?；?，生成異單端孢霉素，C3位的乙酰化對下步反應是必須的[26-27]。異單端孢霉素在Tri11基因編碼的P450單加氧酶催化下C15位羥基化生成15-脫乙酰麗赤殼菌素[28]，異單端孢霉素C15位羥基化之后，在Tri3基因編碼的乙?；D移酶催化下C15位羥基乙酰化生成麗赤殼菌素[29]。麗赤殼菌素經過不同的生物合成途徑可分別生成T-2、NIV和DON等單端孢霉烯族毒素，最終由Tri12基因編碼的毒素輸出泵運出菌體外[30-31]。

在產T-2和NIV毒素的鐮刀菌中，麗赤殼菌素經過Tri13基因編碼的細胞色素P450單加氧酶的催化，C4位羥基化形成3,15-二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇，接著在Tri7基因編碼的乙?；D移酶催化下C4位羥基乙?；纬?,4,15-三乙酰鑣草鐮刀菌烯醇[32]。接下來，3,4,15-三乙酰鑣草鐮刀菌烯醇在產T-2的F. sporotrichioide中和產NIV毒素的F. graminearum中分別通過不同的代謝途徑生成T-2或NIV[33]。在F. graminearum中Tri1基因編碼的細胞色素P450單加氧酶催化C7和C8位羥基化[34]，接著C8位羰基化形成3,4,15-三乙?；鵑IV，在Tri8基因編碼的酯酶催化下C3位脫乙?；又鳦15和C4位分別脫乙?；鵞35]，最終形成NIV毒素；而在F. sporotrichioide中Tri1基因編碼細胞色素P450單加氧酶只催化C8位羥基化[36]，接著在Tri16基因編碼的乙?；D移酶催化下C8位形成含有異戊酸單體結構的酯基[37]，最后通過Tri8基因編碼的酯酶催化C3位脫乙酰基從而形成T-2[35]。

在產DON的F. graminearum中，Tri13基因失活，從而不能將C4位羥基化，麗赤殼菌素在Tri1基因編碼的細胞色素P450單加氧酶作用下催化C7和C8位羥基化[34]，形成7,8-二羥基麗赤殼菌素。接著C8位羰基化，生成3,15-ADON，在Tri8基因編碼的酯酶催化下C3位脫乙?；纬?5-ADON[35]。3,15-ADON在C15位脫乙?；?-ADON，兩者分別在C15位和C3位脫去乙?；罱K生成DON。在產NIV毒素的F. graminearum中，3,15-ADON還可以在Tri13基因編碼的細胞色素P450單加氧酶的催化下C4位羥基化，接著在Tri7基因編碼的乙?；D移酶催化下C4位羥基乙酰化形成3,4,15-三乙?；鵑IV，進入NIV合成途徑[33]。由此看來，單端孢霉烯族毒素的生物合成途徑是一系列Tri基因編碼酶催化的氧化、酯化反應，在這個過程中需要轉運蛋白的參與并需要一系列相關基因的表達，一起構成一種網式互作，個別Tri基因的差異是導致合成不同類型毒素的關鍵。

3 單端孢霉烯族毒素合成的分子調控

盡管單端孢霉烯族毒素的生物合成途徑已經基本清楚，但是代謝途徑中涉及到相關Tri基因的分子調控，相比而言了解較少。在Tri5基因簇中，Tri6、Tri10被證實編碼兩種不同結構的轉錄因子，正向調控單族毒素生物合成的相關基因[38]。在F. sporotrichioide中將Tri10敲除，T-2合成受阻，同時顯著降低包括Tri6基因在內的其他Tri基因的表達量。在F. graminearum中構建Tri6和Tri10缺失突變株侵染麥穗能顯著降低致病性。從轉錄水平對RNA進行分析，發(fā)現(xiàn)包括Tri基因在內的超過200 個基因表達量發(fā)生了變化，其中一半基因在啟動子區(qū)具有TRI6調控因子的結合序列。這就表明Tri6是一個綜合的調節(jié)因子，不僅調控單端孢霉烯族毒素合成相關Tri基因的表達，還調控這些涉及毒素合成上游異戊二烯途徑相關基因及其他基因的表達[39]。在F. graminearum中，Tri10調控Tri6的表達，Tri6還反向調控Tri10的表達。將Tri10敲除后對Tri6的表達沒有明顯的影響。此外，Tri14被認為是Tri基因的調控因子，在F. sporotrichioides和F. graminearum中將Tri14敲除，體外實驗表明對毒素的合成沒有影響，而侵染小麥的體內實驗卻降低了F. graminearum的致病性，并且使其失去了產生毒素的能力[21]。Tri15基因被認為是與毒素合成相關的第4個基因簇，編碼鋅指結構轉錄因子，在F.sporotrichioides中負向調控其他Tri基因的表達。然而，在F. graminearum中將Tri15敲除對毒素的合成和致病性都沒有影響[40]。由此看出，單端孢霉烯族毒素生物合成途徑中的Tri基因受到轉錄因子的調控，其在不同種的鐮刀菌中以及不同環(huán)境條件下，對毒素合成的調控及致病性的影響都是不同的（圖4）。

在鐮刀菌單端孢霉烯族毒素生物合成途徑中，由tFPP經過Tri5基因編碼的單端孢二烯合酶催化生成單端孢霉二烯，然后依次在Tri4、Tri101、Tri11和Tri3基因編碼的P450單加氧酶、乙?；D移酶、羥化酶和乙?；D移酶的催化下最終生成麗赤殼菌素，這10 步反應是A型和B型毒素產生菌中共有的代謝途徑[11]。在F. sporotrichioides中和產NIV毒素的F. graminearum中，Tri13和Tri7基因具有功能活性，麗赤殼菌素在Tri13基因編碼的細胞色素P450單加氧酶、Tri7基因編碼的乙酰基轉移酶的作用下C4位加氧羥基化、乙?；?,4,15-三乙酰鑣草鐮刀菌烯醇。在T-2產生菌中，3,4,15-三乙酰鑣草鐮刀菌烯醇經過F.s Tri1、F.s Tri16、F.s Tri8編碼的羥化酶、乙?；D移酶、酯酶的催化下生成T-2[33]。F.s Tri16是生成T-2、HT-2鐮刀菌所特有的編碼乙?；D移酶的基因，能催化C8位形成含有異戊酸單體結構的酯基。在產NIV毒素的F. graminearum中，3,4,15-三乙酰鑣草鐮刀菌烯醇經過F.g Tri1、F.g Tri8編碼酶的催化生成4-乙酰NIV，最終生成NIV。在DON產生菌中，Tri13和Tri7基因沒有功能活性，所以C4位上沒有加氧。麗赤殼菌素在F.g Tri1、F.g Tri8基因編碼酶的催化下生成3-ADON或15-ADON，最終形成DON[33]。合成3-ADON或15-ADON是由菌株特異性導致的，取決于編碼酯酶Tri8基因的序列[41]。不同類型的單端孢霉烯族毒素生物合成的基因簇比較表明，參與毒素合成的基因大多數是相同的，但也有個別差異。參與的代謝途徑不同以及基因的差異是導致形成不同毒素的根本原因。

圖 4 單端孢霉烯族毒素生物合成的分子調控機制Fig. 4 overview of molecular regulation mechanism involved in the transcription of trichothecenes biosynthetic genes

單端孢霉烯族毒素的生物合成除了受特異的轉錄調控因子調控之外，還受到與外界環(huán)境因素密切相關的全局性調控因子的調控。pH值是一個影響單端孢霉烯族毒素合成的重要環(huán)境因素。F. graminearum在pH值低緩沖合成培養(yǎng)基中生長會導致環(huán)境pH值降低，Tri基因的表達和毒素的合成與pH值呈正相關；而在中性乃至堿性條件下抑制毒素的合成和Tri基因的表達[42]。在Aspergillus nidulans中發(fā)現(xiàn)pH值調控系統(tǒng)，在堿性條件下6 個pal基因編碼產物激活鋅指結構調控因子PacC，PacC進入細胞核與具有“GCCARG”特異識別序列的啟動子結合從而指導基因的轉錄[43]。在F. verticillioides中也發(fā)現(xiàn)Pac1調控伏馬菌素的合成[44]。在F. graminearum中發(fā)現(xiàn)Pac1直接參與了由pH值介導調控單端孢霉烯族毒素的合成，表明在酸性條件下表達組成型有活性的Pac1因子顯著抑制了Tri基因的表達并降低了毒素的積累；缺失Pac1突變株與野生型菌株相比，在酸性條件下早期誘導了Tri基因的表達和毒素的合成[42]。在包括Tri6及其他Tri基因的啟動子區(qū)中發(fā)現(xiàn)具有PacC結合序列“GCCARG”，從而表明PacC直接調控Tri6的表達，進而間接調控其他Tri基因的表達或同樣直接調控Tri基因的表達來影響毒素的積累[42]。光照也是一種重要的影響真菌生長的刺激信號。真菌感受光刺激會做出反應，調整代謝通路來適應環(huán)境的變化。除了光調控受體蛋白WC-1和WC-2之外[45]，在A. nidulans中發(fā)現(xiàn)velvet基因編碼的VeA也是一種重要的光調控蛋白。大量研究表明VeA參與了絲狀真菌代謝相關基因的表達和次級代謝產物的合成[46-47]。A. nidulans中，柄曲霉素生物合成基因簇由轉錄激活因子aflR基因激活調控，VeA可通過影響aflR的轉錄表達調控柄曲霉素的合成[48]；在F. verticillioides中，F(xiàn).v VE1調控伏馬菌素的生物合成[49]；在F. fujikuroi中，F(xiàn).f Vel1和F.f Lae1調控伏馬菌素和鐮刀菌素C的合成[50]；在F. graminearum中，F(xiàn).g VeA通過調控Tri6的表達來正向調控DON的生物合成和影響致病性[51]。絲狀真菌的次級代謝途徑非常復雜，許多調節(jié)次級代謝的調控因子大多已被鑒定，但是具體的調節(jié)機制還有待進一步研究。

4 結 語

鐮刀菌產生的單端孢霉烯族毒素既是自身生長過程中分泌的一種次級代謝產物，同時也可以被認為是鐮刀菌因外界環(huán)境改變而產生的一種適應反應，可見鐮刀菌真菌毒素受到一系列復雜的鐮刀菌與寄主、鐮刀菌與環(huán)境等互作過程的綜合調控[52-54]。目前，對真菌毒素的發(fā)生、檢測、毒性等研究多有報道[55-62]，而對毒素生物合成及調控機理方面報道并不多[63-64]，所以更應該深入研究真菌毒素的生物合成及其遺傳信息、分子機制，以推動農業(yè)和食品行業(yè)中真菌毒素的防控與去除。本文針對目前食品中最常見的鐮刀菌單端孢霉烯族毒素的生物合成及其分子調控進行了綜述，分別闡釋了單端孢霉烯族毒素合成的相關基因、合成途徑及相關酶和分子調控機理。鐮刀菌單端孢霉烯族毒素的生物合成途徑是一系列Tri基因編碼酶催化的氧化、酯化反應，在這個過程中需要轉錄調控因子的參與并需要一系列Tri基因的表達，一起構成一種網式互作。由鐮刀菌單端孢霉烯族毒素生物合成途徑可以看出，毒素形成的差異主要是由代謝途徑和基因差異決定的，如果能夠調控合成途徑中的關鍵基因的表達，則可以起到調控毒素積累的作用。

植物體內能夠合成多種多酚類物質來抵抗病原真菌的侵入，這些物質也能抑制真菌的生長和毒素的積累：例如木脂素松脂醇、開環(huán)異落葉松脂素可抑制F. graminearum的生長和毒素的積累[65]；黃酮和呋喃香豆素在抑制F. graminearum毒素合成的同時還抑制單端孢霉烯族毒素合成中Tri4基因編碼酶的活性[66]；阿魏酸可有效抑制B型單端孢霉烯族毒素的積累和Tri基因的表達[67-68]；肉桂酸類、苯乙酮類、苯甲酸類、苯丙素類、羥基聯(lián)苯類等對F. culmorum產B型毒素有抑制作用[69]。Atanasova-Pénichon等報道了綠原酸在對抵抗玉米粒中F. graminearum的侵染和DON的積累中起到積極作用[70]；本課題組的研究發(fā)現(xiàn)1.25 mmol/L綠原酸對F. sulphureum具有抑制效果，可引起細胞膜通透性增大，細胞內的電解質、核酸和蛋白質滲漏到胞外，并且發(fā)現(xiàn)引起F. sulphureum Tri5、Tri4、Tri6、Tri10、Tri12基因表達量的下調，與Ferruz等[71-72]報道的綠原酸在低濃度（0.5 mmol/L）時對F. sporotrichioides生物量沒有抑制作用，但降低了毒素的積累，下調了Tri5、Tri6、Tri12基因的表達量，在高濃度（2.5～10.0 mmol/L）時可完全抑制菌體的生長的結論一致。Martínez等[73]報道了2.5～10.0 μg/μL綠原酸對于F. solani等多種植物病原真菌具有抑制作用，可抑制孢子萌發(fā)和菌絲體的生長，破壞細胞膜，造成細胞裂解，與本課題組研究結果一致。

農產品中積累的真菌毒素對人畜的健康造成較大威脅，所以，開展防控農產品中真菌毒素污染的研究顯得尤為重要和迫切?；瘜W殺菌劑雖然可有效控制鐮刀菌引起的危害，但其殘留不僅會危害人類健康，還會導致鐮刀菌產生抗藥性和環(huán)境污染。因此，尋找安全、高效、環(huán)保的真菌毒素抑制劑便成為當前食品安全控制中亟待解決的問題。植物體內的天然化合物是生物可降解并且可再生的，對于植物病害的防控具有很好的應用前景。目前，降低單端孢霉烯族毒素積累的研究主要集中在篩選高效、天然、無毒的多酚類物質，以及對一些相關Tri基因或是關鍵酶進行單獨研究[65-72]，缺乏整體、系統(tǒng)的探索。對于這些物質調控單端孢霉烯族毒素產生的分子機制目前尚不清楚。鑒于目前尚鮮有理想的防控農產品鐮刀菌單端孢霉烯族毒素污染的措施，而來自植物體內的天然化合物又表現(xiàn)出抑制鐮刀菌及真菌毒素的巨大潛力，我們應該進一步加強對鐮刀菌真菌毒素產生的途徑和調控機理的系統(tǒng)研究，建立植物體內天然化合物調控單端孢霉烯族毒素的代謝網絡，以代謝網絡中的上游基因和關鍵基因作為毒素控制的靶標，遏制病原菌真菌毒素的代謝，降低農產品、食品受真菌毒素污染的風險，確保人類飲食健康安全。