劉 維，虎虓真，朱 莉，甘建紅,2，盧 瑛,2，陶寧萍,2，王錫昌,2，許長華,2,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），國家淡水水產品加工技術研發(fā)分中心（上海），上海 201306）

靈芝屬（Ganoderma）真菌屬于擔子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、靈芝科（Ganodermataceae）。2015年版《中國藥典》將能用作中藥材的靈芝規(guī)定為真菌赤芝（G. lucidum Karst，GLK）和紫芝（G. japonicrn L.loyd）干燥子實體的總稱。靈芝在我國常作為中藥材使用，首載于最早的藥物學專著《神農本草經(jīng)》，并被歸為上品。已知的靈芝品種約108 種[1]，最常見的為GLK，其次為紫芝。靈芝含有多種生物活性成分，目前研究較多的有多糖類[2-4]、三萜類[5]、多肽核苷類[6-7]、無機微量元素（鍺[8]、硒[9]）等。

靈芝三萜（Ganoderma lucidum triterpenoids，GLTs）是從靈芝中分離得到的活性成分之一，具有較高的藥用價值。與另一活性物質靈芝多糖相比，對其研究及應用并不廣泛。為深入了解GLTs類化合物，本文對這一活性物質進行詳細地綜述，主要概述其基本理化性質，歸納近5 年其在體內外藥理活性實驗中的研究進展，探究其發(fā)酵工藝條件優(yōu)化和分離純化方法，整理發(fā)酵分離所得純化產物的常用品質監(jiān)控技術，總結其在功能性食品中的應用，并提出在實際應用中所存在的問題，展望未來發(fā)展趨勢，以期日后能為靈芝功能性食品的生產和臨床醫(yī)學研究提供更多的理論參考。

1 理化性質

GLTs可從不同品種的靈芝中分離獲得，其含量是鑒定靈芝品質優(yōu)劣的重要指標之一[10]。1982年，自Takashi等[11]首次分離到靈芝酸（ganoderic acid，GA）A和GAB，迄今已鑒定的GLTs種類達300多種[12]。GLTs的化學結構較復雜，相對分子質量一般在400～600之間，脂溶性較高，難溶于水。多數(shù)GLTs具有苦味，苦味越強則GLTs含量越高[11]。從靈芝孢子粉、子實體、菌絲體及發(fā)酵液的提取物中分離出多種三萜類成分，大多是以GA為主的具有高度氧化性的羊毛甾烷衍生物，多為極性分子，揮發(fā)性弱。圖1為典型的羊毛甾烷三萜骨架[13]。

圖 1 典型的羊毛甾烷三萜骨架[13]Fig. 1 Backbone structure of typical lanostane triterpenoid[13]

根據(jù)分子結構不同，三萜類化合物可分為單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)、四環(huán)、五環(huán)和鏈狀三萜。根據(jù)異戊二烯定則，多數(shù)三萜被認為是由6 個異戊二烯（30 個碳）縮合而成的。依據(jù)碳原子數(shù)目的不同可分為C24、C27及C30 3 種。根據(jù)官能團和側鏈將其命名為GA、GA甲酯、赤靈酸、靈赤酸、靈赤酸甲酯、靈芝孢子酸、GLK孢子內酯、靈芝醇、靈芝醛和靈芝內酯等[14]。其結構式中多含羥基，在紅外光譜中有較強的羥基吸收峰；在紫外光譜250、237 nm和365 nm波長處有特征吸收峰；在質譜裂解過程中GLTs會失去側鏈。

2 藥理活性

GLTs結構和種類的多樣性決定了其藥理學和生物學活性的多樣性，包括抗氧化、保肝護肝、增強免疫、抗腫瘤、降血脂血糖、防治心血管疾病、緩解哮喘、抗人類免疫缺陷1型病毒（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）及HIV-1蛋白酶活性、抑制組胺釋放、抑制血小板聚集和防治癲癇等作用。

2.1 抗氧化性

通過測定1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基與羥自由基（·OH）的清除率可知，樹舌靈芝的總三萜與多糖均具有一定的抗氧化活性，且GLTs的抗氧化能力比多糖強，因此GLTs可作為天然防腐劑的新來源[15]。DPPH自由基清除效果顯示，GLTs比茶多酚的清除率高、效果好[16]。Tel-?ayan等[17]對樹舌環(huán)氧酸G、E、A和Δ22-豆甾烯醇進行了抗氧化活性和抗膽堿酯酶活性評估，結果表明乙酸乙酯提取物在所有測試中表現(xiàn)出最好的抗氧化活性，其中Δ22-豆甾烯醇在β-胡蘿卜素亞油酸實驗中顯示出較高的脂質過氧化抑制活性，半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為（160.39±2.16）μg/mL。松杉靈芝中的9 種GA混合物通過抑制異丙腎上腺素誘導的Fas/Fas配體表達、減輕氧化應激和防止細胞凋亡，達到保護小鼠心臟的功效[18]。

2.2 免疫調節(jié)活性

GLK中的三萜類化合物能通過增加白細胞介素-6和腫瘤壞死因子的表達來刺激免疫應答，經(jīng)GLK三萜治療后，小鼠的脾臟和胸腺的免疫器官指數(shù)明顯增加，GLK三萜類化合物在體外和體內均具有抗肺癌免疫調節(jié)活性和誘導細胞凋亡的作用[19]。通過皮膚實驗和抗原特異性血清中的免疫球蛋白E檢測鑒定每名哮喘患者的特異性過敏情況，各項指標結果表明GAβ能有效恢復患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的輔助性T1細胞/調節(jié)性T細胞-輔助性T1細胞平衡，使白細胞介素-5、干擾素-γ、白細胞介素-10和白細胞介素-12水平上升[20]，使哮喘癥狀得到有效緩解。Su Limin等[21]證明GA乙二酯（GA ethyl ganoderate C2，CBLZ-7）對體外胞囊的形成具有有效的抑制作用，其能夠下調佛司可林誘導的癌蛋白/絲裂原活化蛋白激酶信號通路的活化，結果表明GLTs及其純化單體CBLZ-7是治療囊性腎病的潛在藥物。Choi等[22]研究了12 種羊毛脂三萜烯在小鼠巨噬細胞RAW264.7中抗炎和對血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）的誘導作用，結果證實7 種二十碳三烯（GT-1、GT-2、GT-3、GT-4、GT-5、GT-7和GT-12）能誘導HO-1蛋白的表達，且HO-1表達與這些化合物在RAW264.7細胞中的抗炎反應顯著相關。通過測定29 種羊毛烷三萜對由脂多糖激活的小膠質細胞BV-2中的一氧化氮產生的抑制作用來測試它們的抗炎活性，IC50介于（3.65±0.41）～（28.04±2.81）μmol/L之間[23]。GAC1可通過阻斷核因子κB活化和抑制PBMCs產生腫瘤壞死因子、干擾素-γ和白細胞介素-17A等促炎性細胞因子，治療胃腸道的慢性炎性疾病克羅恩病[24]。Chen等[25]從松山靈芝（G. tsugae）中提取的三萜類化合物可抑制T細胞組胺釋放，具有抗過敏作用。GLTs和外源性神經(jīng)節(jié)苷脂的協(xié)同作用可有效改善大鼠癲癇腦損傷，其可能是通過影響反映腦組織損傷及炎癥反應的S蛋白-β、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、C反應蛋白和降鈣素基因相關肽蛋白表達而起到保護腦神經(jīng)元的作用[26]。

2.3 抗腫瘤活性

從靈芝中分離的GLTs具有廣譜的抗癌特性，主要包括對癌細胞的抗轉移、抗增殖和抗血管生成活性能力，但具體作用效果及其抗腫瘤機制還有待進一步研究，需得到體內實驗及臨床實驗的進一步驗證。目前的研究揭示了GLTs在誘導癌細胞凋亡和抑制端粒酶活性方面的作用，并且其對健康細胞的毒性低。Sillapapongwarakorn等[27]篩選了208 種GLTs，并通過對接軟件AutoDock4選擇性地穩(wěn)定潛在G-四聯(lián)體DNA（potential G-quadruplex DNA，pG4DNA）。結果表明，GAA和GADf表達出高度的結合親和力，并選擇性地結合到pG4DNA的側溝上，抑制端粒酶活性，可作為抗癌劑。閆征等[28]探究了3 種三萜化合物與5 種腫瘤細胞的劑量-效應關系，結果表明GAY能抑制肺癌細胞H460的活性，IC50為22.4 μmol/L，其次是7-氧代-GAZ2（IC50為43.1 μmol/L）。Kohno等[29]發(fā)現(xiàn)5 種羊毛甾烷衍生化合物GAT-Q、GAT-F、GAT-S、GAT-TR和靈芝酮三醇具有刺激微管蛋白聚合的潛力，且比先前報道的能特異性結合微管蛋白的GADM活性更高，為微管蛋白靶向抗癌藥物的設計提供指導。Zheng Dongshu等[30]分析了GAA、GAB、靈芝酚B、靈芝酮三醇和靈芝酮二醇的光譜，結果表明這5 種三萜類化合物可通過抑制端粒酶的活性預防鼻咽癌。GLTs通過調控細胞周期、減少凋亡蛋白，能顯著抑制前列腺癌細胞增殖并促進細胞凋亡[31]。Li Peng等[32]提取的新型三萜化合物對人原髓細胞白血病細胞HL-60和淋巴瘤細胞CA46癌細胞株具有細胞毒性，IC50分別為25.98、20.42 μg/mL。靈芝諾酮A對慢性髓原白血病細胞K562、肝癌細胞BEL7402和胃腺癌細胞SGC79002細胞株具有中等細胞毒性，IC50分別為7.62、6.28、3.550 2 μmol/L[33]。

2.4 抗菌、抗病毒活性

真菌是天然抗生素最豐富的來源之一，從真菌中可提取重要的抗生素青霉素。而作為同是真菌屬的靈芝，對其微生物活性化合物的研究大多以子實體和菌絲體的粗提取物為主體，關于GLTs抗菌活性的研究很少。Vazirian等[34]從氯仿提取物中分餾出的三萜類化合物和類固醇化合物混合物，能夠抑制革蘭氏陽性菌和酵母菌，最小抑制質量濃度為6.25 mg/mL，但在相同測試質量濃度下對革蘭氏陰性菌無效。其中，乙酸麥角甾-7,22-二烯-3β-醇和乙酸等萜醇化物的混合物對大腸桿菌的抑制作用微弱（最小抑制質量濃度10 mg/mL）。王開金等[35]研究了靈芝水提取物GLTs對恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis mc2155，M.S-155）的增殖曲線、GlmU基因表達和細胞壁結構的影響，結果表明GLTs對M.S-155抑制作用顯著。從醋酸乙酯提取物中提取的新型三萜類化合物（12b-乙酰氧基-3b,7b-二羥基-11,15,23-三氧代戊酸-8-烯-26-酸丁酯）對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出顯著的抗微生物活性，對金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）和枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）的最低抑菌濃度分別為68.5 μmol/L和123.8 μmol/L[36]。

腸道病毒71（enterovirus 71，EV71）是兒童手足口病、神經(jīng)系統(tǒng)和全身性并發(fā)癥的主要致病因素。Zhang Wenjing等[37]評估了GLTA和GLTB抗EV71病毒感染的活性。結果表明，兩種物質通過與病毒顆粒相互作用可阻止EV71感染，阻斷病毒對細胞的吸附，其在人橫紋肌肉瘤細胞中均有顯著的抗EV71活性。GA-B對HIV-1蛋白酶的親和力高于奈非那韋，靈芝二醇對惡性瘧原蟲I蛋白酶的親和力優(yōu)于惡性瘧原蟲I蛋白酶抑制劑（KNI-10006），可用作抗艾滋病毒和抗瘧疾藥物[38]。

2.5 保肝護肝活性

GLTs是保肝護肝的良藥。劉喬等[39]優(yōu)化了靈芝孢子粉中GA的提取工藝，并對其進行抗氧化活性實驗，首次證明GA能顯著提高亞急性衰老模型小鼠的肝臟抗氧化活性。Chiu等[40]通過人體實驗表明三萜類化合物和多糖的協(xié)同作用可能會通過減少過度產生的自由基影響其抗氧化、抗衰老和保肝功效，保護肝臟細胞免受損害。Peng Xingrong等[41]的研究表明，靈芝菌素B、丹芝醇B和赤芝酮A均具有顯著的肝臟保護作用，經(jīng)H2O2誘導損傷的體外人肝癌細胞HepG2中，3 種物質對谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶水平的升高均具有有效的抑制活性。劉莉瑩等[42]首次從樹靈芝（G. sessile）的苯乙醇提取物氯仿部位分離得到16 種三萜化合物，其中6 種對人肝HL-7702細胞的成活率高于護肝藥物雙環(huán)醇，為保護肝臟的臨床研究提供依據(jù)。

2.6 其他

GLTs是醛糖還原酶和α-葡糖苷酶的活性抑制劑，可抑制餐后高血糖，在糖尿病治療中發(fā)揮重要作用。Fatmawati等[43]從靈芝子實體中分離出靈芝醇和GA，對兩種物質的結構-活性研究表明，其特定位置的—OH取代基和雙鍵部分可增加α-葡萄糖苷酶抑制活性，此研究可用于改進新型α-葡萄糖苷酶抑制劑。GLTs具有良好的防輻射功效。Smina等[44]的研究表明靈芝子實體中的三萜在輻射導致的DNA和膜損傷方面具有顯著的保護效果。對瑞士白化小鼠注射GLTs預處理14 d，將其全身暴露于γ射線中，結果表明GLTs可抑制小鼠體內受γ射線誘導的氧化應激[45]。

GLTs以中等抑制率抑制血管緊張素轉換酶的活性[46]，GAF對人臍靜脈內皮細胞的毛細管樣結構的形成具有最強的抑制作用[47]。此外，GLTs還可用于治療凍傷[48]、阿爾茨海默病[49]和改善睡眠[50]等。

3 發(fā)酵、分離提取方法

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)

由于野生靈芝的數(shù)量有限及其不合理的利用，限制了靈芝的開發(fā)。人工栽培靈芝具有生長周期過長、消耗營養(yǎng)資源大、活性物質含量低、對自然環(huán)境影響大等不利因素。因此，可通過靈芝發(fā)酵生產的工藝途徑獲得靈芝產物及其代謝物，包括固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。

固定化靈芝細胞在耐酸、耐堿方面優(yōu)于未固定細胞，長時間培養(yǎng)仍具有較高生產能力。董玉瑋等[51]研究了包埋法固定靈芝細胞生產胞外三萜工藝，最佳條件為：海藻酸鈉和CaCl2質量分數(shù)分別為4.5%和2.2%、自然pH值培養(yǎng)基內接種40 個固定化小球、溫度為28 ℃，110 r/min下振蕩培養(yǎng)12 d，最終所得胞外三萜類產量為（49.53±1.37）×10-2mg/mL，回收利用次數(shù)可達5 次。

雙向發(fā)酵屬于一種新型發(fā)酵技術，將靈芝與另一種或多種中藥材按不同比例混合進行聯(lián)合發(fā)酵，此技術具有低毒性、增強藥效、提高活性成分吸收率等特點，例如以真菌靈芝為發(fā)酵菌種，添加一定量當歸粉末的藥性基質為發(fā)酵基質的雙向發(fā)酵[52]和靈芝菌-玄七通痹膠囊藥渣的雙向發(fā)酵[53]等，當歸質量濃度為60 g/L時，胞外總三萜產量可達964.63 mg/L[54]。

此外，采用中間補料的方式[55]，以N-10酵母自溶粉作為氮源[56]、加入氧載體正十二烷[57]和加抗生素兩性霉素[58]等進行的發(fā)酵效果均優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵。

3.2 分離純化

根據(jù)三萜的物理化學性質和生化反應特性差異，可利用溶解度、吸附力、蒸汽壓、中和、皂化和酶解等方式提取三萜化合物。通過控制溫度和真空條件等導致的物理化學性質的改變除去非GA類物質。隨著GLTs的研究開發(fā)，其提取方法也越來越多，主要包括傳統(tǒng)熱提取[59]、索氏提取（Soxhlet extraction，SE）[60-61]、微波輔助提?。╩icrowave-assisted extraction，MAE）[62-63]、超臨界萃?。╯upercritical fluid extraction，SFE）[64]和超聲波輔助提?。╱ltrasonic-assisted extraction，UAE）[65-66]等，如表1所示。近年來，UAE和MAE技術作為新興的提取方法，具有操作簡便、節(jié)省時間、能耗低、破壞有效成分少和效率高等特點，在三萜成分提取方面具有廣泛的工業(yè)化應用前景。

表 1 GLTs的常用提取技術Table 1 Summary of commonly used techniques for extraction of GLTs

4 質量控制方法

為保證GLTs的分離和提取過程中的質量要求，必須要對三萜類化合物進行分析，建立一個便捷、精確的分析方法以監(jiān)控產品質量。對GLTs可進行定性和定量分析，定性分析可采用化學試劑特征顯色法；定量分析可采用香草醛-濃硫酸試劑可見光比色法、紫外分光光度（ultraviolet spectrophotometry，UV）法、薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法以及色譜-質譜聯(lián)用技術。但在實驗室研究和實際應用中，最常見的還是UV、TLC及HPLC 3 種方法，目前已建立了很多GLTs化合物TLC、HPLC的標準指紋圖譜。

目前HPLC法已廣泛用于GLTs的定性測定中，具有分離效果好、操作簡單、重現(xiàn)性好、儀器精密度好、靈敏度高等優(yōu)點。此方法的主要缺陷在于GLTs標準品的分離純化困難，制備出的GLTs純品價格昂貴。在測定三萜酸的相關文獻中，所建立的方法僅用于測定一種或幾種GLTs，而GLTs種類有上百種，檢測數(shù)量受限。賈紅巖等[67]建立了能同時測定12 種三萜酸的方法，用于測定不同產地及品種GLTs成分的含量，結果顯示吉林長白山上的野生靈芝GLTs含量遠低于人工栽培的靈芝，且總GLTs含量僅為人工栽培靈芝的1/10。Liu Wei等[68]使用HPLC通過一測多評法同時檢測其他16 種GA及GLTs的含量。于華崢等[69]探討了靈芝子實體、菌絲體和孢子粉3 個部位中GLTs成分的差異，并對其HPLC指紋圖譜進行相似度分析。結果表明，靈芝子實體內總三萜含量高、種類多；菌絲體中的三萜含量低、種類少；未經(jīng)破壁的孢子粉中GLTs含量基本為零。

還有一些新方法可對靈芝總三萜進行快速檢測和品質鑒定。例如，Chen Yi等[70]建立了基于近紅外反射光譜法的不同來源靈芝、靈芝總多糖和三萜類化合物的定量方法；Sakamoto等[71]開發(fā)了膠體金免疫層析試紙條（immunochromatographic strip assay，ICA）快速檢測GAA的方法，該系統(tǒng)可以通過酶聯(lián)免疫吸附測定進行靈芝中GAA的半定量分析。新開發(fā)的ICA可用于以GAA為指標的靈芝的標準化。

5 功能性食品

GLTs類化合物在制藥領域已有一定的應用，例如生產各類抗癌[27,30-31]、護肝[40,42]、抗氧化[16-17]、提高免疫力[19,22]和降血糖血脂[43,72]類藥物。而其在食品中的實際應用遠不如靈芝多糖廣泛，由于GLTs的提取率低且價格高，一般不會在食品中添加純化的GLTs。添加了GA和靈芝多糖的酸奶相比于空白對照酸奶，風味物質種類增加，乳酸菌活菌數(shù)增加3.1 倍，功能性品質提高[73]。將發(fā)酵GLTs的殘渣添加于功能性動物飼料中，可促進豬的生長發(fā)育，增強其免疫力，使其肉品品質更好[74]。通過優(yōu)化椰肉、椰汁配比和過濾時間提高椰奶靈芝酒中GLTs含量可增強酒的功能性[75]。含三萜提取物的靈芝咖啡可促進小鼠免疫功能的提高[76]。

6 結 語

靈芝提取物GLTs化合物在癌癥治療、抗氧化、保肝護肝、抗病毒、降血糖血脂和防輻射等方面具有優(yōu)異的藥用潛力，是良好的藥食同源物質，在充滿發(fā)展?jié)摿Φ南M條件和國際環(huán)境驅動下，應發(fā)揮三萜的優(yōu)勢，開發(fā)具有高質量的功能性產品。

GLTs具有蓬勃的發(fā)展趨勢，但同時也要注意發(fā)展中不可忽視的客觀問題：1）應用性：靈芝及其活性提取物在食藥產品及保健品中的應用廣泛，但GLTs類化合物的相關產品仍較少；2）安全性：在食品安全問題嚴重的大環(huán)境下，靈芝受環(huán)境污染的影響，利用子實體及孢子粉提取的GLTs中不可避免的會含有一些重金屬離子，其細胞毒性和安全性需得到保障；3）單體純化：一方面，靈芝多糖和GLTs均是靈芝的主要活性物質，三萜類化合物在保肝護肝等某些藥理方面比靈芝多糖具有獨特優(yōu)勢，因此可制備純化的GLTs以達到高效治療或預防特定疾病的目的；另一方面，GLTs的種類繁多，但并非所有三萜都具有有效活性，而分離提取有效純化單體的技術不發(fā)達；目前，純化的GLTs價格昂貴、制備量小，不適用于工廠化生產，只能用于實驗室研究；4）規(guī)范化：GLTs檢測技術落后，產品質量缺乏統(tǒng)一規(guī)范標準，良莠不齊；GLTs的精深加工具有高經(jīng)濟效益，故必定存在優(yōu)劣混雜、摻假和仿冒等問題。

因此，GLTs的未來發(fā)展應立足于以下4 個方面：1）提高GLTs的應用潛力，致力于功能性食品及藥品，尤其是保健品的開發(fā)；強調GLTs的功能性，從人體細胞學、代謝組學和預防醫(yī)學的角度入手，致力于研發(fā)出為糖尿病、肝病和艾滋病等特殊人群以及癌癥人群服務的高性價比產品；2）深度純化三萜化合物，提高GLTs的分離純化和發(fā)酵技術，增加產量；3）深入研究三萜的藥理活性機制，制備運用于食品藥品的精深加工純化單體；4）規(guī)范產品質量的統(tǒng)一標準，完善GLTs指紋圖譜，尋求三萜化合物有效成分的快速檢測方法，為GLTs規(guī)?；a提供質量保障。