李 陽(yáng), 楊 奕, 邵 兵, 鄒 悅, 宋 宇, 舒 琳, 梁?jiǎn)⒒? 韓南銀*

(1. 北京大學(xué)藥學(xué)院, 北京 100191; 2. 北京市疾病預(yù)防控制中心, 北京 100013)

場(chǎng)流分離(field flow fractionation, FFF)技術(shù)是近年來(lái)新興發(fā)展的一種分離分析方法,主要應(yīng)用于大分子,因其具有溫和、廣譜的分離特性,同時(shí)分離過(guò)程不會(huì)改變被分析物的結(jié)構(gòu)形態(tài)和生物活性,尤其適合生物大分子的分析應(yīng)用,從而引起越來(lái)越多的關(guān)注[1-4]。非對(duì)稱流場(chǎng)流分析(asymmetrical flow field flow fractionation, AF4)是場(chǎng)流技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的一個(gè)分支,也是目前可信賴的納米顆粒分離和表征的方法。AF4類似于液相色譜,區(qū)別在于其沒(méi)有固定相,僅由通道流(channel flow)和垂直于通道的交叉流(cross flow)組成。AF4的分離在如圖1所示的領(lǐng)帶形的可滲透超濾膜(截留相對(duì)分子質(zhì)量通常為10或30 kDa)通道中進(jìn)行[5]。在分離的過(guò)程中,載液在通道中的層流作用下在通道的橫截剖面上形成拋物線形輪廓,向前移動(dòng)。離上下壁越近的載液移動(dòng)速度越慢,越靠近通道中心的載液移動(dòng)速度越快。與此同時(shí),被分析物在cross flow的帶動(dòng)下,向著下方的積累壁移動(dòng)。被分析物由于自身的擴(kuò)散作用產(chǎn)生一個(gè)和cross flow方向相反的力,使顆粒偏向于拋物線的中心即流速最快的點(diǎn)。顆粒的大小及尺寸不同,所產(chǎn)生的擴(kuò)散力不同。顆粒越小,擴(kuò)散作用越明顯,越靠近拋物線中心。根據(jù)顆粒的流體動(dòng)力學(xué)性質(zhì)在AF4通道中產(chǎn)生流速分級(jí),小粒越靠近中心位置,相較于大顆粒更快地被洗脫[6,7]。

圖 1 AF4分離通道Fig. 1 Separate channel of the asymmetrical flow field flow fractionation (AF4)

食物過(guò)敏通常是由食物中的蛋白質(zhì)引起的,這種蛋白質(zhì)稱為過(guò)敏原蛋白。而過(guò)敏原蛋白參與過(guò)敏反應(yīng)的往往只有氨基酸序列中的一小段抗原決定簇(數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)氨基酸),又被稱為“表位”[8]。傳統(tǒng)的表位研究方法有酶解技術(shù)、肽掃描技術(shù)等,20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的質(zhì)譜技術(shù)是目前表位定位應(yīng)用較多的一種方法[9-11]。表位預(yù)測(cè)主要是采用生物信息學(xué)方法,不管是酶解法、構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)篩選法以及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法等,這些方法大都需要預(yù)先設(shè)計(jì)肽段的氨基酸序列然后進(jìn)行合成,之后再將這些合成的肽段與免疫球蛋白E(IgE)進(jìn)行結(jié)合,測(cè)定活性以篩選表位,其針對(duì)性差,繁瑣,效率低下[11]。

蝦蟹等甲殼類動(dòng)物是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織提出的八大類過(guò)敏食物中重要的一類。研究發(fā)現(xiàn),蝦的主要過(guò)敏原是一種相對(duì)分子質(zhì)量約為32 kDa的酸性糖蛋白----原肌球蛋白(TM), TM的等電點(diǎn)在4.5左右,其氨基酸組成中沒(méi)有色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸的含量也較少[12,13]。雖然蝦原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)比較清楚,但是其引起食物過(guò)敏的表位研究還較少,1993年Shanti等[14]第一次利用過(guò)敏患者和對(duì)照者血清發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)過(guò)敏原表位,分別為第50-66位和第153-161位的氨基酸殘基。為了進(jìn)一步研究蝦過(guò)敏原蛋白的空間表位,Ayuso等[15,16]利用36段有重復(fù)序列的多肽,用18位蝦過(guò)敏患者血清進(jìn)行檢測(cè)時(shí),發(fā)現(xiàn)了5個(gè)肽段具有IgE結(jié)合活性。

非對(duì)稱流場(chǎng)流分離技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)的分析,但對(duì)過(guò)敏原蛋白的分析研究較少[17-19]。受到Schachermeyer等[20,21]運(yùn)用AF4對(duì)IgE和適配體等結(jié)合檢測(cè)的啟發(fā),擬引入AF4和UPLC-QTOF-MS聯(lián)用建立過(guò)敏原蛋白表位的快速篩選方法。本實(shí)驗(yàn)使用非對(duì)稱流場(chǎng)流分離技術(shù)將選擇的過(guò)敏原蛋白蝦TM的酶解肽段與IgE孵育后的免疫復(fù)合物分離,收集AF4流出的組分,經(jīng)濃縮后進(jìn)行UPLC-QTOF-MS檢測(cè),匹配已經(jīng)建立的過(guò)敏原蛋白肽譜,尋找過(guò)敏原蛋白的抗原表位,實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖2。此方法可以反映過(guò)敏原蛋白和IgE在體外的結(jié)合情況,為過(guò)敏原蛋白表位篩選提供了一種新方法策略,同時(shí)擴(kuò)展了非對(duì)稱流場(chǎng)流技術(shù)的應(yīng)用。

圖 2 實(shí)驗(yàn)流程Fig. 2 Experimental processesIgE: immunoglobulin E.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

Eclipse AF4非對(duì)稱流場(chǎng)流分離儀購(gòu)自美國(guó)懷亞特(Wyatt)公司;Agilent 1200系列四元泵、脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器和UV/Vis檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司);超高效液相色譜(ACQUITY UPLC)-離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Vion IMS QTOF)、ACQUITY UPLC?BEH300 C4色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)均購(gòu)自美國(guó)Waters公司。電子分析天平(BS 210S,德國(guó)Sartorius公司),空氣浴振蕩器(HZQ-C,常州朗越公司),微型冷凍離心機(jī)(5418R, Eppendorf公司),超濾離心管(Amicon Ultra-5, 10 kDa),再生纖維素膜(RC膜,截留相對(duì)分子質(zhì)量30 kDa)購(gòu)自Wyatt公司;水系聚醚砜微孔濾膜(0.2 μm)購(gòu)自津騰公司。

蝦TM標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)購(gòu)自美國(guó)Indoor公司,人IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)、二硫蘇糖醇(DTT,純度99%)、乙酸鈉(3 mol/L)購(gòu)自碧云天,RapiGest SF表面活性劑購(gòu)自美國(guó)Waters公司,乙腈(含 0.1%(v/v)甲酸，LC-MS 級(jí))、胰蛋白酶(蛋白組學(xué)級(jí))、鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%～38%)、碘乙酰胺(IAA,純度98%)、甲酸(純度99%)、碳酸氫銨(純度99%)、三氟乙酸(純度99%)購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific 公司,NaCl、MgCl2、KCl、K2HPO4、Na2HPO4512H2O、NaH2PO452H2O、NaOH、磷酸、NaN3均為分析純,購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司。試驗(yàn)用水由Milli-Q Plus水凈化系統(tǒng)制備(電阻率18.2 MΩ·cm)。

碳酸氫銨溶液(0.05 mol/L):準(zhǔn)確稱取碳酸氫銨0.395 0 g,置于100 mL容量瓶中用超純水溶解并定容至100 mL。碳酸氫銨溶液(0.05 mol/L,含0.1% RapiGest SF):準(zhǔn)確稱取1 mg RapiGest SF試劑加入到1 mL碳酸氫銨溶液(0.05 mol/L)中,充分溶解。碘乙酰胺溶液(1 mol/L):準(zhǔn)確稱取碘乙酰胺1.85 g于10 mL棕色容量瓶中,用超純水溶解并定容至10 mL,于2～8 ℃避光保存。胰蛋白酶溶液(1 mg/mL): 將20 μg胰蛋白酶固體加入20 μL鹽酸(0.001 mol/L)中充分溶解,-80 ℃保存。DTT溶液(1 mol/L): 將3.09 g DTT加入20 mL 乙酸鈉溶液(0.01 mol/L)充分溶解，過(guò)濾除菌后于-20 ℃保存。

1.2 過(guò)敏原蛋白酶解

取50 μL TM標(biāo)準(zhǔn)溶液于1.5 mL離心管中,加入50 μL碳酸氫銨溶液(0.05 mol/L,含0.1% RapiGest SF),混勻后加入0.5 μL DTT (1 mol/L)溶液,在95 ℃下孵育10 min,冷卻至室溫后加入1.5 μL IAA(1 mol/L),室溫避光放置45 min后加入1 μL胰蛋白酶液(1 mg/mL), 37 ℃振搖酶解12 h。加入0.5 μL三氟乙酸,37 ℃下振搖30 min后以14 000 r/min離心10 min,取上清液待分析。

1.3 體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)

將TM標(biāo)準(zhǔn)溶液和IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積混合,孵育30 min進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn),孵育后的溶液進(jìn)行AF4分析。將TM標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2節(jié)的酶解條件進(jìn)行酶解,進(jìn)行TM水解肽段與IgE的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn),用于研究TM的抗原表位。具體操作如下:將酶解肽段與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積混合,孵育30 min。孵育后的溶液進(jìn)樣AF4進(jìn)行分析,在IgE的出峰時(shí)間收集流出的組分,并用10 kDa超濾管于4 ℃離心15 min,將收集到的流出組分進(jìn)行濃縮,之后加入1 μL DTT(1 mol/L)用于UPLC-QTOF-MS分析。

1.4 分離條件

1.4.1AF4實(shí)驗(yàn)條件

AF4通道的幾何參數(shù):長(zhǎng)度153 mm,最大寬度22 mm;使用350 μm墊片作為通道厚度,以截留相對(duì)分子質(zhì)量30 kDa的再生纖維素膜作為積累壁膜,以PBS作為載液,使用前經(jīng)過(guò)0.2 μm水系聚醚砜微孔濾膜過(guò)濾,現(xiàn)用現(xiàn)配。在進(jìn)樣前,載液先沖洗、平衡通道至少30 min,確保通道的潔凈和實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。進(jìn)樣量:10 μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。儀器操作和數(shù)據(jù)處理均使用安捷倫Open lab軟件。AF4洗脫參數(shù)檢測(cè)器流(detector flow)、聚焦流(focus flow)、進(jìn)樣流(inject flow)和cross flow設(shè)置見(jiàn)表1。

表 1 AF4洗脫條件Table 1 Elution conditions of AF4

1.4.2UPLC-QTOF-MS條件

色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);色譜柱溫度為80 ℃;進(jìn)樣體積為1 μL;流速為0.3 mL/min;流動(dòng)相A: 0.1%(v/v)甲酸-水,流動(dòng)相B: 0.1%(v/v)甲酸-乙腈,梯度洗脫條件:0～1 min, 98%A; 1～5 min, 98%A～50%A; 5～10 min, 50%A～5%A; 10～16.5 min, 5%A; 16.5～17 min, 5%A～98%A; 17～20 min 98%A.

電噴霧離子源(ESI+);離子源接口電壓為3 kV;霧化氣為氮?dú)?流速為2.0 L/min;加熱氣為空氣,流速為15 L/min;干燥氣為氮?dú)?流速為5 L/min;碰撞氣為氬氣;離子源接口溫度為100 ℃;脫溶劑管溫度為300 ℃;加熱模塊溫度為250 ℃;掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);延遲時(shí)間為3 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 AF4分析方法的建立

2.1.1紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通常蛋白質(zhì)的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為280 nm, 280 nm波長(zhǎng)下的紫外吸收主要來(lái)自于蛋白質(zhì)樣品中的酪氨酸和色氨酸[22],然而TM的氨基酸組成中沒(méi)有色氨酸,酪氨酸的含量也較少[12],因此TM在280 nm下的紫外吸收較弱。215 nm是肽鍵的特征紫外吸收,更適合于小分子多肽和不含酪氨酸、色氨酸的相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)[23]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TM在215 nm下的吸收和峰形與280 nm相比均較優(yōu),因此最終設(shè)定紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

2.1.2分離參數(shù)的優(yōu)化

天然的過(guò)敏原蛋白粒徑偏小,通常在100 nm以下,AF4實(shí)驗(yàn)洗脫參數(shù)中的cross flow值一般設(shè)定在3 mL/min才能保證過(guò)敏原蛋白緊貼積累壁,成功聚焦。cross flow和detector flow的比值會(huì)影響樣品的保留時(shí)間,通常情況下,cross flow/detector flow值設(shè)定為3。TM是一種十分易于聚集的蛋白質(zhì),其在分析過(guò)程中可能發(fā)生聚集,detector flow值設(shè)置得越小,縱向的流速則越慢,則將會(huì)增加樣品分子間的碰撞。focus flow值越高,聚焦的條帶越窄,也可能增加分子間的碰撞,因此應(yīng)設(shè)定適宜的focus flow和detector flow以減少蛋白質(zhì)在分析過(guò)程中發(fā)生聚集。此外,載液條件如載液的種類、離子強(qiáng)度、pH等均會(huì)對(duì)過(guò)敏原蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響。同時(shí),實(shí)驗(yàn)中采用的再生纖維素膜的性質(zhì)也會(huì)因載液的不同而不同。課題組前期的工作中對(duì)載液條件進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,本實(shí)驗(yàn)中載液條件的選擇參考梁?jiǎn)⒒鄣萚24]的研究。綜上,最終確定TM的AF4分離條件(見(jiàn)表1)。

圖 3 TM標(biāo)準(zhǔn)溶液、IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液及TM-IgE結(jié)合物的 AF4-UV流出圖Fig. 3 AF4-UV fractograms of TM reference, IgE reference and TM-IgE complex

2.2 TM與IgE體外結(jié)合的AF4分析

將TM標(biāo)準(zhǔn)溶液與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積混合后孵育30 min,反應(yīng)液經(jīng)AF4-UV分析檢測(cè),考察是否形成TM-IgE復(fù)合體,從而研究TM與IgE是否可以在體外發(fā)生特異性結(jié)合。

圖3為蝦TM標(biāo)準(zhǔn)溶液、IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液、TM標(biāo)準(zhǔn)溶液與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育液的AF4-UV流出圖。TM的相對(duì)分子質(zhì)量約為32 kDa, IgE的相對(duì)分子質(zhì)量約為188 kDa,根據(jù)AF4的分離原理,相對(duì)分子質(zhì)量小的物質(zhì)會(huì)優(yōu)先出峰,由于TM和IgE相對(duì)分子質(zhì)量相差較大,理論上兩者在AF4中應(yīng)具有良好的分離度。然而,由于TM自身的聚集效應(yīng)很強(qiáng),在溶液中主要以聚集體的形式存在,其在溶液中的分子尺寸較大,導(dǎo)致TM與IgE的出峰時(shí)間十分相近,難以達(dá)到很好的分離效果。盡管TM與IgE在AF4中不能完全分離,但由圖3可見(jiàn)保留時(shí)間約12 min的TM標(biāo)準(zhǔn)溶液和IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育液的出峰時(shí)間較TM標(biāo)準(zhǔn)溶液、IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液略有延遲,表明孵育液的相對(duì)分子質(zhì)量較TM和IgE均有增加,說(shuō)明TM標(biāo)準(zhǔn)溶液與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液可以在體外孵育形成TM-IgE復(fù)合物。

2.3 TM抗原表位的AF4-UPLC-QTOF-MS分析

2.3.1TM的肽譜分析

圖4為TM標(biāo)準(zhǔn)溶液的酶解指紋肽譜,肽譜分析采用UNIFI軟件結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中TM的氨基酸序列數(shù)據(jù),自動(dòng)檢索每一個(gè)酶解肽段的氨基酸序列。圖4肽譜分析中下劃線部分為本實(shí)驗(yàn)中實(shí)際檢測(cè)到的肽段片段,計(jì)算得到TM標(biāo)準(zhǔn)溶液的水解肽段覆蓋率為95%,說(shuō)明TM在實(shí)驗(yàn)條件下基本水解完全,可以用于后續(xù)的酶解肽段與IgE的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

圖 4 TM酶解指紋肽譜及肽譜分析(下劃線部分為 檢測(cè)到的片段)Fig. 4 Fingerprint peptide spectrum of TM and the analysis of peptide spectrum (The underscore parts are the detected fragments.)

2.3.2TM抗原表位分析

將TM酶解肽段與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液混合孵育30 min,孵育液濃縮后經(jīng)UPLC-QTOF-MS分析,結(jié)果見(jiàn)圖5。根據(jù)AF4的分離原理,只有相對(duì)分子質(zhì)量大于30 kDa的化合物才能保留在分離通道內(nèi),隨洗脫液一起流出到達(dá)檢測(cè)器。而相對(duì)分子質(zhì)量小于30 kDa的化合物則會(huì)在cross flow的作用下直接濾過(guò)再生纖維膜至廢液,不能被檢測(cè)器所檢測(cè)到。本實(shí)驗(yàn)中,只有在孵育過(guò)程中與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)生結(jié)合的肽段才能以肽段-IgE復(fù)合物的形式跟隨洗脫液一起流出,而那些沒(méi)有與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)合的肽段在通過(guò)AF4時(shí)會(huì)直接流出到廢液。因此,我們認(rèn)為只有具有抗原表位活性的酶解肽段才能與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)合形成肽段-IgE復(fù)合物,并以復(fù)合物的形式經(jīng)AF4流出被收集。通常酶解肽段含5～20個(gè)氨基酸,其相對(duì)分子質(zhì)量通常在500～2 000 Da之間。而IgE的相對(duì)分子質(zhì)量約為188 kDa,因此酶解肽段與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)合物的相對(duì)分子質(zhì)量與IgE的相對(duì)分子質(zhì)量相比相差不大,從而導(dǎo)致了肽段-IgE復(fù)合物在AF4中的保留行為與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液基本一致。

圖 5 孵育后結(jié)合的TM肽段的UPLC-QTOF-MS色譜圖Fig. 5 UPLC-QTOF-MS chromatogram of the binding TM peptides after incubation

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與TM標(biāo)準(zhǔn)溶液的酶解肽譜相比,TM酶解肽段與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)合后可以檢測(cè)到的肽段數(shù)量明顯減少。經(jīng)軟件分析,共檢測(cè)到12條肽段,這些肽段即是潛在的表位抗原,檢測(cè)到的肽段信息在表2中詳細(xì)列出。文獻(xiàn)[25]采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)TM的抗原表位,認(rèn)為TM的12-25、47-60、87-105、112-128、131-147、155-167、187-203、221-239、243-259、263-280氨基酸殘基均是抗原表位。本研究共檢測(cè)到12條可能是抗原表位的氨基酸殘基,其中ADTLEQQNK(22-30)、IQLLEEDLER(92-101)、LAEASQAADESERMA(113-127)、EARFLAEEADR (150-160)、FLAEEADRK (153-161)、YDEVAR(162-167)、AETGESK(183-189)、IVELEEELR(190-198)、EQIK(223-226)、SVQKLQK(245-251)共計(jì)10條與文獻(xiàn)報(bào)道具有較高的一致性。

表 2 檢測(cè)到的與IgE結(jié)合的TM肽段Table 2 Peptide segments detected in combination with IgE

3 結(jié)論

本文采用非對(duì)稱流場(chǎng)流分離技術(shù)聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)過(guò)敏原表位的研究進(jìn)行了初步的探索。通過(guò)AF4實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蝦TM標(biāo)準(zhǔn)溶液與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液可以在體外發(fā)生結(jié)合,通過(guò)將蝦TM標(biāo)準(zhǔn)溶液酶解成為肽段之后與IgE標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行結(jié)合,之后采用AF4-UPLC-QTOF-MS研究策略,分析了蝦TM的抗原表位。實(shí)驗(yàn)共篩選得到12條可能含有抗原表位的肽段,其中10條肽段的氨基酸序列與文獻(xiàn)[25]所預(yù)測(cè)的蝦TM抗原表位基本一致。本實(shí)驗(yàn)將AF4應(yīng)用于過(guò)敏原蛋白表位的檢測(cè),拓展了AF4技術(shù)的應(yīng)用,同時(shí)為過(guò)敏原表位篩選提供了一種新的研究策略,通過(guò)進(jìn)一步的研究有望建立起AF4-UPLC-QTOF-MS的過(guò)敏原蛋白表位篩選平臺(tái)。