湯娜娜,王曉燕,張石玉,趙成光,蔣波,趙海燕,朱季軍

乙型肝炎病毒感染所致的慢性肝病是危害我國(guó)人民群眾健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-3]。慢性肝病的進(jìn)展主要包括了機(jī)體的炎癥反應(yīng)及其修復(fù)過(guò)程，該過(guò)程可導(dǎo)致肝血管生成、肝臟的纖維化、肝硬化，甚至肝癌[4]。肝纖維化的特征是由細(xì)胞外基質(zhì)代替肝細(xì)胞，特別是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和膠原，會(huì)導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的紊亂[5]。血管生成素2(Angiopoietin-2, Ang-2)是一類內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的家族成員，其功能主要參與病理性血管損傷與重建[6]。近年有報(bào)道Ang-2參與丙型肝炎后肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，但是在乙肝后肝硬化中尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將探討Ang-2在乙肝后肝硬化患者血清中的水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取宿遷市第一人民醫(yī)院2016年1月至2018年8月收治的92例乙肝后肝硬化患者作為肝硬化組，另選取同期宿遷市第一人民醫(yī)院門(mén)診體檢健康的志愿者92例作為健康對(duì)照組。肝硬化組，男67例，女25例，平均年齡(47.5±8.1)歲；肝硬化程度：代償期肝硬化33例、失代償期肝硬化59例；Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)33例、B級(jí)40例、C級(jí)19例。健康對(duì)照組，男67例、女25例，平均年齡(46.7±7.9)歲。兩組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，納入的研究對(duì)象均了解本研究目的，自愿簽訂知情同意書(shū)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合2015版慢性乙型肝炎防治指南中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]的乙肝后肝硬化患者；或肝臟生化相關(guān)指標(biāo)無(wú)異常，既往無(wú)肝病病史，無(wú)其他系統(tǒng)性疾病及惡性腫瘤的健康志愿者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①其它原因造成的肝損或肝硬化；②近2周內(nèi)有服用可能影響肝功能藥物者；③妊娠期婦女；④疑似或確診的惡性腫瘤患者；⑤既往或現(xiàn)有大量飲酒史。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清樣本收集

住院病人入院后，或門(mén)診體檢人員，清晨空腹，抽取外周靜脈血約10 mL，進(jìn)行離心10 min(3 200 r/min)，取上清，存于干燥管中，并置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 Ang-2含量測(cè)定

取冷存血清標(biāo)本約2.0 mL，室溫下解凍，取ELISA試劑盒(SEA009Hu，USCN，中國(guó)武漢)凍干粉溶解制備標(biāo)準(zhǔn)品，選用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定血清中Ang-2含量，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Ang-2水平比較

肝硬化組血清中Ang-2水平為(5 962.8±2 227.5)pg/mL，顯著高于健康對(duì)照組的(3 590.1±1 483.1)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.505，P<0.001)。在肝硬化患者中，失代償期患者Ang-2水平為(7 340.6±1 411.0)pg/mL，顯著高于肝硬化代償期患者的(3 499.6±862.6)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.203，P<0.001)，見(jiàn)圖1。另外根據(jù)Child分級(jí)將肝硬化患者分為3組，可以看到隨著分級(jí)提高，血清中的Ang-2水平明顯上升(兩兩比較P值均< 0.001)。

A：健康對(duì)照組(n=92)vs. 肝硬化組(n =92)；B：肝硬化代償期(n =33)vs. 肝硬化失代償(n =59)；C：Child分級(jí)A級(jí)(n =33)vs. B級(jí)(n =40)vs. C級(jí)(n =19)

2.2 血清Ang-2水平與肝纖四項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性

納入研究對(duì)象血清中Ang-2蛋白的含量與肝臟纖維化指標(biāo)[層粘連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸酶(HA)、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)及Ⅳ型膠原(C-Ⅳ)]呈顯著相關(guān)性(P均<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 184例研究對(duì)象血清Ang-2含量與肝臟纖維四項(xiàng)相關(guān)性分析

2.3 不同血清Ang-2水平患者肝硬化比率比較

將所有研究對(duì)象(即健康人群和肝硬化人群)按Ang-2含量排序(從低到高)進(jìn)行三等分組(T1，n=61；T2，n=61；T3，n=62)，分析其肝硬化患者的百分比。隨著Ang-2水平的提高，肝硬化患者的百分比亦升高(T1-T3，24.6%、44.3%、80.6%，P< 0.001及l(fā)inear-by-linear association,P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同血清Ang-2水平患者肝硬化比率比較

2.4 Ang-2含量判斷肝硬化的ROC曲線

采用入院時(shí)血清中Ang-2含量判斷納入研究對(duì)象是否患有乙肝后肝硬化，制作ROC曲線，顯示AUC為0.795(95% CI, 0.732-0.859)，P<0.001，見(jiàn)圖3。根據(jù)Youden index判斷，最佳敏感度為0.522，特異度為1.000，其最佳界值為5 965.5 pg/mL。

圖3 Ang-2判斷乙肝后肝硬化的ROC曲線

3 討論

血管生成素是一類作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)蛋白家族，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4[6]。其通過(guò)識(shí)別酪氨酸激酶-2受體(Tie-2)，在炎癥所致的血管重構(gòu)及腫瘤血管生成和增長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[9]。Ang-1被認(rèn)為是Tie-2的活化配體，而Ang-2由于與Ang-1高度同源，以相似親和力與Tie-2結(jié)合，因此被看做是Tie-2的拮抗劑[9-10]。Ang-2在血管重構(gòu)的組織中由活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌，可通過(guò)拮抗Ang-1來(lái)促進(jìn)血管生成。在血管重建活動(dòng)較弱的靜止組織中，Ang-2水平較低。而在炎癥和血管活躍生成的組織中，Ang-2的表達(dá)量會(huì)顯著增加[10-11]。

肝臟活檢病理是對(duì)肝臟慢性病進(jìn)行診斷和分期的金標(biāo)準(zhǔn)[11-13]。但是活檢評(píng)價(jià)肝臟纖維化一方面受到取樣區(qū)域的選擇以及病理醫(yī)生主觀的影響，另一方面由于其有創(chuàng)性及潛在的并發(fā)癥的約束，并不適合長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)評(píng)估慢性肝病患者的病程，無(wú)法對(duì)患者臨床治療管理提供動(dòng)態(tài)的依據(jù)[14-16]。

慢性肝病病程中的肝纖維化和肝硬化往往與肝內(nèi)病理性血管生成密切相關(guān)[17-18]。既往研究證實(shí)，肝硬化的進(jìn)展體現(xiàn)在血管密度的提高和相關(guān)血管生長(zhǎng)因子高表達(dá)[18-19]。西班牙的科學(xué)家近年發(fā)現(xiàn)：Ang2與丙肝后肝纖維化進(jìn)程相關(guān)，對(duì)肝硬化分期具有良好的特異性和敏感性，可作為一項(xiàng)潛在的檢測(cè)肝纖維化進(jìn)程的生物標(biāo)記物[19-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，乙肝后肝硬化患者血清中Ang-2水平明顯升高；與肝硬化代償期患者相比，失代償期患者Ang-2明顯上升；同時(shí)，隨著肝功能Child分級(jí)提高，血清中的Ang-2也顯著增加。但是，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，Child A級(jí)患者血清的Ang-2水平與健康人群并無(wú)差異。因此，Ang-2可能并不適合用于區(qū)別健康人群與肝硬化代償期患者。此外，Ang-2還與肝臟纖維指標(biāo)HA、PC-III以及C-IV呈正相關(guān)。在本研究納入研究對(duì)象中，血清中Ang-2含量越高，其患有肝硬化的概率越高。最后，ROC曲線下受試者工作曲線顯示，Ang-2具有良好的判斷肝硬化的能力，其最佳界值為5 965.5 pg/mL，敏感度為0.522，特異度為1.000。

本研究也尚有一些不足：①未納入慢性乙肝但無(wú)肝硬化的患者；②樣本量較少，仍需多中心大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證；③未來(lái)的研究中納入其它原因造成的肝損患者，如自身免疫性肝病或丙型肝炎等。

本研究第一次報(bào)道了Ang-2在乙肝后肝硬化中的水平變化，Ang-2或可作為乙肝后肝硬化的生物標(biāo)記物，特別是應(yīng)用于判斷肝硬化失代償期患者；與健康人群鑒別時(shí)顯示出較好的特異度。