摘 要 血漿中藥物（或內(nèi)源性物質(zhì)）濃度檢測(cè)是藥代動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)，也是藥物臨床前和一期臨床研究重要組成部分，還是一些疾病和胎兒早期篩查的重要指標(biāo)。目前血漿中藥物濃度檢測(cè)廣泛采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。而LCMS/MS測(cè)定過程中，常遇到藥物的檢測(cè)靈敏度不夠的問題。檢測(cè)靈敏度不夠主要是由于藥物濃度過低或藥物結(jié)構(gòu)質(zhì)譜響應(yīng)低造成的。本文概述了LC-MS/MS法血藥濃度檢測(cè)中提高靈敏度的主要途徑，即根據(jù)藥物結(jié)構(gòu)，從質(zhì)譜方法、色譜方法、樣品制備方法和避免低濃度樣品污染四個(gè)方面來聯(lián)合提高藥物檢測(cè)靈敏度的解決方案，從而為解決血漿中藥物檢測(cè)靈敏度不夠的困難提供幫助。

關(guān)鍵詞 LC-MS/MS 低靈敏度 超低濃度

中圖分類號(hào)：O657； R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）05-0074-05

An over view of methods for improving sensitivity in the determination of plasma drug concentration by liquid chromatography-mass spectrometry

MA Zhiyu1，2*（1. Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China； 2. Shanghai Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT The determination of drug （or endogenous substance） concentration in plasma is the basis of pharmacokinetics， an important component of preclinical and phase I clinical studies and also an important indicator of some diseases and early fetal screening. At present， the determination of drug concentration in plasma is mainly performed by liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS/MS）. The most difficult problem often encountered in the LC-MS/MS analysis is the one of insufficient sensitivity of drug determination， which is mainly due to the low drug concentration or the low response of the drug structure to mass spectrometry. This paper outlines the main ways to improve the sensitivity of LC-MS/MS for the determination of plasma drug concentration， and the solutions to improve drug determination sensitivity are described based on the drug structure from four aspects such as the mass spectrometry method， chromatographic method， sample preparation method and avoidance of low concentration sample contamination so as to provide helps for solving the difficulty of insufficient sensitivity of drug determination in plasma.

KEY WORDS LC-MS/MS； low sensitivity； ultra-low concentration

測(cè)定血藥濃度是研究藥代動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)，而動(dòng)物和人的藥動(dòng)學(xué)研究是藥物臨床前研究和一期臨床安全性評(píng)價(jià)重要組成部分，是新藥上市之前研發(fā)必由之路，同時(shí)還是疾病和胎兒早期篩查的重要途徑。由于血漿中含有血漿蛋白、鹽離子、水分和待測(cè)藥物等復(fù)雜組分，且其中藥物濃度相對(duì)較低，而液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/ MS）集分離和檢測(cè)技術(shù)為一體，能把藥物從體內(nèi)大多數(shù)復(fù)雜物中分離出來進(jìn)行測(cè)定，故成為目前測(cè)定血漿中藥物濃度的主要方法[1-6]。

藥物血漿濃度檢測(cè)中，由于檢測(cè)靈敏度不夠而不能滿足測(cè)定要求是最常見的問題[7-8]。其原因一方面是待測(cè)藥物血漿中濃度過低，另一方面是藥物本身結(jié)構(gòu)響應(yīng)低或質(zhì)譜離子化不穩(wěn)定，比如某些類固醇類藥物不含質(zhì)譜響應(yīng)基團(tuán)或某些藥物（如魚腥草素）質(zhì)譜中裂解[3-6，9]。以上的兩種問題都需要提高儀器對(duì)藥物檢測(cè)靈敏度來滿足測(cè)定要求。本文將對(duì)LC-MS/MS法測(cè)定血漿中藥物如何提高檢測(cè)靈敏度的方法進(jìn)行概述，為該類藥物的血漿濃度測(cè)定提供參考，從而為藥物研發(fā)提供幫助。在建立液相色譜-質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）測(cè)定血漿中藥物方法時(shí)，一般從三方面進(jìn)行優(yōu)化：質(zhì)譜方法、色譜方法和樣品制備方法。本文將分別從這三個(gè)方法來概述建立此類方法的具體注意事項(xiàng)。

1 質(zhì)譜方法

待測(cè)藥物在質(zhì)譜儀測(cè)定時(shí)的響應(yīng)往往和藥物本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜儀所用離子源、質(zhì)譜儀相關(guān)參數(shù)和待測(cè)藥物形成的加和離子類型或裂解離子等因素有關(guān)[7-12]。

1.1 離子源類型

目前的液相色譜-質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）通常有三種離子源：ESI源（電噴霧離子化源）、APCI源（大氣壓化學(xué)電離源）和APPI源（大氣壓光電離源）。而在藥學(xué)領(lǐng)域，主要應(yīng)用ESI源和APCI源。它們使藥物離子化的方式不同，ESI源是使藥物在液體狀態(tài)下帶電，APCI源是使藥物在氣體狀態(tài)下離子化。故而ESI源適合于大多數(shù)有一定極性的藥物，而APCI源則適合極性較弱的氣體狀態(tài)不容易裂解的藥物。當(dāng)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)極性相對(duì)較大時(shí)，往往優(yōu)先選用ESI源；但藥物極性較小時(shí)，APCI源則因?yàn)闇y(cè)定時(shí)儀器響應(yīng)穩(wěn)定而更加有優(yōu)勢(shì)[7-8]。

1.2 質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)

質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)包括三種類型：質(zhì)譜硬件狀態(tài)、質(zhì)譜系統(tǒng)參數(shù)和藥物自身質(zhì)譜參數(shù)[7-8，11-14]。

質(zhì)譜硬件狀態(tài)主要是指噴霧針相對(duì)位置，在調(diào)試時(shí)，可通過噴霧針的微調(diào)旋鈕來對(duì)噴霧進(jìn)行調(diào)節(jié)，以獲得最佳的質(zhì)譜響應(yīng)值。噴霧針相對(duì)位置往往和流動(dòng)相流速和組成相關(guān)。

質(zhì)譜系統(tǒng)參數(shù)包括噴霧電壓、氣化溫度、霧化器壓力和溫度、反吹氣壓力和溫度等。這些參數(shù)的調(diào)試要結(jié)合試驗(yàn)的色譜方法來進(jìn)行，例如流動(dòng)相流速大或水相占比高，氣化溫度、霧化器壓力和溫度等參數(shù)就要相應(yīng)的提高，以保證流動(dòng)相被完全噴散并霧化，從而增大儀器響應(yīng)值。而反吹氣則是在儀器背景噪音較高，樣品基質(zhì)相對(duì)較臟時(shí)使用，可降低背景噪音，從而提高相對(duì)靈敏度。在進(jìn)行多個(gè)藥物同時(shí)測(cè)定時(shí)，以上參數(shù)應(yīng)以濃度最低或檢測(cè)靈敏度最低藥物為基準(zhǔn)。

藥物自身質(zhì)譜參數(shù)主要包括去簇電壓和碰撞能量。這兩個(gè)參數(shù)僅與藥物本身結(jié)構(gòu)和碎片離子結(jié)構(gòu)有關(guān)，故在優(yōu)化完之后，質(zhì)譜色譜系統(tǒng)方法再改變對(duì)此兩個(gè)參數(shù)影響都不大。此外，由于大多數(shù)串聯(lián)質(zhì)譜都不是高分辨質(zhì)譜，故而可通過調(diào)整分子量后面小數(shù)點(diǎn)來選擇母離子和子離子，從而優(yōu)化質(zhì)譜響應(yīng)值[10]。

1.3 加和離子和裂解離子

大部分藥物在質(zhì)譜中都能得到準(zhǔn)分子離子峰，即[M+H]+峰。但也有不少藥物得不到[M+H]+峰或者[M+H]+峰相對(duì)于其他加和峰響應(yīng)值小很多，這時(shí)就需要選擇加和離子峰作為其母離子來進(jìn)行檢測(cè)，以提高響應(yīng)值。常見的加和峰可分為正電模式，如[M+NH4]+，[M+Na]+，[M+Li]+，[M+K]+和負(fù)電模式，如[M+Cl]？，[M+HCOO]？，[M+CH3COO]？。有文獻(xiàn)報(bào)道選擇[M+Li]+對(duì)紫杉醇類藥物進(jìn)行測(cè)定，相對(duì)于[M+H]+峰有更高的質(zhì)譜響應(yīng)值，相對(duì)于[M+Na]+峰有更穩(wěn)定的質(zhì)譜響應(yīng)值。這是由于Li+是定量加入流動(dòng)相中的，相對(duì)于[M+Na]+來說含量更穩(wěn)定，而紫杉醇類藥物加和峰往往比[M+H]+峰響應(yīng)值要大[7，11]。

有些藥物在質(zhì)譜中容易得到其裂解離子峰，而得不到母離子峰或母離子較小，比如魚腥草素和雄酮?？蛇x擇其確定的脫水裂解峰作為母離子進(jìn)行定量測(cè)定[9，12]。

2 色譜方法

待測(cè)藥物色譜方法的選擇通常要根據(jù)藥物自身的極性、pKa、結(jié)構(gòu)中的基團(tuán)等來進(jìn)行優(yōu)化。從藥物自身的結(jié)構(gòu)出發(fā)，我們?cè)谏V方法建立上，主要考察流動(dòng)相中有機(jī)相-水相比例、pH、緩沖鹽種類和濃度、其他添加物和流動(dòng)相流速及梯度[7-8，15-17]。

2.1 有機(jī)相-水相比例

在用LC-MS/MS法進(jìn)行血漿藥物濃度測(cè)試，通常會(huì)讓藥物在3倍死時(shí)間之后出峰，避開之前血漿中大極性物質(zhì)基質(zhì)干擾[13-14]。待測(cè)藥物出峰之后用流速梯度或組分梯度進(jìn)行沖洗，減少藥物出峰之后的基質(zhì)干擾。而調(diào)節(jié)藥物在色譜柱上面的保留，就是靠調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例來進(jìn)行的，藥物合適的保留能盡可能減少前后基質(zhì)的干擾，這樣才能保證相對(duì)高且穩(wěn)定的響應(yīng)值。

不同的流動(dòng)相組成也能影響藥物在質(zhì)譜上的響應(yīng)值，通常情況下響應(yīng)值排行：高比例有機(jī)相中>純有機(jī)相中>高比例水相中>純水相中。此外，有的藥物在一種有機(jī)相中響應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于另一種有機(jī)相。通常情況下，正電藥物在甲醇有機(jī)相體系中響應(yīng)大于在乙腈體系中，負(fù)電藥物在乙腈體系中響應(yīng)大于甲醇體系[7，15-16]。

在選擇流動(dòng)相比例時(shí)，要同時(shí)考慮質(zhì)譜響應(yīng)和色譜分離兩方法因素再做決定。

2.2 流動(dòng)相pH

不同藥物的pKa不同，故在不同pH流動(dòng)相中，其分子態(tài)-離子態(tài)比率不同，最終將影響藥物的離子化狀態(tài)，從而對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)值有影響。通常正電藥物在酸性流動(dòng)相下響應(yīng)值較高，而負(fù)電藥物在堿性流動(dòng)相下響應(yīng)值較高。然而流動(dòng)相pH也會(huì)對(duì)藥物的色譜行為產(chǎn)生影響，例如正電藥物雖然在酸性流動(dòng)相下響應(yīng)值較高，但也容易形成拖尾峰或弱保留[7，15-16]。

此外，還應(yīng)注意非揮發(fā)型酸堿添加劑會(huì)對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)造成抑制，不同類型色譜柱對(duì)流動(dòng)相pH的耐受范圍也不同。因此，在選擇流動(dòng)相pH時(shí)應(yīng)同時(shí)考慮多方面因素。

2.3 鹽離子

流動(dòng)相中適量的鹽離子有助于藥物的電離，相對(duì)于不含鹽離子的流動(dòng)相，藥物的質(zhì)譜響應(yīng)值會(huì)更大。此外，流動(dòng)相中鹽離子的存在，可以使流動(dòng)相體系形成一個(gè)緩沖鹽體系，使其在加入酸或堿添加劑時(shí)，整個(gè)體系的pH相對(duì)穩(wěn)定。提高并且穩(wěn)定了藥物的離子化效率，從而提高并且穩(wěn)定了質(zhì)譜的響應(yīng)值[15-16]。但鹽離子的濃度并非越高越好，因?yàn)闈舛冗^高會(huì)抑制質(zhì)譜響應(yīng)值，也會(huì)在有機(jī)相比例增加時(shí)析出鹽離子堵塞色譜流路。

和酸堿添加劑一樣，添加的鹽離子必須是揮發(fā)型的，因?yàn)榉菗]發(fā)性鹽離子（如磷酸鹽）會(huì)對(duì)質(zhì)譜造成損害。

2.4 流速

為減少待測(cè)藥物出峰前后的干擾和節(jié)省分析時(shí)間，流速梯度很常用。不同流速進(jìn)入質(zhì)譜對(duì)響應(yīng)有明顯影響，ESI源通常接受0.3～0.6 ml/min流速，APCI源通常接受0.5～0.8 ml/min流速。因此，應(yīng)把待測(cè)藥物出峰時(shí)間段的流速調(diào)至合適流速，而前后沖洗段可用大流速?zèng)_洗，并切出離子源流路。此外，在優(yōu)化質(zhì)譜響應(yīng)時(shí)，應(yīng)在確定色譜方法后，再對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，因?yàn)榇祟悈?shù)與流速和比例有較大相關(guān)性[8，15-17]。

3 樣品制備方法

目前的血漿樣品處理方法主要有直接蛋白沉淀法、蛋白沉淀上清吹干、液液萃取法和固相萃取法。每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但目的都在于去除血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)和濃縮樣品等。表1中分別列舉了三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)[18-19]。

對(duì)于提高藥物檢測(cè)靈敏度來說，濃縮樣品和減少?gòu)?fù)雜過程中的污染問題，是兩個(gè)必須兼顧考慮的問題。此外，最終進(jìn)入儀器分析的樣品的溶劑組成和pH也是影響質(zhì)譜靈敏度的重要因素，具體要結(jié)合本文的質(zhì)譜方法和色譜方法中的各方面因素綜合考慮；如果待測(cè)物質(zhì)譜響應(yīng)非常小，也可通過衍生化法來引入響應(yīng)基團(tuán)，增加待測(cè)物響應(yīng)[20-21]。

4 注意事項(xiàng)

因待測(cè)藥物濃度很低，故防止樣品污染問題很重要，必須從整個(gè)試驗(yàn)的全過程來防止樣品污染。例如流動(dòng)相配制過程必須遠(yuǎn)離待測(cè)藥物，低濃度樣品和高濃度樣品全程隔開，樣品檢測(cè)過程Carryover效應(yīng)必須完全達(dá)標(biāo)，嘗試不同類型的洗針方式和洗針溶液等。這個(gè)方面對(duì)測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確性有直接影響，但降低本底污染也能相對(duì)提高檢測(cè)靈敏度。

5 結(jié)語

隨著新藥研發(fā)的不斷推進(jìn)，低濃度藥物（如某些藥物活性代謝物毒性更小活性不變或更大）和低檢測(cè)靈敏度藥物（部分類固醇類藥物）不斷出現(xiàn)。而血漿藥物濃度的監(jiān)測(cè)，對(duì)于藥物安全性有重大意義。因此，提高藥物檢測(cè)靈敏度具有重要意義。具體來說，需要從質(zhì)譜方法、色譜方法和樣品預(yù)處理方法三個(gè)方面協(xié)調(diào)改進(jìn)，以增加檢測(cè)靈敏度，為檢測(cè)靈敏度較低的血漿中藥物檢測(cè)提供幫助，從而為該類藥物的研發(fā)助力。

致謝：對(duì)中科院上海藥物研究所藥物代謝研究中心的全體領(lǐng)導(dǎo)、同事和學(xué)生對(duì)此綜述的完稿所提供的幫助表示衷心感謝

參考文獻(xiàn)

[1] Van den Ouweland JM， Kema IP. The role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2012， 883-884： 18-32.

[2] Lappin G， Garner RC. The use of accelerator mass spectrometry to obtain early human ADME/PK data[J]. J Expert Opin Drug Metab Toxicol， 2005， 1（1）： 23-31.

[3] Higashi T， Shimada K， Toyooka T. Advances in determination of vitamin D related compounds in biological samples using liquid chromatography-mass spectrometry： a review[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2010， 878（20）： 1654-1661.

[4] Van den Broek I， Sparidans RW， Schellens JH， et al. Quantitative bioanalysis of peptides by liquid chromatography coupled to （tandem） mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2008， 872（1-2）： 1-22.

[5] Mesaros C， Lee SH， Blair IA. Targeted quantitative analysis of eicosanoid lipids in biological samples using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2009， 877（26）： 2736-2745.

[6] Haleem JI， Josip B. Electrophoresis and liquid chromatography/tandem mass spectrometry in disease biomarker discovery[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2009， 877（13）： 1222-1228.

[7] Kostiainen R， Kauppila TJ. Effect of eluent on the ionization process in liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A， 2009， 1216（4）： 685-699.

[8] Aubry AF. LC-MS/MS bioanalytical challenge： ultra-high sensitivity assays[J]. J Bioanalysis， 2011， 3（16）： 1819-1825.

[9] Deng ZP， Zhong DF， Meng J， et al. Covalent protein binding and tissue distribution of houttuynin in rats after intravenous administration of sodium houttuyfonate[J]. J Acta Pharmacol Sin， 2012， 33（4）： 568-576.

[10] Zhou JL， Qi LW， Li P. Herbal medicine analysis by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry[J]. J Chromatogr A， 2009， 1216（44）： 7582-7594.

[11] 范亞新， 陳笑艷， 馬智宇， 等. 液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法以鋰加合離子定量分析大鼠血漿中紫杉醇和羥基代謝物[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)， 2013， 34（3）： 137-144.

[12] 蘆春梅， 王風(fēng)紅， 胡婷婷， 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健品口服液中10種性激素的研究[J]. 化學(xué)試劑， 2015， 37（3）： 243-246.

[13] C？té C， Bergeron A， Mess JN， et al. Matrix effect elimination during LC-MS/MS bioanalystical method development[J]. J Bioanalysis， 2009， 1（7）： 1243-1257.

[14] 劉曉云， 陳笑艷， 鐘大放. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜生物分析方法的基質(zhì)效應(yīng)和對(duì)策[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)， 2017， 38（4）： 388-389.

[15] Mess JN， Lahaie M， Furtado M， et al. Effect of high pH mobile phase on the sensitivity of multiple drugs by LC positive electrospray ionization MS/MS[J]. J Bioanalysis， 2009， 1（8）： 1419-1430.

[16] Wang J， Aubry A， Bolgar MS， et al. Effect of mobile phase pH， aqueous-organic ratio， and buffer concentration on electrospray ionization tandem mass spectrometric fragmentation patterns： implications in liquid chromatography/tandem mass spectrometric bioanalysis[J]. J Rapid Commun Mass Spectrom， 2010， 24（22）： 3221-3229.

[17] Torres-Lapasió JR， García-Alvarez-Coque MC. Levels in the interpretive optimisation of selectivity in high-performance liquid chromatography： a magical mystery tour[J]. J Chromatogr A， 2006， 1120（1-2）： 308-321.

[18] 李建旺， 王宛， 黃韋， 等. 藥代研究中MAS法、蛋白沉淀法和固相萃取法等前處理方法的比較[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)， 2009， 30（增刊）： 128-130.

[19] Michopoulos F， Edge AM， Hui YT， et al. Extraction methods for the removal of phospholipids and other endogenous material from a biological fluid[J]. J Bioanalysis， 2011， 3（24）： 2747-2755.

[20] Deng P， Zhan Y， Chen X， et al . Derivatization methods for quantitative bioanalysis by LC-MS/MS[J]. J Bioanalysis， 2012，4（1）： 49-69.

[21] Iwasaki Y， Nakano Y， Mochizuki K， et al. A new strategy for ionization enhancement by derivatization for mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2011， 879（17-18）： 1159-1165.