何悅洋，李江峰，聶亞莉，張 弛，馬亞楠，顧思夢，洪春麗，楊衛(wèi)紅，張莉蓉

1) 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450001 2) 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實驗中心 鄭州 450001 3) 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系 鄭州 450001 4) 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系 鄭州 450001

CYP3A是一種重要的CYP450酶系，在人肝組織內(nèi)含量豐富，主要包括CYP3A4和CYP3A5，可代謝許多臨床藥物。已知編碼CYP3A基因的遺傳變異是引起臨床上CYP3A代謝藥物在不同個體間藥效差異和藥物安全性的重要因素[1-2]。體內(nèi)外研究[3-9]表明，CYP3A4基因的遺傳變異CYP3A4*22、CYP3A4*1G(rs2242480)可通過影響CYP3A4的表達(dá)與活性從而影響藥物的療效。rs4646440位于rs2242480下游，兩者均位于CYP3A4內(nèi)含子10中[10]。有文獻(xiàn)[11]報道rs4646440與患者美沙酮維持治療的嚴(yán)重副作用和戒斷癥狀有關(guān)。已知rs2242480與CYP3A5 rs776746(CYP3A5*3)存在較強(qiáng)的連鎖不平衡關(guān)系。本研究的主要目的是探討rs4646440與rs2242480、rs776746之間的連鎖關(guān)系及其與CYP3A4表達(dá)和活性的關(guān)系，以期闡明不同個體間CYP3A4活性差異的機(jī)制，為臨床個體化用藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料54例成人正常肝組織標(biāo)本來源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科手術(shù)患者，均為病灶周圍的正常肝組織，研究方案得到該院倫理委員會的批準(zhǔn)，患者已簽署知情同意書。主要試劑與儀器：基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司)，PCR試劑盒(TaKaRa公司)，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 熒光定量試劑盒(大連寶生物技術(shù)有限公司)，引物合成由Life Technologies(上海)貿(mào)易有限公司完成，PCR擴(kuò)增儀(德國Biometrd公司)，水平電泳槽(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Syngene公司)，高效液相色譜(HPLC)儀(美國Waters公司)，7500 Fast實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)(美國ABI公司)，咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖(北京匯智泰康醫(yī)藥科技公司)。

1.2基因分型用DNA提取試劑盒從肝組織標(biāo)本中提取DNA。PCR所用引物由作者設(shè)計或來自參考文獻(xiàn)[10,12],引物序列及相關(guān)信息見表1。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步驗證后送Life Technologies(上海)貿(mào)易有限公司測序，并將測序結(jié)果與NCBI預(yù)期序列進(jìn)行比對。

表1rs4646440、rs2242480、rs776746PCR引物

引物序列 (5’-3’)產(chǎn)物大小/bprs4646440上游:GTCCCCTTAGCTGTATCCAC下游:CCTGGTTCCTAGCTTGGCTT433rs2242480上游:CACCCTGATGTCCAGCAGAAACT下游:AATAGAAAGCAGATGAACCAGAGCC287rs776746上游:CATGACTTAGTAGACAGATGAC下游:GGTCCAAACAGGGAAGAAATA293

1.3CYP3A4mRNA表達(dá)的測定提取22例肝組織中的總 RNA后反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。CYP3A4及內(nèi)參基因GAPDH引物均來自文獻(xiàn)[11,13]，見表2。Real-time PCR 反應(yīng)體系：SYBR mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，模板cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共 40 個循環(huán)。采用 SYBR 染料法在實時熒光定量 PCR 儀上檢測 mRNA 的表達(dá)，以2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達(dá)水平。

表2CYP3A4及GAPDHPCR引物

引物序列 (5’-3’)產(chǎn)物大小/bpCYP3A4上游:GCAGGAAAGCTCCATGCACATAG下游:GAGAAGCCAGGTTTCCATGG132GAPDH上游:GTCAGTGGTGGACCTGACCT下游:TGAGCTTGACAAAGTGGTCG212

1.4HPLC法測定CYP3A4的活性取22例肝組織樣本，參照文獻(xiàn)[14]，用差速離心法制備肝微粒體，BCA法測定微粒體蛋白含量。以咪達(dá)唑侖作為底物，用HPLC法檢測肝微粒體酶活性，CYP3A4活性用1-OH咪達(dá)唑侖生成速度(V)表示。用回歸分析及Eadie-Hofstee 求出CYP3A4活性的參數(shù)Vmax。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。用χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；用Haploview軟件進(jìn)行位點連鎖分析，連鎖不平衡的程度用D＇ 和r2表示。用兩獨立樣本t檢驗比較rs4646440 CC組與CT+TT組CYP3A4 mRNA表達(dá)水平及CYP3A4活性的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1基因多態(tài)性分析rs4646440、rs2242480和rs776746位點的基因型頻率分布見表3。3個位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，說明群體基因遺傳平衡。等位基因rs4646440 T、rs2242480 A、rs776746 G的頻率分別為16.7%、18.5%和 70.4%。測序結(jié)果見圖1。

表3不同位點基因型頻率的分布

位點及基因型病例數(shù)(%)χ2Prs4646440 CC37(68.5) CT16(29.6)0.2400.624 TT1(1.9)rs2242480 GG36(66.7) GA16(29.6)0.0180.894 AA2(3.7)rs776746 AA6(11.1) AG20(37.0)0.6750.411 GG28(51.9)

上：rs4646440；中：rs2242480；下：rs776746圖1 3種基因分型結(jié)果

2.2不同位點之間的連鎖關(guān)系分析結(jié)果(圖2)顯示3者之間具有強(qiáng)連鎖不平衡關(guān)系，rs4646440與rs2242480的連鎖關(guān)系比與rs776746的連鎖關(guān)系強(qiáng)，而rs4646440與 rs776746的連鎖關(guān)系比rs2242480與rs776746的連鎖關(guān)系弱。

2.3不同rs4646440基因型組間CYP3A4mRNA表達(dá)水平及CYP3A4活性的比較CC 組與CT+TT組CYP3A4 mRNA表達(dá)水平及CYP3A4活性相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

左：r2值；右：D′值

組別nCYP3A4 mRNAVmax/[μmol·(min·g)-1]CC組111.45±1.060.33±0.11CT+TT組111.21±0.960.35±0.14t0.1131.504P0.5980.703

3 討論

CYP3A4是人肝臟中最重要的藥物代謝酶，能代謝他汀類降血脂藥、環(huán)孢素等抗移植排斥藥物、抗腫瘤藥物、麻醉藥物等50%以上常用的臨床處方藥物，然而這些藥物的療效與副作用在不同個體間存在著明顯的差異。到目前為止，不同個體間CYP3A4表達(dá)差異的機(jī)制尚不完全清楚。近年來內(nèi)含子基因多態(tài)性調(diào)控基因愈來愈受到重視[15-16]。

本研究分析了CYP3A4 rs4646440與rs2242480、CYP3A5 rs776746之間的連鎖關(guān)系以及其與CYP3A4表達(dá)和活性的關(guān)系，結(jié)果表明rs4646440與rs2242480位點一樣，具有較高的等位基因頻率：rs4646440 T等位基因頻率為16.7%；并且發(fā)現(xiàn)3個位點之間具有強(qiáng)連鎖不平衡關(guān)系，其中rs4646440與rs2242480的連鎖關(guān)系強(qiáng)于與rs776746的連鎖關(guān)系，這可能與前兩個SNP在同一基因(CYP3A4)、同一內(nèi)含子中，而后者位于CYP3A5 基因有關(guān)；rs4646440與rs2242480的連鎖關(guān)系支持了Wang等[17]的觀點。然而，rs4646440與rs776746的連鎖關(guān)系弱于rs2242480與rs776746，說明前兩者連鎖在CYP3A表達(dá)中起的作用可能小于后兩者。

本課題組首次在肝組織水平研究了rs4646440基因多態(tài)性與CYP3A4 mRNA表達(dá)及活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該SNP與CYP3A4 mRNA表達(dá)及活性不相關(guān)，說明rs4646440可能與藥物的療效及副作用無關(guān)，此結(jié)論支持了rs4646440多態(tài)性不影響中國癲癇患者用卡馬西平單藥治療時卡馬西平代謝的結(jié)論[17]。

總之，本研究結(jié)果表明CYP3A4 rs4646440、rs2242480和CYP3A5 rs776746之間存在較強(qiáng)的連鎖不平衡關(guān)系，同時還發(fā)現(xiàn)rs4646440基因多態(tài)性與CYP3A4 mRNA表達(dá)水平及活性無關(guān)。此結(jié)果豐富了CYP3A4基因內(nèi)含子SNP與酶活性關(guān)系之間的研究內(nèi)容，為將來其他CYP3A4內(nèi)含子SNP的研究提供了理論基礎(chǔ)。