王 坤，吳 瓊，耿 瑞，王夢(mèng)玲，馬佑芬，駱 衡,*，晏 晨

1貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550002；2畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，畢節(jié) 551700； 3遵義醫(yī)學(xué)院，遵義 563006；4德江縣民族中醫(yī)院，德江 565200；5安順市人民醫(yī)院，安順 561000

煙管頭草為菊科(Asteraceae)天名精屬一或兩年生草本，高40～90 cm。莖直立，多分枝，全株密被白毛，單葉互生，全緣或波狀齒，根粗葉大而狹長(zhǎng)，柄短，下部葉長(zhǎng)橢圓形，上部較小，廣被針形。頭狀花序單生在小枝頂端，初直立，開(kāi)花時(shí)多下垂；總苞片淡綠色，外層總苞片葉狀，內(nèi)層干膜質(zhì) ；花黃色片，全為管狀花。瘦果線形有條紋[1]。煙管頭草具有清熱解毒、消腫止痛的功效，主治感冒發(fā)熱、高熱驚風(fēng)、咽喉腫痛、痄腮、牙痛、尿路感染、淋巴結(jié)核、瘡瘍癤腫、乳腺炎等，貴州苗族地區(qū)將其作為民族藥野煙葉使用[2]。煙管頭草的化學(xué)成分主要有倍半萜、黃酮、苯酚、甾體、木脂素、三萜、香豆素等[3]。研究表明導(dǎo)致前列腺增生主要因素有生長(zhǎng)因子通路與激素變化，治療前列腺增生目前有藥物治療與手術(shù)治療，并且近年來(lái)，藥物治療成為學(xué)者治療前列腺增生研究熱點(diǎn)，但煙管頭草治療前列腺增生的研究及活性成分鮮有報(bào)道，并且本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，煙管頭草粗提物對(duì)前列腺增生細(xì)胞(BPH1)增殖有抑制作用，有凋亡現(xiàn)象。因此，本研究就煙管頭草粗提物對(duì)前列腺增生細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡進(jìn)行初步探究，確定其是否可誘導(dǎo)前列腺增生細(xì)胞(BPH1)凋亡，并從調(diào)控前列腺增生細(xì)胞凋亡Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)的角度探討其可能的抗前列腺增殖分子機(jī)制[4]，以期望為進(jìn)一步研究煙管頭草的抗前列腺增殖活性成分及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

DEME高糖培養(yǎng)基(HyClone，美國(guó)，AC10254368)；0.25% Trypsin胰酶(HyClone，美國(guó)，T1320)；胎牛血清(杭州四季青公司，中國(guó)，20171221)；四甲基偶氮唑藍(lán)(3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl-tetrazolium bromide；MTT) (Sigma 公司，美國(guó)，G1724034)；二甲基亞砜(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，中國(guó)，D8370)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，中國(guó)，20171222)；Gold view I型核酸染料(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，中國(guó)，G8140)；Wnt通路基因(β-catenin、C-myc、SFRPS2、CyclinD1、ddk1、fzd2 、GAPDH)引物(上海生工科技有限公司，中國(guó))；瓊脂糖(BIOWEST公司，中國(guó)，111860)；DNA Ladder抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，中國(guó)，C0007)；Hoechest染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，中國(guó)，C0003)；Matrigel? Matrix(Corning公司，美國(guó)，356234)；50×TAE(康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)，CW06635)；Super DNA Marker(康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)，CW25835)。其它相關(guān)試劑為分析純級(jí)別的國(guó)產(chǎn)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光倒置顯微鏡(卡爾·蔡司股份公司，德國(guó))；倒置顯微鏡(ECLIPSE TS100-F)(日本尼康有限公司產(chǎn)品，日本，ECLIPSE TS100-F)；NANODROP 2000(賽默飛世爾科技公司，中國(guó))；超凈臺(tái)(賽默飛世爾科技公司，中國(guó)，1384)；培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司，中國(guó)3111)；高速離心機(jī)(BECKMAN COULTER公司，美國(guó))；凝膠成像儀(Gene Company Limited，中國(guó)香港)；電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY300HE)；PCR儀(Applied Biosystems(ABI)，美國(guó)，9902)。

1.3 煙管頭草粗提物的制備

樣品采自貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為菊科(Asteraceae)天名精屬(CarpesiumL.)植物煙管頭草(Carpesiumcernuum)。黔產(chǎn)藥用煙管頭草的提?。呵a(chǎn)藥用煙管頭草(Carpesiumcernuum)的全草干重20.0 kg，用95% 的工業(yè)乙醇將粉碎后的藥材加熱回流提取，每次3 h，共提取3次，將提取液合并，回收CH3CH2OH。然后加水使?jié)饪s液呈懸浮狀態(tài)，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取液與水層，乙酸乙酯萃取物616 g，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

所用的細(xì)胞株由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室腫瘤藥理課題組保存。將保存的人前列腺增生BPH1細(xì)胞于37 ℃ 水浴中迅速解凍，離心收集細(xì)胞后，用含10% 胎牛血清及1% 青霉素、1% 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞80% 匯合時(shí)進(jìn)行傳代及保種，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入190 μL細(xì)胞液，分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置空白組與對(duì)照組，于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，吸干培養(yǎng)液，加入用新鮮培養(yǎng)液配好的各濃度的提取物，對(duì)照組為同比例稀釋的DMSO，空白組加入同體積培養(yǎng)液，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，3 200 rpm離心15 min，加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，1 500 rpm離心8 min，吸出培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO溶解結(jié)晶物，搖床低速震蕩10 min，采用多功能酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)其OD值，并計(jì)算其細(xì)胞增殖抑制率[5,6]。

2.3 Tanswell檢測(cè)

4 ℃解凍Matrigel膠，使其成為液體；用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基將Matrigel膠按照7∶1比例稀釋?zhuān)幻靠准尤?0 μL稀釋的Matrigel于Tanswell小室濾膜上層。37 ℃、5% CO2孵育30 min。將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞離心收集，用培養(yǎng)基將收集的細(xì)胞稀釋成1×104個(gè)/mL，將細(xì)胞與不同濃度提取物混勻接種于上層無(wú)血清的培養(yǎng)液中，下層為含血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h；取出小室，用生理鹽水沖洗3次，用棉簽小心擦去小室Matrigel膠，加入無(wú)水甲醇浸泡10min；室溫靜置15 min，每孔加入300 μL 0.1%的結(jié)晶紫染色30 min，生理鹽水沖洗3次，晾干，取染色的小室顯微觀察拍照，分別取上下左右及中間五個(gè)視野計(jì)數(shù)，多次重復(fù)求平均值，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[7]。

2.4 HE染色

取潔凈的蓋玻片在75% 乙醇中浸泡5 min，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用0.9%生理鹽水沖洗三次，再用培養(yǎng)液沖洗一次，將洗凈滅菌的蓋玻片平置于六孔板內(nèi)。將對(duì)數(shù)期收集并稀釋為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液2 mL接種于上述的六孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)待其貼壁后，加入不同濃度的提取物繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，離心后吸去大部分液體保留50 μL液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上盡量使細(xì)胞分布均勻；加入0.5 mL固定液，固定10 min；去固定液，用0.9% 生理鹽水沖洗兩次，每次3 min；加入0.5 mL Hoechst 33258染色液振動(dòng)染色5 min；去染色液，用0.9% 生理鹽水洗兩次，每次3 min，吸盡液體，加入一滴抗熒光淬火封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，熒光顯微鏡檢測(cè)其細(xì)胞核的變化[8]。

2.5 DNA Ladder檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL；將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后，加入不同濃度的提取物，DMSO處理為空白對(duì)照，培養(yǎng)48 h后用胰酶消化，用生理鹽水沖洗1次，1 500 g離心2 min，棄上清，收集細(xì)胞；用DNA Ladder抽提試劑盒抽提DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其DNA損傷程度[9]。

2.6 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞基因表達(dá)

收集不同濃度提取物處理48 h的細(xì)胞，按照文獻(xiàn)[10]報(bào)道方法去取總RNA，1% 的瓊脂糖電泳液檢測(cè)RNA的完整性。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，按照文獻(xiàn)[10]，利用1% 的瓊脂糖電泳液檢測(cè)不同基因(引物序列見(jiàn)表1)的PCR產(chǎn)物，凝膠成像分析差異表達(dá)結(jié)果[11]。

表1 本研究中檢測(cè)的相關(guān)基因的引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0 軟件(IBM SPSS Statistics 22.0，USA)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有結(jié)果以均值表示。采用F-檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，顯著差異表示為(*P< 0.05；**P< 0.01)。

3 結(jié)果

3.1 煙管頭草粗提物對(duì)前列腺增生(BPH1)細(xì)胞增殖活性的影響

倒置顯微(×100)觀察不同濃度處理對(duì)BPH1細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)的影響(圖1 A)，正常(Control)細(xì)組胞貼壁生長(zhǎng)，呈帶狀或條狀，胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞融合成群落；而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量減少，間隙增大，體積減小，染色質(zhì)凝聚、有凋亡小體出現(xiàn)等特點(diǎn)，并且作用效果成濃度依賴性，即濃度越大，藥物度對(duì)BPH1細(xì)胞作用越明顯。MTT檢測(cè)煙管頭草粗提物對(duì)BPH1細(xì)胞增殖的影響(圖1 B)實(shí)驗(yàn)表明，粗提物對(duì)細(xì)胞作用呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，也即作用效果與濃度和時(shí)間成正相關(guān)。經(jīng)IBM SPSS Statistics 22.0軟件分析，作出IC50值圖(圖1 C)，實(shí)驗(yàn)組24 h、48 h、72 h的IC50值分別為72.76 μg/L、30.42 μg/L、25.69 μg/L，表明實(shí)驗(yàn)組IC50值與時(shí)間成負(fù)相關(guān)，即時(shí)間越長(zhǎng)，濃度越小，并且與24 h組比較，48 h與72 h差異性顯著(*P< 0.05)。因此，煙管頭草粗提物對(duì)前列腺增生細(xì)胞增殖活性有顯著影響。

圖1 煙管頭草粗提物對(duì)前列腺增生細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Effect of Carpesium cernuum crude extract on proliferative activity of benign prostatic hyperplasia注：與空白對(duì)照組比較，* P < 0.05，** P < 0.01。A.倒置顯微鏡觀察提取物對(duì)BPH1細(xì)胞形態(tài)變化的影響；B.煙管頭草粗提物對(duì)前列腺增生細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;C.粗提物對(duì)BPH1細(xì)胞作用的IC50值* P<0.05,** P<0.01。Note:Compared with control group,* P<0.05,**P<0.01.A.Inverted microscope to observe the effect of >extracts on the morphological changes of BPH1 cells;B.Effect of Carpesium cernuum crude extract on the growth of benign prostatic hyperplasia cells;C.IC50 value of crude extracts on BPH1 cells.

3.2 Transwell實(shí)驗(yàn)

體外侵襲能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：倒置顯微鏡(×100)觀察(圖2A)表明隨著藥物濃度的增大，視野數(shù)目逐漸減少，呈現(xiàn)濃度依賴性。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(圖2B)表明，對(duì)照組(0 μg/L)，實(shí)驗(yàn)組(20、40、80 μg/L)其透過(guò)濾膜平均數(shù)分別為123、34、18、10個(gè)，與對(duì)照組(0 μg/L)比較，實(shí)驗(yàn)組20、40、80 μg/L差異性顯著(P<0.01)，進(jìn)一步驗(yàn)證了藥物對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響呈現(xiàn)濃度依賴性。因此，侵襲實(shí)驗(yàn)表明：藥物能顯著降低細(xì)胞的侵襲潛能。

3.3 粗提物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究

細(xì)胞凋亡染色實(shí)驗(yàn)(圖3)表明正常細(xì)胞(Control)呈現(xiàn)淡藍(lán)色，偶爾有帶蒼白色；而加入藥物后的細(xì)胞大多呈現(xiàn)蒼白色，并且濃縮成圓形。染色質(zhì)斷裂是細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖(圖4)譜(DNA ladder)，本研究用兩種濃度處理 BPH1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組 DNA ladder 有明顯不同，藥物處理后細(xì)胞出現(xiàn)典型的 DNA ladder，說(shuō)明細(xì)胞已經(jīng)凋亡。因此，凋亡染色試驗(yàn)和DNA ladder實(shí)驗(yàn)表明：藥物能夠誘導(dǎo) BPH1細(xì)胞凋亡。

3.4 RT-PCR檢測(cè)

RT-PCR實(shí)驗(yàn)(圖5)結(jié)果表明：GAPDH基因在BPH1正常表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組與GAPDH相比，實(shí)驗(yàn)組SFRPS2 、C-myc、β-catenin基因組表達(dá)均高于內(nèi)參組，ddk1、fzd2、cyclinD1表達(dá)均低于內(nèi)參組。與control組相比，SFRPS2 、C-myc、β-catenin是隨著濃度的增大而增加；ddk1、fzd2表達(dá)是隨濃度的增大，表達(dá)能力增強(qiáng)，但顯著低于內(nèi)參組，cyclinD1組表達(dá)能力是隨著濃度的增大而降低。因此，粗提物誘導(dǎo)BPH1細(xì)胞凋亡是與Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)有關(guān)。

圖2 煙管頭草粗提物對(duì)前列腺增生細(xì)胞體外侵襲能力的影響Fig.2 Effect of crude extract of Carpesium cernuumon in vitro invasive ability of benign prostatic hyperplasia cells注：與空白對(duì)照組比較，** P < 0.01。A.顯微(×100)觀察圖；B.透過(guò)濾膜平均值。Note:Compare with control,** P < 0.01.A.microscopic (x100) observations;B.Average of filtration membranes.

圖3 HE染色檢測(cè)煙管頭草粗提物誘導(dǎo)前列腺增生細(xì)胞凋亡Fig.3 HE staining was used to detect the apoptosis of prostate hyperplasia cells induced by crude extractof Carpesium cernuumon 注：A.Control組；B.圖為20 μg/L粗提物處理。Note:A.Control group;B.20 μg/L crude extract treatment.

4 結(jié)論

前列腺增生癥即良性前列腺增生(Benign prostatic hyper-plasia，BPH) ，是中老年男性常見(jiàn)疾病。隨著老齡化人口日益增加，BPH 的發(fā)病率逐年上升，50 歲以上男性，約 90% 有不同程度的前列腺增生，已嚴(yán)重威脅中老年男性的健康。國(guó)際良性前列腺增生咨詢委員會(huì)定義 BPH 為存在良性前列腺長(zhǎng)大，或前列腺移行區(qū)長(zhǎng)大的客觀證據(jù)，有下尿路癥狀(LUTS) ，或下尿路癥狀加重及上尿路受損，存在膀胱出口梗阻[12]。主要臨床表現(xiàn):進(jìn)行性尿頻、尿線變細(xì)、排尿費(fèi)力、尿潴留等，重癥患者可導(dǎo)致腎積水、腎功能衰竭等病癥[12]。有研究表明，生長(zhǎng)因子通路是調(diào)控前列腺增生直接主要因素；雌雄激素紊亂，是前列腺增生源頭；凋亡紊亂，由生長(zhǎng)因子及激素變化誘導(dǎo)，也是前列腺增生的病理表現(xiàn)，而在前列腺增生發(fā)生發(fā)展中，激素內(nèi)分泌學(xué)說(shuō)和生長(zhǎng)因子學(xué)說(shuō)也具重要地位和作用[12]。有研究中藥及其活性成分可從多方面、多靶點(diǎn)治療 BPH，現(xiàn)有研究多為調(diào)節(jié)雌激素、雄激素，改善微循環(huán) 及增強(qiáng)免疫，并且也有研究證實(shí)、牽牛子、川芎、當(dāng)歸、白芥子、王不留行、水蔓青等可通過(guò)改善 BPH動(dòng)物模型的各種指標(biāo)[12]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì) BPH1研究取得較大進(jìn)展，現(xiàn)已證實(shí)藥物干預(yù)防治前列腺增生癥與多種因素密切相關(guān)。有學(xué)者擬通過(guò)虛擬篩選、分子水平篩選、細(xì)胞水平篩選和整體動(dòng)物篩選，進(jìn)行藥物的篩選[13]研究。煙管頭草常以全草入藥，其化學(xué)成分和藥理作用報(bào)道較多，含有倍半萜、黃酮、醇、酯、苯酚、甾體、木脂素、三萜、香豆素等，如天名精內(nèi)酯酮(Carab-rone)，天名精內(nèi)酯醇(Carabrol)與特勒內(nèi)酯(Telekin)[14]，鶴大葉土木香內(nèi)酯(Granilin)，11(13)-去氫腋生依瓦菊素[11(13)-dehydroivaxillin][15]等，藥理活性報(bào)道有清熱瀉火、涼血解毒、抗病毒抗菌殺蟲(chóng)[16-19]作用，但是在利用煙管頭草粗提物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗前列腺細(xì)胞作用方面的研究較少涉及。因此，本研究就其抗前列腺細(xì)胞增殖活性及其機(jī)制進(jìn)行初步探究。實(shí)驗(yàn)表明：煙管頭草粗提物對(duì)前列腺增生細(xì)胞(BPH1)的增殖抑制作用具有選擇性，可顯著抑制前列腺增生細(xì)胞(BPH1)的增殖，并且呈現(xiàn)顯著的時(shí)間和濃度依賴性；熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量與狀態(tài)顯著改變，且有凋亡小體出現(xiàn)；Transwell實(shí)驗(yàn)表明煙管頭草粗提物可降低BPH1細(xì)胞侵襲潛能；Heston染色實(shí)驗(yàn)及DNA ladder表明提取物可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明粗提物可在轉(zhuǎn)錄水平顯著調(diào)控Wnt信號(hào)通路中β-catenin、SFRPS2、cyclinD1、ddk1、fzd2、C-myc基因表達(dá)。煙管頭草作為民族藥，資源豐富，醫(yī)用前景大，而本研究為分離煙管頭草的抑制人前列腺增生(BPH1)活性成分及綜合利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖4 DNA Ladder檢測(cè)煙管頭草粗提物誘導(dǎo)前列腺增生細(xì)胞凋亡Fig.4 DNA Ladder detection of Carpesium cernuumon crude extract induces apoptosis of benign prostatic hyperplasia

圖5 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)煙管頭草粗提物對(duì)前列腺增生細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵基因表達(dá)的影響Fig.5 The effect of expression of key gene transcription level detection of Carpesium cernuumon extract on Wnt signaling pathway in the cells of the prostate hyperplasia