王亞欣，張志文，任怡琳，劉 敏，史勁松，許正宏，許泓瑜*

1江南大學藥學院；2江南大學生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室；3江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，無錫 214122；4青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程研究中心，拉薩 850000

2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病率日漸增加，胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗是其兩大發(fā)病機制[1]。過去認為胰島素抵抗在T2DM病理生理機制中占主要位置,現(xiàn)在越來越多地認識到胰島β細胞功能障在T2DM發(fā)生發(fā)展中起重要作用。胰島β細胞功能障礙是T2DM發(fā)生的必要條件,胰島β細胞凋亡是造成胰島素分泌能力絕對下降的重要因素[2]。

滇結香Edgeworthiagardneri(Wall.)Meissn，E.gardneri屬于瑞香科、結香屬植物，主要分布在我國西藏及云南地區(qū)。滇結香是我國特有的珍貴藥材，據(jù)《藏醫(yī)養(yǎng)身圖說》書中記載，滇結香花具有清肝明目等作用，民間泡水飲用對糖尿病、高血壓、高血脂等慢性疾病均具有預防和治療效果[3]，其主要成分包括雙香豆素類、黃酮類、多酚類等[4]。隨著人們對滇結香研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗菌[5]、抗氧化[6]、降血糖[7]、降血脂[8]等多種作用。

本實驗室前期在2型糖尿病動物模型上評價滇結香提取物，發(fā)現(xiàn)滇結香花水提取物具有良好的降糖活性，能增加胰島素分泌量，并對損傷胰島組織有一定的修復作用[9]。因此利用胰島損傷模型對滇結香花提取物中保護胰島的物質進行篩選并探究其降糖作用機制是非常必要的。本實驗從滇結香花中提取分離制備組分，通過胰島細胞損傷模型及化學誘導型T2DM小鼠模型對其體外、體內降糖活性和作用機制進行研究，為滇結香花保護胰島細胞治療T2DM提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

5周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體重16～20 g，30只。購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

1.2 細胞株

大鼠胰島β細胞RIN-m5F，購自國家實驗細胞資源共享服務平臺。

1.3 藥物與試劑

滇結香花由西藏月王公司提供，與保藏在中國科學院昆明植物研究所的滇結香標本一致，并經(jīng)分子鑒定確認；RPMI-1640 培養(yǎng)基和無糖RPMI-1640 培養(yǎng)基胎牛血清(GIBCO公司，美國)；噻唑藍(MTT)、胰酶(碧云天公司)；AKT、FOXO1、JNK抗體(CST公司，美國)；棕櫚酸(PA)、葡萄糖、DCFH-DA(Sigma公司，美國)；鏈脲佐菌素(STZ)(麥克林公司)；艾塞那肽注射液(Baxter Pharmaceutical Solutions LLC公司，美國)；其他試劑，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 主要儀器

Multiskan MK3型酶標儀(Thermo-Labsysytems公司，美國)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司，美國)；倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)；蛋白電泳儀、電轉儀(Bio-Rad公司美國)；冷凍離心機(Eppendorf公司，德國)；PCR擴增儀、熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)。

2 方法

2.1 滇結香花提取物的制備

取干燥滇結香花(500 g)粉碎后，按質量體積比1∶10正己烷提取，于60 ℃浸提6 h，過程中不斷攪拌。過濾得澄清濾液，濾渣再重復浸提兩次，合并濾液，旋轉蒸發(fā)去除正己烷后得到滇結香花正己烷提取物(EGH)。

2.2 劑量與分組

將3周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠分為空白對照組(NC)與造模組，NC組喂養(yǎng)普通飼料，造模組喂養(yǎng)60%高脂飼料4周后，連續(xù)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(50 mg/kg/day)5天，注射結束后監(jiān)測FBG 2周，待血糖穩(wěn)定升高且FBG ≥ 11.1 mmol/L時造模成功，然后隨機分成模型組、陽性對照組以及低中高EGH干預組?？瞻讓φ战M(NC)：灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；模型組(DM)：灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；陽性對照組(EX)：腹腔注射艾塞那肽4μg/kg/day；EGH低劑量組(L-40 mg/kg/day)；EGH中劑量組(M-80 mg/kg/day)；EGH高劑量組(H-160 mg/kg/day)。

2.3 空腹血糖(FBG)

每周定時檢測小鼠FBG。小鼠測量FBG前一晚8點開始禁食12 h，自由飲水，第二天早8點剪尾采血測量FBG。

2.4 全血中糖化血紅蛋白(HbAlc)的檢測

采用南京建成全血中糖化血紅蛋白測定試劑盒檢測HbAlc，遵照試劑盒說明書方法測定。

2.5 空腹血清胰島素

采用賽默飛小鼠胰島素酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試劑盒檢測胰島素水平。遵照試劑盒說明書方法進行實驗，并用酶標儀測量結果，計算胰島素濃度。

2.6 細胞培養(yǎng)及胰島損傷細胞模型建立

在37 ℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，采用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的1640培養(yǎng)基(含有10 mmol/L萄糖，不含胰島素)培養(yǎng)RIN-m5F細胞，待細胞匯合度達到70%～80%時采用胰酶消化，按1∶3比例傳代，每2～3天傳代一次。

取對數(shù)生長期的RIN-m5F細胞，以2×104個細胞/孔的密度接種在96孔板中。根據(jù)安麗萍等[10]和藺憶[11]等方法加以改良，采用0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基刺激RIN-m5F細胞6 h作為誘導胰島β細胞損傷的條件。

2.7 MTT法測定細胞存活率

將RIN-m5F細胞以2×104個細胞/孔的密度接種在96孔板中，加入刺激藥物孵育，一定時間后進行MTT測定。孵育結束后,棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細胞后，將細胞與MTT(0.5 mg/mL)一起孵育4 h，棄去培養(yǎng)基并加入DMSO(150 μL)，避光震蕩10 min，于570 nm波長處測定吸光度(OD，重復3次)。

2.8 DCFH-DA熒光探針法檢測細胞內活性氧(ROS)水平

將RIN-m5F細胞以2×104個細胞/孔的密度接種在96孔黑色熒光板中，實驗分為6 組：正常組(CTL)：含1640完全培養(yǎng)基；模型組(DM)：0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基；陽性對照組(EX)：0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基加入10 nM艾塞那肽；實驗組：0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基加入50 μg/mL(L)、100 μg/mL(M)、200 μg/mL(H)滇結香花正己烷提取物。作用細胞時間為6 h。孵育結束后，棄去培養(yǎng)基，用10μM DCFH-DA探針于37 ℃孵育細胞30 min。使用激發(fā)/發(fā)射波長為488/525 nm的酶標儀分析其熒光強度。以空白組的熒光強度(0 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合10 mmol/L葡萄糖)為100%，對實驗組進行相對定量。

2.9 熒光定量PCR法檢測細胞凋亡基因的表達

采用苯酚抽提法提取細胞總RNA,按照條件(25 ℃,10 min;48 ℃,40 min;95 ℃,5 min;4 ℃保存)反轉錄為cDNA.然后按照條件(50 ℃,2 min;95 ℃,10 min,一個循環(huán);95 ℃,15 s;60 ℃,1 min,40個循環(huán)擴增)進行qRT-PCR.以GAPDH為內參,采用2-△△Ct法對caspase-3基因的表達進行相對定量,計算其表達倍數(shù),所需引物序列如下：

表1 qRT-PCR引物序列

2.10 蛋白免疫印跡

將RIN-m5F細胞接種到6孔板(1.5×106個細胞/孔)上。處理后，用冰的裂解緩沖液裂解RIN-m5F細胞。根據(jù)蛋白質含量試劑盒說明測量蛋白質濃度。在10%聚丙烯酰胺凝膠上分離等量蛋白質的樣品，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，分別用針對AKT，F(xiàn)OXO1，JNK的選擇性抗磷酸化或非磷酸化抗體進行檢測。

2.11 統(tǒng)計學分析

實驗結果通過One-Way ANOVA進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)結果用于平均值±標準差表示。顯著性差異表示為：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。實驗中所有數(shù)據(jù)均在GraphPad Prism 5中進行數(shù)據(jù)分析。

3 結果

3.1 EGH對胰島損傷模型小鼠空腹血糖(FBG)的影響

空腹血糖作為糖尿病的常用檢測指標，其變化可初步反映藥物的降糖活性。如表1，STZ誘導C57BL/6J糖尿病模型小鼠的FBG與正常組相比，具有顯著性升高的差異，且四周后并無恢復；陽性藥物EX和EGH低、中、高三個劑量治療一周后FBG開始降低，持續(xù)治療四周后，EX降低FBG 57.02%，低、中、高三個劑量分別降低FBG 22.91%、32.18 %、40.04%，結果顯示EGH可有效降低胰島損傷糖尿病模型小鼠的FBG。

3.2 EGH對胰島損傷模型小鼠糖化血紅蛋白(HbAlc)的影響

表2 EGH對C57BL/6J T2DM小鼠模型FBG的影響(n=5)

注：與正常組相比，***P< 0.001；與模型組相比，##P<0.01，###P< 0.001。

Note:Compared with control group,***P<0.001;compared with model group,##P<0.01,###P<0.001.

HbAlc主要表示過去4～8周內平均血糖控制水平，如圖1所示，C57小鼠HbA1c含量DM組顯著高于NC組(**P<0.01)；治療4周后EX組HbA1c含量顯著降低(##P< 0.01)，且接近于NC組；EGH治療可明顯減少C57BL/T2DM模型小鼠HbA1c含量，并呈劑量依賴性，其中高劑量組效果與陽性藥物艾塞那肽相近。

圖1 EGH對C57BL/6J小鼠HbAlc的影響Fig.1 Effect of EGH on HbA1c of T2DM model C57BL/6J mice注：與對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。Note:Compared with control group,**P<0.01;compared with model group, ##P<0.01.

3.3 EGH對胰島損傷模型小鼠胰島素分泌的影響

胰島素是機體內唯一的降血糖激素，也是唯一能同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素，血清胰島素的測定是糖尿病診斷的必要參考指標[12]。結束治療后，收集小鼠空腹時的血清，采用ELISA檢測小鼠的血清胰島素水平，如圖2，糖尿病模型小鼠的血清胰島素水平明顯低于正常小鼠(***P<0.001)；治療四周后，治療組較模型組小鼠的血清胰島素水平顯著上升(#P<0.05,##P<0.01,)；中、高劑量的EGH可明顯提高糖尿病小鼠的血清胰島素水平。

圖2 EGH對T2DM模型小鼠胰島素分泌的影響Fig.2 Effect of EGH on insulin secretion of T2DM model mice注：與空白對照組相比，***P<0.001；與模型組相比， #P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。Note:Compared with control group,***P<0.001;compared with model group,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001.

3.4 MTT法檢測滇結香花提取物對RIN-m5F損傷細胞存活率的影響

如圖3結果顯示，采用0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30 mmol/L葡萄糖的模型組顯著降低細胞存活率(**P<0.01)。經(jīng)過.100～200 μg/mL EGH處理后，與模型組相比細胞存活率明顯上升(#P<0.05)。

圖3 EGH對Rin-m5F損傷細胞存活率的影響Fig.3 Effect of EGH on cell viability in RIN-m5F cells注：與空白對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05。Note:Compared with control group,**P<0.01;compared with model group,#P<0.05.

3.5 DCFH-DA熒光探針法檢測滇結香花提取物對RIN-m5F細胞內ROS水平的影響

采用本實驗室建立的胰島損傷細胞模型以活性氧生成量為檢測指標評價不同濃度滇結香花正己烷提取物對胰島細胞的保護作用。如圖4，與空白對照組相比，模型組ROS生成量顯著增加(***P< 0.001)；與模型組相比，EGH作用RIN-m5F細胞后ROS生成量顯著降低且呈劑量依賴性。

圖4 滇結香花提取物對RIN-m5F損傷細胞ROS的影響Fig.4 Effect of extrations of E.gardneri. on ROS in RIN-m5F injury cells注：與空白對照組相比，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。Note:Compared with control group,***P<0.001;compared with model group,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001.

3.6 qRT-PCR法檢測caspase-3基因的轉錄

β細胞損傷時，可能觸發(fā)了凋亡途徑導致細胞存活率降低。如圖5所示，當0.25 mmol/L棕櫚酸聯(lián)合30mmol/L葡萄糖作用后，與空白對照組相比，模型組caspase-3基因表達水平增加；與模型組相比，100 μg/mL EGH能明顯降低caspase-3基因表達水平(##P<0.01)。

3.7 Western blot法檢測胰島損傷和凋亡信號通路蛋白的表達

PI3K/AKT信號通路是與胰島素信號相關的一條信號通路，它參與細胞增殖、分化、凋亡等多種活動[13]。如圖6所示，與空白對照組相比，模型組p-AKT、p-FOXO1蛋白水平明顯下調，p-JNK蛋白水平明顯上調(***P< 0.001)。在濃度為100 μg/mL的EGH作用RIN-m5F細胞后，AKT、FOXO1蛋白磷酸化水平升高，JNK蛋白磷酸化水平降低(##P<0.01)，證明EGH可以激活AKT抑制FOXO1，導致FOXO1從細胞核移位到細胞質，從而使FOXO1失活[14]。同時抑制JNK的激活，保護β細胞免受氧化應激影響。

圖5 EGH對RIN-m5F細胞caspase-3基因轉錄的影響Fig.5 Effect ofEGH on transcription level of caspase-3 gene in RIN-m5F cells注：與空白對照組相比，**P<0.01；與模型組相比， ##P<0.01。Note:Compared with control group,***P<0.001;compared with model group,##P<0.01.

圖6 滇結香花提取物對RIN-m5F損傷細胞相關蛋白的影響。(a)AKT;(b)FOXO1;(c)JNKFig.6 Effect of extrations of E.gardneri. on revelant protein in RIN-m5F injury cells.(a) AKT;(b) FOXO1;(c) JNK注：與空白對照組相比，***P<0.001；與模型組相比， ##P<0.01。Note:Compared with control group,***P<0.001;Compared with model group,##P<0.01.

4 討論

糖尿病胰島β細胞的功能障礙及數(shù)量減少是2型糖尿病(T2DM)的主要發(fā)病原因。伴隨著營養(yǎng)過剩以及肥胖的發(fā)生，人體血漿中葡萄糖和游離脂肪酸的水平明顯増加。糖毒性和脂毒性是導致胰島β細胞衰竭的重要病理因素，但其損傷機制至今尚未完全闡明。本實驗室前期研究報道滇結香花提取物通過抑制α-葡萄糖苷酶活性等方面治療T2DM[7]。滇結香花水提取物展現(xiàn)出良好的降糖活性。實驗同時還發(fā)現(xiàn)對損傷胰島組織也有一定的修復作用，提示利用胰島損傷的體內和體外模型對滇結香花中保護胰島的物質進行篩選并探究其機制是非常必要的。本實驗通過檢測空腹血糖、糖化血紅蛋白和胰島素分泌等指標證實滇結香花正己烷提取物能明顯降低糖尿病小鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白和口服糖耐量，并提高胰島素水平。

本試驗結果提示滇結香花正己烷提取物可以改善損傷的RIN-m5F細胞存活率，降低活性氧(ROS)生成量。而氧化應激被認為是糖尿病發(fā)生和發(fā)展過程中的重要風險因素。長期高血糖和高游離脂肪酸引起氧化應激和的ROS加速產(chǎn)生，導致胰島細胞損傷和凋亡，降低胰島素基因的表達，減少胰島素分泌[15]。

Caspase-3是細胞凋亡途徑中caspase依賴性途徑中的關鍵效應分子，其活化和含量的提高意味著凋亡的加強。實驗中我們證實了EGH與模型組相比能夠減少caspase-3基因的轉錄水平，提示EGH對損傷的RIN-m5F細胞具有抗凋亡的作用。

氧化應激的發(fā)生通常包含了多條信號通路，如PI3K/AKT途徑。PI3K/AKT通過下游多種途徑對靶蛋白進行磷酸化而發(fā)揮抗凋亡作用，例如胰島β細胞中特異性過表達AKT可導致β細胞數(shù)目和大小的顯著增加[16]。 AKT還是參與內質網(wǎng)線粒體連接水平調節(jié)的關鍵激酶，通過調控IP3R1磷酸化水平，進而影響內質網(wǎng)內鈣離子的釋放。而鈣離子在葡萄糖促進胰島素釋放中起著關鍵的調節(jié)作用[17]。FOXO1轉錄因子是控制細胞周期的重要分子，其核內定位導致細胞凋亡[18]。這些均證明AKT/FOXO1信號通路在PA誘導的細胞凋亡起著重要的調節(jié)作用。C-Jun N-末端激酶(JNK)在各種細胞類型(包括胰腺β細胞)中被氧化應激激活?，F(xiàn)有證據(jù)表明內質網(wǎng)應激與氧化應激通過激活JNK，從而抑制胰島素生物合成和干擾胰島素作用通路[19]。因此JNK在胰島β細胞功能障礙和凋亡以及胰島素抵抗中起著關鍵作用。實驗中我們發(fā)現(xiàn)濃度為100 μg/mL的EGH處理后，細胞內AKT、FOXO1蛋白磷酸化水平升高，JNK蛋白磷酸化水平降低，證明EGH可以激活AKT抑制FOXO1，導致FOXO1從細胞核移位到細胞質，從而使FOXO1失活。同時抑制JNK的激活，減少氧化應激對β細胞的影響，抑制凋亡。