李 聰

遼寧中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院 大腸外科，遼寧 沈陽 110003

腸易激綜合征(irritable bowelsyndrome，IBS)以腹痛、腹部不適及排便異常為主要臨床表現(xiàn)，其生物學機制尚不明確[1]。其發(fā)病機制中，以內(nèi)臟高敏感性較為重要，即結腸組織對機械性刺激而產(chǎn)生的痛閾值下降，結腸及軀體出現(xiàn)痛覺過敏，也是IBS各種癥狀產(chǎn)生的病理基礎。痛瀉要方主治脾虛肝旺之泄瀉。中醫(yī)認為，痛瀉之病主責于肝，肝失疏泄而致肝木抑郁，肝病傳脾，木旺土虛，脾虛則發(fā)為泄瀉，故臨床常用痛瀉要方治療IBS?，F(xiàn)代研究指出，IBS導致的內(nèi)臟高敏與多種外周神經(jīng)生物學機制相關，如胃腸道中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、血管活性腸肽、生長抑素等胃腸肽表達變化時[2]，會導致消化道內(nèi)的過敏介質作用于神經(jīng)終端，內(nèi)臟痛閾值下降，對疼痛反應敏感。5-羥色胺4(5-hydroxytryptamine 4，5-HT4)受體為5-HT自身抑制性受體，可調節(jié)消化道5-HT水平，影響腸道各種感覺功能[3-4]。5-HT通過與胃腸道平滑肌上皮細胞中的5-HT4受體結合來調節(jié)胃腸道，包括促進胃腸運動、增加內(nèi)臟敏感性、促進內(nèi)臟分泌液體而抑制液體吸收。細胞癌基因fos(cellular oncogene fos，c-fos)為神經(jīng)元激活的標志物，生理狀態(tài)下表達不顯著；病理狀態(tài)下，各種外界刺激導致感覺神經(jīng)元活化，c-fos表現(xiàn)為快速高表達[5-6]。在IBS狀態(tài)下，內(nèi)臟高敏性導致腹痛及腹部不適時，c-fos處于高表達水平[7]。本研究通過建立內(nèi)臟高敏性大鼠，觀察痛瀉要方對IBS內(nèi)臟高敏狀態(tài)下結腸病理學改變及結腸組織中5-HT4受體、c-fos表達的影響，探討痛瀉要方治療IBS內(nèi)臟高敏性療效機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取無特定病原體級Wistar大鼠60只[北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證書號：SCXK(京)2016-0002]，性別不限，出生8 d，體質量(11±2)g。將大鼠隨機分為正常組(n=15)與模型組[?？战M(n=15)、陽性對照組(n=15)及治療組(n=15)]。

1.2 藥物與試劑 痛瀉要方中白術、白芍、陳皮、防風購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院中藥房；匹維溴銨片(法國Mylan Laboratories SAS，批號：H20150632)；大鼠5-HT4、c-fos試劑盒(上海聯(lián)碩圣物科技有限公司，批號：201607)； PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，批號：BK136BJ352)；Brilliant Ⅲ Ultra-Fast SYBR?Green QPCR Master Mix(Agilent Technologies，批號：0006124742)。

1.3 實驗儀器 血管成形術球囊(美國mega公司，cp1637)；兒童導尿管(沈陽市普斯曼醫(yī)療器械有限公司，P204Fr)；旋轉蒸發(fā)儀(鄭州瑞涵儀器有限公司，RE52CS-2)；光學顯微鏡(Olympus公司，BX60)；CMIAS系列數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪Med 6.0)；聚合酶鏈反應擴增儀(Singapore，2700PE)；電泳儀(北京儀器廠，DYY-8B)；核酸分析儀(BECKMAN Du 640)。

1.4 研究方法

1.4.1 模型制備 內(nèi)臟高敏性IBS大鼠模型采用直腸擴張刺激法聯(lián)合乳鼠與母鼠短暫分離法建立[8]。母鼠與乳鼠在飼養(yǎng)籠中適應性喂養(yǎng)7 d。第8天將15 mm球囊插入乳鼠直腸中，逐漸向球囊內(nèi)注水以擴張腸道，2次/d，每次持續(xù)1 min，持續(xù)5 d。第13天改用20 mm球囊進行直腸擴張，持續(xù)5 d。第18天開始改用兒童導尿管擴張直腸，持續(xù)4 d。每日乳鼠直腸擴張后，單獨放入其他籠內(nèi)，與母鼠分離1 h，之后再與母鼠同放籠內(nèi)。造模結束第2周、第4周以腹部撤離反射法進行腸道敏感性評估，證實乳鼠內(nèi)臟高敏性形成。

1.4.2 給藥方法 正常組、模空組給予0.9%氯化鈉溶液10 ml/kg灌胃，1次/d；陽性對照組給予匹維溴銨混懸液13.5×10-3g/kg灌胃，1次/d；治療組給予痛瀉要方水煎液2.03 g/kg灌胃，1次/d。各組均給藥2周。

1.5 觀察指標 給藥2周后，禁食24 h，以10%水合氯醛溶液麻醉，開腹，剪取2 cm結腸，以0.9%氯化鈉溶液沖洗結腸組織。采用HE染色法觀察結腸組織病理學改變；實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測結腸5-HT4受體、c-fos的mRNA表達水平，步驟參照Trizol試劑說明書；酶聯(lián)免疫吸附法測定5-HT4受體、c-fos的蛋白表達情況，步驟參照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書。Primer-BLAST設計引物見表1。

表1 5-HT4受體、c-fos基因引物序列

2 結果

2.1 結腸組織病理結果 各組大鼠結腸黏膜上皮組織呈單層柱狀，結腸黏膜腺體形態(tài)及大小未見明顯異常，未見明顯糜爛或潰瘍。與正常組比較，模空組黏膜間質中出現(xiàn)少量炎性浸潤，漿膜層可見輕度水腫，炎性細胞增多；與?？战M比較，治療組大鼠結腸黏膜間質內(nèi)炎性細胞浸潤減少，而漿膜層中未見明顯水腫，炎性細胞減少。見圖1。

圖1 結腸組織病理結果(HE染色×100；a.正常組；b.?？战M；c.陽性對照組；d.治療組)

2.2 結腸組織5-HT4受體、c-fos mRNA表達情況 與正常組比較，模空組、陽性對照組及治療組結腸組織5-HT4受體mRNA表達明顯下降，c-fos mRNA表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與?？战M比較，陽性對照組、治療組結腸組織5-HT4受體mRNA表達明顯上升，c-fos mRNA表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 結腸組織5-HT4受體、c-fos mRNA表達情況

注：與正常組比較，①P<0.05；與?？战M比較，②P<0.05

2.3 結腸組織5-HT4受體、c-fos蛋白表達情況 與正常組比較，?？战M、陽性對照組及治療組結腸組織5-HT4受體蛋白活性表達明顯下降，c-fos蛋白活性表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與?？战M比較，陽性對照組、治療組結腸中5-HT4受體蛋白表達明顯上升，c-fos蛋白的表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 結腸組織5-HT4受體、c-fos蛋白表達情況

注：與正常組比較，①P<0.05；與模空組比較，②P<0.05

3 討論

痛瀉要方為治療消化系統(tǒng)疾病常用方，臨床用于治療急慢性IBS、慢性過敏性結腸炎、潰瘍性結腸炎等。中醫(yī)學認為，內(nèi)臟高敏性IBS主責于肝旺脾虛，其病機為肝失疏泄，肝旺則乘脾，脾土受制于肝木，脾失健運而致泄瀉。而由肝失疏泄引起的腹痛與現(xiàn)代醫(yī)學所指內(nèi)臟高敏性相仿，故治宜健脾柔肝。

內(nèi)臟高敏性主要表現(xiàn)為痛覺過敏或痛覺超敏，機體各部位痛閾值明顯下降，對生理或病理刺激均會產(chǎn)生不適感或強烈反應，進而導致痛閾值逐步降低，形成內(nèi)臟-軀體相關性牽涉痛。有研究報道，引起IBS腹痛、腹部不適或排便異常的“元兇”是內(nèi)臟高敏性[9]。而外周神經(jīng)也在IBS內(nèi)臟高敏性狀態(tài)中發(fā)揮著調控作用。研究報道，消化道黏膜因各種刺激導致的損傷會釋放出各種過敏介質，作用于初級傳入神經(jīng)纖維而致神經(jīng)高敏狀態(tài)，導致腸道外周神經(jīng)的傷害感受器對管腔內(nèi)牽拉等反射增強，降低機體痛閾值[10]。IBS為功能性腸道疾病，腸道內(nèi)無明顯病理學改變，目前，多采用內(nèi)臟高敏感性動物模型來研究IBS發(fā)病機制及相關藥物治療機理[11]。

消化道中5-HT的代謝循環(huán)過程受多種因素調控，如臟器缺血、血管擴張、應激反應等生理、病理因素，也受胃腸道內(nèi)自身受體的調控。消化道內(nèi)黏膜分布多種5-HT受體，用以調節(jié)興奮性與抑制性神經(jīng)傳導物質的傳遞，對胃腸道功能起到調控作用。研究發(fā)現(xiàn)，5-HT在IBS內(nèi)臟高敏性病程進展中起著重要作用，而5-HT必須與相應的受體結合方可發(fā)揮其生物學作用[12]。5-HT4受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體，同時，也是5-HT的自身抑制性受體。當腸道中的5-HT釋放后，會與5-HT4受體結合，導致感覺神經(jīng)末梢去極化，進而使機體感受疼痛感，同時，5-HT激活后會誘導胃腸道的分泌與運動，參與腸道感覺[13]。5-HT4受體通過影響消化道黏膜釋放5-HT可能是內(nèi)臟高敏性調控機制之一。

有研究報道，痛瀉要方能夠通過調控IBS內(nèi)臟高敏性大鼠血清及結腸中的5-HT及5-HT4受體表達進而降低內(nèi)臟高敏性[14]。本研究結果表明，模型大鼠通過直腸擴張刺激及心理應激后，腸道敏感性增強，結腸組織中5-HT4受體基因及蛋白活性表達顯著降低，促進胃腸道釋放5-HT，同時，抑制5-HT4受體與5-HT的結合，進一步內(nèi)臟敏感性增高。痛瀉要方可顯著降低腸道敏感性，上調大鼠結腸中5-HT4受體基因及蛋白活性表達。

c-fos屬于早期即刻基因，主要作用于維持細胞功能、促進細胞增殖分化等。c-fos在生理狀態(tài)下表達不活躍，當感受到外界刺激后，能短暫而迅速的提高表達，常用來檢測激活的神經(jīng)細胞。c-fos主要存在于與痛覺傳輸相關的神經(jīng)元細胞核內(nèi)部，故本研究以c-fos作為效應指標，觀察內(nèi)臟高敏性IBS時，外周神經(jīng)與內(nèi)臟痛覺敏感調節(jié)機制的關系。本研究結果表明，模型大鼠結腸組織中c-fos基因及蛋白表達明顯上升，提示結腸神經(jīng)叢細胞處于興奮狀態(tài)，對造模過程中產(chǎn)生的刺激做出反應，說明c-fos可作為有效的靶點來治療應激性損傷或調節(jié)心理應激狀態(tài)。痛瀉要方可明顯下調結腸中c-fos表達，可通過調控結腸黏膜中c-fos表達而降低內(nèi)臟高敏性，降低痛覺應激反應。

綜上所述，IBS內(nèi)臟高敏性模型大鼠腸道敏感性增強，結腸中5-HT4受體表達下降，腸神經(jīng)叢神經(jīng)元中c-fos表達增高，可能是導致IBS內(nèi)臟高敏性的發(fā)病機制之一。痛瀉要方可通過調節(jié)結腸神經(jīng)元、5-HT4水平，并通過調控結腸組織中c-fos表達調控內(nèi)臟痛覺應激反應及抗應激損傷，從整體上起到疏肝止痛、健脾止瀉之功。