蘇文英,楊和川,譚一羅,李 曉,付永平*,李 玉*
(1.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇 連云港 222006;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食藥用菌教育部工程中心,吉林 長(zhǎng)春 130118)
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為基因組改造和基因功能研究的熱點(diǎn)。早期僅基于同源重組的基因打靶技術(shù)效率比較低,限制了基因打靶技術(shù)的應(yīng)用。后來(lái),研究者們用改造過(guò)的人工核酸內(nèi)切酶(Engineered Endonuclease,EEN)在基因組的特定位置使DNA雙鏈斷裂,并在修復(fù)過(guò)程中達(dá)到基因定點(diǎn)編輯的作用,人工核酸內(nèi)切酶的出現(xiàn),徹底改變了基因編輯效率低的這一現(xiàn)狀[1]。早期的EEN介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸內(nèi)切酶技術(shù)(Zinc-finger Nucleases,ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(Transcription Activator-like Effector Nucleases,TALEN),這2種技術(shù)的作用原理都是通過(guò)DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok Ⅰ組成蛋白復(fù)合物對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行特異性的識(shí)別和切割[2]。然而,這2項(xiàng)技術(shù)在操作過(guò)程中不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且對(duì)操作技術(shù)要求很高,因而在普通實(shí)驗(yàn)室很難被有效利用。2013年初,新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)入人們的視野[3],因其制作成本低廉、操作過(guò)程簡(jiǎn)單、快捷且易于掌握的特點(diǎn),迅速在作物品種改良[4-8]、動(dòng)物模型構(gòu)建[9-10]、疾病治療研究[11-13]、發(fā)酵菌株代謝途徑改造[14-15]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但在真菌中,由于部分真菌同源重組率極低、高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的缺乏、啟動(dòng)子和有效篩選標(biāo)記的缺乏等原因,阻礙了該技術(shù)在真菌中的發(fā)展。本文綜述了近幾年CRISPR/Cas9技術(shù)在真菌中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,以期為進(jìn)一步加快真菌基因編輯研究提供參考。
1987年,日本學(xué)者首次在大腸桿菌(Escherichiacoli)堿性磷酸酶基因(Alkaline Phosphatase,IAP)的側(cè)翼序列中發(fā)現(xiàn)了成簇的有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列[17];Jansen等[18]將其正式命名為成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)。之后,研究者發(fā)現(xiàn)在40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌的基因組中都存在CRISPR位點(diǎn)[19]。Barrangou等[20]對(duì)嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)進(jìn)行遺傳改造時(shí),發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌的CRISPR/Cas Ⅱ型系統(tǒng)能夠抵抗外源噬菌體的入侵。隨著研究的進(jìn)一步深入,Marraffini等[21]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中的CRISPR系統(tǒng)能抵御外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR系統(tǒng)的功能。Feng Zhang團(tuán)隊(duì)的Cong L等[22]和George M. Church團(tuán)隊(duì)的Mali P等[23]同時(shí)在《Science》雜志上在線報(bào)道了應(yīng)用sgRNA介導(dǎo)的Cas9核酸酶對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的特異性打靶。此后,利用該技術(shù)在不同生物中進(jìn)行基因編輯的工作陸續(xù)展開(kāi)。
由于Cas基因的多樣性異常豐富,研究者根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同,將CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)分為T(mén)ype Ⅰ、Type Ⅱ、Type Ⅲ共3種不同類型。TypeⅠ系統(tǒng)主要存在于細(xì)菌和古生菌中,結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜,特征蛋白為Cas3 蛋白,該蛋白具有解旋酶和核酸酶功能[24];Type Ⅲ系統(tǒng)的特征蛋白為Cas10 蛋白,該蛋白具有RNA 酶活性[25]。而在這3種不同類型中,由于Type Ⅱ型系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,除去crRNA和tracrRNA外,只有一個(gè)標(biāo)志性Cas9蛋白來(lái)切割DNA雙鏈,并且它僅存在于細(xì)菌中[26]。因此到目前為止,被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶是產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes,SF370)的Type Ⅱ型系統(tǒng),并且已經(jīng)在多種生物中成功實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)修飾。
CRISPR/Cas的組織結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。以產(chǎn)膿鏈球菌SF370的Type Ⅱ型結(jié)構(gòu)為例,其結(jié)構(gòu)可被分為3個(gè)部分:第一部分為5′端的轉(zhuǎn)錄激活RNA(tracrRNA)基因;第二部分為中間一系列與CRISPR相關(guān)的Cas(CRISPR-associated)蛋白,目前發(fā)現(xiàn)有6個(gè)核心Cas蛋白,包括Cas9、Cas1、Cas2、Csn2,其中Cas9蛋白包含2個(gè)獨(dú)特的功能結(jié)構(gòu)域HNH和類RuvC核酸酶亞基,它們分別切割DNA雙鏈,從而產(chǎn)生基因定點(diǎn)突變;第三部分為3′端的CRISPR基因座,由前導(dǎo)區(qū)(Leader)、間隔區(qū)(Spacers)以及多個(gè)重復(fù)序列(Direct repeats)順序連接而成[27]。
CRISPR/Cas9的作用機(jī)理大體可以分為3個(gè)步驟:(1)外源質(zhì)粒上與CRISPR基因座上對(duì)應(yīng)的序列被稱為protospacer,它的5′端或3′端的3~5個(gè)保護(hù)堿基,被稱為PAM(Protospacer Adjacent motif)序列。當(dāng)外源質(zhì)粒入侵時(shí),通過(guò)識(shí)別PAM序列來(lái)將其附近的序列定為protospacer,然后該序列被整合到CRISPR基因座的兩個(gè)重復(fù)序列間,即獲得間隔序列;(2)當(dāng)外源質(zhì)粒再次入侵時(shí),CRISPR基因座與插入的新間隔序列首先被轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)的前體RNA(pre-crRNA),然后在Cas蛋白和RNase Ⅲ核酸酶的作用下被加工成含有間隔序列的crRNA;(3)然后,crRNA與特異的Cas蛋白以及轉(zhuǎn)錄激活RNA tracrRNA形成復(fù)合物crRNA- tracrRNA,再通過(guò)PAM序列掃描外源入侵DNA上的靶序列,crRNA上的間隔序列與靶序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì),最后Cas9蛋白發(fā)揮切割酶活性,外源噬菌體或是質(zhì)粒DNA在配對(duì)的特定位置被切割,從而達(dá)到防御的目的[28]。具體的作用機(jī)理如圖1所示。
2.1.1 釀酒酵母 早在2013年,DiCarlo等[30]就將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用到了釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中,研究者將攜帶 sgRNA的質(zhì)粒與供體DNA同時(shí)轉(zhuǎn)至含有組成型表達(dá)的Cas9細(xì)胞中,使供體DNA的同源重組率接近100%,而且相較于傳統(tǒng)的同詢重組技術(shù),該技術(shù)使單鏈及雙鏈靶基因斷裂效率分別提高5倍和130倍,該研究為后續(xù)酵母基因定點(diǎn)突變和等位基因替換研究提供了強(qiáng)有力的支撐。隨后,Bao等[31]構(gòu)建了一步實(shí)現(xiàn)多基因敲除的CRISPR-Cas系統(tǒng)——HI-CRISPR(Homology-Integrated CRISPR-Cas),在對(duì)釀酒酵母進(jìn)行基因編輯時(shí),其中3種基因CAN1、ADE2、LYP1在4 d內(nèi)同時(shí)被破壞,效率為27%~87%;另外3個(gè)基因ATF2、GCY1、YPR1在6 d內(nèi)同時(shí)被破壞,效率為100%,該研究實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母中進(jìn)行多基因編輯,大大提高了基因編輯效率。
2.1.2 裂殖酵母 裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)與真核生物基因組的相似性高于釀酒酵母,但由于分子工具的缺乏,關(guān)于裂殖酵母的研究不如釀酒酵母深入。特別是由于缺乏用于表達(dá)sgRNA的啟動(dòng)子而阻礙了CRISPR/Cas9基因組編輯體系在裂殖酵母中的實(shí)施。2014 年,Jacobs 等[32]開(kāi)發(fā)了應(yīng)用于裂殖酵母中的CRISPR/Cas9系統(tǒng),在該研究中研究者利用RNA(rrk1)的啟動(dòng)子構(gòu)建靶向指導(dǎo)RNA的表達(dá)載體,與組成型Cas9相結(jié)合,在裂殖酵母中實(shí)現(xiàn)無(wú)篩選標(biāo)記的特異性誘變,誘變效率接近100%,實(shí)現(xiàn)了在裂殖酵母中進(jìn)行特定、精確和高效的基因組編輯。
圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理[29]
2.1.3 白色假絲酵母 Shapiro等[33]建立了一種基于CRISPR/Cas9的基因驅(qū)動(dòng)平臺(tái)(Gene Drive Array,GDA),能夠在二倍體病原體中進(jìn)行基因操作及快速形成突變體,該研究被用于對(duì)白色假絲酵母(Candidaalbicans)高效基因編輯中,在此研究中,一種DNA切割的Cas9酶靶向2個(gè)區(qū)域,位于單倍體白色念珠菌真菌中一個(gè)基因的兩側(cè),由兩個(gè)所謂的“向?qū)?RNA”(gRNAs) 基因組成。在靶向基因序列被切斷后,一種基因驅(qū)動(dòng)的盒式表達(dá),將所有的 Cas9 和 gRNA 組件插入其位置。當(dāng)2個(gè)單倍體菌類交配形成二倍體后代時(shí),基因驅(qū)動(dòng)也將替代基因在另一個(gè)染色體上的對(duì)應(yīng)基因,得到目標(biāo)基因有效地從機(jī)體完全刪除的原始版本。這項(xiàng)研究為了解白色念珠菌致病機(jī)制和耐藥性提供了新的途徑。
2.2.1 里氏木霉 2015年,Liu等[34]通過(guò)特定的密碼子優(yōu)化和體外RNA轉(zhuǎn)錄,融合增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(eGFP)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),建立了適用于絲狀真菌里氏木霉(Trichodermareesei)的CRISPR/Cas9系統(tǒng),不僅可以在同源臂較短的條件下實(shí)現(xiàn)靶基因高效率的同源重組,也可對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行同時(shí)編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在里氏木霉中的成功應(yīng)用,為進(jìn)一步加速絲狀真菌的功能基因組學(xué)和菌株改良研究奠定了基礎(chǔ)。
2.2.2 米曲霉 Katayama等[35]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)工業(yè)菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)基因組進(jìn)行了編輯,在該研究中研究者利用amyB作為Cas9的啟動(dòng)子,來(lái)自米曲霉的U6 啟動(dòng)子作為gRNA 啟動(dòng)子,SV40作為核定位信號(hào),F(xiàn)LAG-tag作為蛋白表達(dá)與否的檢驗(yàn)標(biāo)記,構(gòu)建了靶向于wA、yA、pyrG基因的載體,突變率在10%~20%之間,結(jié)果表明:?jiǎn)螇A基的缺失或插入突變較多,且不會(huì)對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)造成影響。該技術(shù)在米曲霉中的應(yīng)用有利于后續(xù)米曲霉定向誘變研究。
2.2.3 煙曲霉 Zhang等[36]在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)中建立了以 CRISPR/Cas9 技術(shù)為基礎(chǔ)的微生物學(xué)介導(dǎo)的末端連接(Microhomology-Mediated End Joining,MMEJ)靶基因突變系統(tǒng),不僅實(shí)現(xiàn)了精確高效的靶基因編輯,并且通過(guò)35 bp的同源臂就可使基因的編輯效率高達(dá)95%~100%。
2.2.4 水稻稻瘟病菌 在水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)中,Arazoe等[37]分別利用內(nèi)源性的 RNA 聚合酶Ⅲ(RNA polymerase, RNAP)所識(shí)別的U6啟動(dòng)子和 RNA 聚合酶Ⅱ控制的TrpC啟動(dòng)子表達(dá) sgRNA,同時(shí)發(fā)現(xiàn)利用RNA聚合酶Ⅲ識(shí)別的U6啟動(dòng)子比利用 RNA 聚合酶Ⅱ識(shí)別的TrpC啟動(dòng)子進(jìn)行基因組編輯的效率更高,這表明驅(qū)動(dòng)sgRNA的啟動(dòng)子也會(huì)影響敲除效率。
2.2.5 玉米黑粉菌 在玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)中,Schuster等[38]使用密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白、組成型強(qiáng)啟動(dòng)子Potef、gRNA以及來(lái)源于自身的U6 啟動(dòng)子構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯體系,通過(guò)單步轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入,對(duì)基因bE2和bW1進(jìn)行編輯,結(jié)果表明:突變效率高達(dá)70%,為后續(xù)玉米黑粉菌致病基因功能的研究提供了很大的幫助。
2.3.1 雙孢蘑菇 2016年賓夕法尼亞大學(xué)的楊亦農(nóng)教授利用該技術(shù)對(duì)雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)中控制褐變的多酚氧化酶(PPO)的基因進(jìn)行了基因編輯,并將該酶的活性降低了30%,使其抗褐變。此研究雖然沒(méi)有公開(kāi)具體操作過(guò)程,但這是基因編輯技術(shù)在大型真菌中的首次應(yīng)用[39]。
2.3.2 灰蓋鬼傘 2017年,Sugano 等[40]構(gòu)建了應(yīng)用于大型真菌模式生物灰蓋鬼傘(Coprinopsiscinerea)中的高效的基因組編輯體系,在此研究中,作者利用高通量轉(zhuǎn)化方法篩選獲得的一個(gè)活性高出常規(guī)啟動(dòng)子GPD活性7倍的新啟動(dòng)子——CcDED1pro,然后將該啟動(dòng)子作用于Cas9蛋白,來(lái)自灰蓋鬼傘的U6-snRNA啟動(dòng)子表達(dá)gRNA,構(gòu)建載體,利用PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化冷凍保存的原生質(zhì)體。最后,利用上述體系在穩(wěn)定的 GFP 表達(dá)體系中進(jìn)行 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 GFP 誘變,并在菌絲和子實(shí)體中成功檢測(cè)到了GFP 功能的喪失。該研究加速了大型真菌遺傳及分子育種研究。
2.3.3 金針菇 劉建雨等[41]將SpCas9根據(jù)金針菇(Flammulinavelutipes)密碼子偏好性進(jìn)行了密碼子優(yōu)化并合成FvCas9全長(zhǎng)序列,構(gòu)建了FvCas9雙元表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化金針菇單核體Dan3,并成功獲得了轉(zhuǎn)化子。
2.3.4 靈芝 Qin等[42]在靈芝(Ganodermalucidum)中成功應(yīng)用了CRISPR/Cas9系統(tǒng),在此研究中,作者應(yīng)用T7啟動(dòng)子表達(dá)gRNAs,來(lái)源于靈芝自身的Pgpd啟動(dòng)子和來(lái)自里氏木霉的Tpdc終止子作用于Cas9,然后利用PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體,靶向破壞靈芝中阻礙靈芝酸合成的基因——URA3,并成功獲得了轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化效率高達(dá)66.6%,從而使靈芝產(chǎn)生更多具有抗腫瘤活性和抗轉(zhuǎn)移活性的靈芝酸。該研究為未來(lái)更高級(jí)真菌的深入研究和應(yīng)用提供了有效的平臺(tái)。
2.3.5 蛹蟲(chóng)草 孫丹[43]將植物敲除載體pFGC-pco Cas9 通過(guò)PmeⅠ和NcoⅠ兩種限制性內(nèi)切酶將用于真菌的GPD啟動(dòng)子成功地構(gòu)建到pFGC-pco Cas9中,從而成功改造了適用于真菌敲除的載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)原生質(zhì)體,得到關(guān)于URA3基因(gRNA1+gRNA2)的轉(zhuǎn)化子共 70+52個(gè),其中g(shù)RNA1的突變率為2.8%,gRNA2突變率為2.0%。隨后,Chen等[44]通過(guò)密碼子偏好性對(duì)Cas9酶進(jìn)行優(yōu)化,并將其與新報(bào)道的啟動(dòng)子Pcmlsm3和終止子Tcmura3一起表達(dá),構(gòu)建了應(yīng)用于蛹蟲(chóng)草的CRISPR/Cas9系統(tǒng),并通過(guò)熒光GFP標(biāo)簽和蛋白質(zhì)印跡分析證明該系統(tǒng)可以穩(wěn)定表達(dá)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將體外合成的sgRNA和供體單鏈DNA(ssDNA)轉(zhuǎn)化蛹蟲(chóng)草原生質(zhì)體,利用5-FOA作為篩選標(biāo)記,并成功獲得轉(zhuǎn)化子。該研究為進(jìn)一步提高蟲(chóng)草素的產(chǎn)量,促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了技術(shù)支持。
隨著被成功測(cè)序的蕈菌數(shù)目的增加及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步,尋找子實(shí)體發(fā)育的關(guān)鍵基因,并探究不同基因的具體功能和參與的調(diào)控機(jī)制也變得越來(lái)越重要。目前CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在蕈菌中的應(yīng)用還比較少,且多集中在CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立,并且突變體的篩選多依靠測(cè)序完成,工作量很大。相信隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善,科學(xué)家們能夠建立一種高效簡(jiǎn)便的CRISPR/Cas9基因編輯體系,為蕈菌功能基因挖掘、遺傳育種研究奠定基礎(chǔ)。
首先,該系統(tǒng)最大的問(wèn)題就是脫靶率較高,CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的特異性取決于 sgRNA 上的識(shí)別序列,因此如何設(shè)計(jì)高效、特異性的sgRNA是降低脫靶效率的關(guān)鍵。研究表明,在設(shè)計(jì)sgRNA 時(shí),高C/G含量百分比可以有效降低脫靶率[45]。在設(shè)計(jì) gRNA 時(shí),可通過(guò)特定算法預(yù)測(cè)潛在脫靶位點(diǎn),盡可能選擇脫靶效應(yīng)低的 gRNA,現(xiàn)在已使用各種算法的專業(yè)軟件來(lái)降低脫靶效率,如Cas-OFFinder、CRISPR Design Tool、CasFinder、CHOPCHOP、CRISPOR、E-CRISPR等軟件。此外,研究發(fā)現(xiàn)降低sgRNA的濃度也有助于降低脫靶率[46]。另一項(xiàng)研究也表明,較長(zhǎng)的 PAM 序列能夠有效地減少脫靶效應(yīng)[47]。
其次,同源臂的長(zhǎng)短、質(zhì)粒的濃度、啟動(dòng)子及篩選標(biāo)記的選擇以及是否建立了高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系等因素都會(huì)影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率。Paix等[48]研究發(fā)現(xiàn)由33~38個(gè)核苷酸組成的同源臂與由518個(gè)核苷酸組成的同源臂成功率相當(dāng),最優(yōu)編輯條件下的成功率為10%~20%。Zhang等[36]在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)中的研究也表明:通過(guò)35 bp的同源臂就可使基因的編輯效率高達(dá)95%~100%,并且使用gpdA或niiA等強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) Cas9的表達(dá)能有效提高敲除效率。Arazoe等[37]研究表明:采用U6啟動(dòng)子表達(dá) sgRNA進(jìn)行基因編輯的效率高于tripC啟動(dòng)子。這些研究都進(jìn)一步表明不同來(lái)源的啟動(dòng)子的靶標(biāo)范圍、精準(zhǔn)度和表達(dá)效率也不相同。
Matsuura等[49]發(fā)現(xiàn),在一定的范圍內(nèi),Cas9和gRNA載體的濃度越高,轉(zhuǎn)化效率越高。Schuster 等[38]認(rèn)為在制備原生質(zhì)體時(shí),如果采用混合的破壁酶將會(huì)導(dǎo)致脫靶率較高。此外,CRISPR/Cas9技術(shù)主要是通過(guò)基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的受體遺傳轉(zhuǎn)化法來(lái)實(shí)現(xiàn)將CRISPR/Cas9系統(tǒng)帶入到受體體內(nèi)。所以,穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系也是CRISPR/Cas9成功高效運(yùn)用的因素之一。因此,在今后的應(yīng)用過(guò)程中,仍然要對(duì)這些影響基因編輯效率的因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,加速推動(dòng)該技術(shù)在真菌中的應(yīng)用。
綜上所述,利用 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可以有效地對(duì)真菌的靶基因進(jìn)行編輯,利用該體系不僅可以對(duì)單個(gè)的目的基因進(jìn)行編輯,也可對(duì)基因家族、整個(gè)基因座及代謝通路中的多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯。并且與ZFN和TALEN這兩種傳統(tǒng)的人工核酸酶相比,CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建簡(jiǎn)單、方便、快捷,且對(duì)細(xì)胞毒性小。但是運(yùn)用過(guò)程中出現(xiàn)的脫靶、編輯效率低以及突變體篩選工作量大等問(wèn)題也亟待解決。相信在不久的將來(lái),隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的改進(jìn)和完善,真菌基因組的編輯將會(huì)變得越來(lái)越簡(jiǎn)單,為進(jìn)一步推進(jìn)真菌功能基因組學(xué)及遺傳育種研究帶來(lái)突破性進(jìn)展。