趙可心，夏凱，苑鵬，溫霖，李愛民，李永強(qiáng)，段盛林*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(國(guó)珍健康科技(北京)有限公司，北京，102206) 3(功能主食創(chuàng)制與慢病營(yíng)養(yǎng)干預(yù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100015)

胰島素抵抗是指胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，主要表現(xiàn)為葡萄糖攝取減少及糖原的合成減少。肝臟是人體物質(zhì)代謝的中樞，也是胰島素作用的主要靶器官。肝臟胰島素抵抗主要表現(xiàn)為肝糖異生、肝糖的輸出增加、甘油三酯釋放量增加及肝臟脂肪變性[1-2]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，人們的生活方式發(fā)生了巨大變化，代謝綜合征的患病率逐年上升，已成為嚴(yán)重危害人類身體健康的十大隱性殺手之一。國(guó)外一項(xiàng)針對(duì)35～70歲人群的調(diào)查表明，患有代謝綜合征的病人，在未來7年里，每8人中會(huì)有1人因代謝綜合征而死亡，其中糖尿病導(dǎo)致心血管事件發(fā)生的數(shù)量是血糖正常者的4.5倍[3]。因此普遍認(rèn)為，胰島素抵抗是代謝綜合征發(fā)病的“共同土壤”，糖脂代謝紊亂是其基礎(chǔ)病理改變，但其具體的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確[4]。

胰島素抵抗是由遺傳和環(huán)境因素等多種因素引起的胰島素受體(insulin receptor，InsR)及受體后缺陷所導(dǎo)致的[5]。胰島素由胰島B細(xì)胞分泌后，經(jīng)血液循環(huán)送達(dá)外周靶細(xì)胞，與靶細(xì)胞膜上的InsR特異性結(jié)合，經(jīng)過一系列磷酸化以及去磷酸化的過程，順序激活多種激酶，活化胰島素受體底物(insulin receptor substrate 1，IRS-1)，經(jīng)由磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號(hào)通路調(diào)節(jié)糖代謝[6-8]。通過激活蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)完成下游信號(hào)蛋白的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，促使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (glucose transporter 4，GLUT-4)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，完成各組織的葡萄糖代謝[9-11]。該通路受到干擾時(shí)，會(huì)影響胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要包括胰島素受體活性減弱、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)減少、糖原分解增多等。

松花粉是一種傳統(tǒng)的藥食同源的花粉，具有降低血糖，血脂和血膽固醇的含量，預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生的作用[12-13]。松花粉含有多種維生素、微量元素、多酚，黃酮、酶及輔酶等200余種營(yíng)養(yǎng)成分及生物活性物質(zhì)；是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的天然食品中營(yíng)養(yǎng)成分最全面的物質(zhì)之一[14]。松花粉調(diào)節(jié)糖脂代謝的研究已經(jīng)有不少報(bào)道，但對(duì)肝細(xì)胞胰島素抵抗的保護(hù)作用仍缺乏研究。因此，本研究以松花粉為研究對(duì)象，用游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs) 誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，探討松花粉對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞保護(hù)作用及其保護(hù)機(jī)制，為松花粉的深度開發(fā)和進(jìn)一步充分利用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松花粉，新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)(集團(tuán))有限公司惠贈(zèng)；肝癌細(xì)胞株(HepG2)，北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)；DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、DMEM無糖培養(yǎng)基、新生牛血清，美國(guó)Gibco；油酸鈉(sodium sulfate，OANa)、棕櫚酸鈉(sodium palmitate，PA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，噻唑蘭(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenylterazolium bromide，MTT)，胰蛋白酶，美國(guó)Sigma化學(xué)公司；無FFA牛血清蛋白(FFA-free bovine serum albumin，BSA)，日本W(wǎng)AKO公司；RIPA裂解液、TG試劑盒、葡萄糖試劑盒，糖氏試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒、TransScriptR Green One-Step qPCR SuperMix試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置生物顯微鏡，日本Olympus公司；生物安全柜，中國(guó)濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；37℃ CO2培養(yǎng)箱，日本松下公司；Spectra Max i3酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司KQ-250DE；pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DK-8D三溫三控水槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；CFX Connect Real-Time System，美國(guó)Bio-RAD公司；超微量核酸蛋白分析儀，英國(guó)BioDrop公司。

1.3 方法

1.3.1 松花粉的提取以及分級(jí)萃取

取松花粉10 g，置于燒杯中，加入200 mL 70%乙醇溶液，料液比為1∶20(g∶mL)，溫度為30 ℃；超聲波輔助提取2 h；提取液經(jīng)真空抽濾得到澄清提取液①；在濾渣中繼續(xù)加入200 mL 70%乙醇溶液，超聲波輔助提取1 h，真空抽濾得到澄清提取液②；合并提取液①和②，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，回收乙醇，濃縮后浸膏采用真空冷凍干燥，得到棕黃色硬質(zhì)膏狀提取物，稱為松花粉乙醇提取物(pine pollen ethanol extract，AC)[15]。

取27 g松花粉按上述步驟處理后得到的浸膏中加入500 mL蒸餾水，溶解后置于分液漏斗中，依次加入等體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進(jìn)行多次萃??；各不同極性的萃取液合并后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，徹底除去有機(jī)溶劑后真空冷凍干燥，得到松花粉的分級(jí)部位，按極性自小到大依次為：石油醚相(pine pollen petroleum ether phase，PE)、乙酸乙酯相(pine pollen ethyl acetate phase，AE)、正丁醇相(pine pollen butanol phase，BU)、水相(pine pollen water phase，WT)。

1.3.2 總多酚、總黃酮含量測(cè)定

1.3.2.1 總多酚含量測(cè)定

采用福林酚法[16]測(cè)定總酚，總酚含量用沒食子酸當(dāng)量GAE (gallic acid equivalent)計(jì)。

1.3.2.2 總黃酮含量測(cè)定

采用硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法[17]，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下中常規(guī)培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL濃度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿時(shí)，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1次，加入不同的處理液。

1.3.3.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

取96孔培養(yǎng)板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，HepG2細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗1次，每孔加入不同的處理液100 μL，以無檢測(cè)物的相同培養(yǎng)基孵育細(xì)胞為對(duì)照，培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液，加入0.5 mg/mL MTT-DMEM于37℃避光孵育4 h，再加入100 μL DMSO，振蕩混勻以完全溶解出MTT紫色結(jié)晶產(chǎn)物。用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度值。以對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞存活率為100%計(jì)算其余組別細(xì)胞存活率。

1.3.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組：25 mmol/L葡萄糖組+10 g/L(質(zhì)量濃度)BSA、模型組：20 mmol/L葡萄糖+15 mmol/L果糖+1 mmol/L OANa+1 mmol/L PANa +10 g/L BSA組[21]，二甲雙胍組(MET)：造模液中加入終濃度為200 μg/mL二甲雙胍，以及造模液中加入各濃度松花粉提取物的實(shí)驗(yàn)組(終濃度為200或500 μg/mL)。

1.3.3.4 油紅O染色

細(xì)胞加樣處理24 h后，棄掉舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗去殘余的細(xì)胞培養(yǎng)基。而后采用陳亞藍(lán)等[18]的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色處理。

1.3.3.5 細(xì)胞糖吸收測(cè)定

各組細(xì)胞加樣處理24 h后，小心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1次，換為葡萄糖濃度為12.5 mmol/L DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24 h后取5 μL上清液，用葡萄糖試劑盒測(cè)定葡萄糖含量，計(jì)算樣品24 h葡萄糖消耗量。

1.3.3.6 細(xì)胞內(nèi)糖原含量的測(cè)定

加樣處理24 h后，小心棄去培養(yǎng)液，PBS洗1次，細(xì)胞用RIPA裂解液裂解，用糖原試劑盒測(cè)定胞內(nèi)糖原含量。結(jié)果除以蛋白含量為最終表示結(jié)果。

1.3.3.7 上清液及細(xì)胞內(nèi)TG含量的測(cè)定

各組細(xì)胞加樣處理24 h后，取50 μL待測(cè)細(xì)胞上清液，用TG試劑盒測(cè)定TG含量，結(jié)果以模型組TG含量的百分比表示。

各組細(xì)胞加樣處理24 h后，小心棄去培養(yǎng)液，將板內(nèi)待測(cè)定細(xì)胞用PBS潤(rùn)洗2次后，加入RIPA裂解液。充分裂解后，用TG試劑盒測(cè)定TG含量。結(jié)果以模型組TG含量的百分比表示(%)。

1.3.3.8InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA的表達(dá)

采用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒提取HepG2細(xì)胞中的總RNA，檢測(cè)其濃度和純度。用TransScriptR Green One-Step qPCR SuperMix試劑盒檢測(cè)InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。各引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 松花粉提取物得率

松花粉各有效成分提取率如表2所示。

表2 松花粉提取物得率 (n=3)

由表2可知，以上4種萃取物中，WT和PE得率較高。

2.2 松花粉醇提物及分級(jí)萃取物中總多酚及總黃酮含量測(cè)定

以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y= 0.048 7x+0.109 4，R2=0.992 7(n=3)，表明沒食子酸在2～25 μg/mL線性良好。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y=0.006 2x+0.048 3，R2=0.998 8 (n=3)，表明沒食子酸在0～50 μg/mL線性良好。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Rutin standard curve

表3 松花粉提取物多酚、黃酮含量

在以上松花粉萃取物中，AE的多酚含量最高，其次為PE和BU，WT多酚含量最低。其中，AE中多酚含量達(dá)1.07 mg/g，是WT的35.7倍。整體而言，松花粉醇提物及萃取物中多酚含量較高。

從黃酮的含量來看，在以上松花粉萃取物中，AE和PE中黃酮含量最高，其次為BU，WT含量最低。其中，AE中黃酮含量是WT的10倍。

2.1 松花粉乙醇提取物及各萃取相對(duì)細(xì)胞存活力的影響

如圖3所示，在質(zhì)量濃度為100～500 μg/mL時(shí)，AC組，PE組，AE組，BU組和WT組均不影響HepG2細(xì)胞的活力，對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響(P>0.05)?？紤]到后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此，各組均選擇低劑量(200 μg/mL)和高劑量(500 μg/mL)2種濃度。

圖3 松花粉醇提物及其萃取物處理24 h對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on cell proliferation after 24 h n=3)

2.2 油紅O染色結(jié)果

油紅O，又稱蘇丹紅5B，是一種脂溶性偶氮染料，具有很強(qiáng)的脂溶性和染脂性，該染料可特異性的與組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯等中性脂肪結(jié)合成小滴狀而使脂類物質(zhì)著色呈現(xiàn)橘紅色，同時(shí)又可以避免使細(xì)胞內(nèi)的其他成分與油紅O發(fā)生反應(yīng)而被其染色，以干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果[19-21]。

油紅O染色結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞與模型組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯差異，模型組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)油滴發(fā)生脂質(zhì)累積，在模型組中能看到明顯的胞內(nèi)油滴被染為紅色，說明胰島素抵抗細(xì)胞模型構(gòu)建成功(圖4)。

2.2 松花粉乙醇提取物及各萃取相對(duì)細(xì)胞上清葡萄糖含量的影響

造模液處理24 h后，模型組細(xì)胞上清葡萄糖含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。提取物與造模液共處理24h后，與模型組相比，AC200組細(xì)胞上清葡萄糖水平顯著降低(P<0.05)，其他各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清葡萄糖水平極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明，F(xiàn)FAs誘導(dǎo)后，HepG2細(xì)胞吸收葡萄糖的能力下降，松花乙醇提取物及各萃取相可促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖，從而改善細(xì)胞的胰島素抵抗水平(圖5)。

2.3 松花粉乙醇提取物及各萃取相對(duì)細(xì)胞內(nèi)糖原含量的影響

造模液處理24 h后，模型組細(xì)胞內(nèi)糖原含量含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，如圖4所示，造模液與提取物共處理24 h后，與模型組相比，各劑量AC組細(xì)胞內(nèi)糖原水平均極顯著提高(P<0.01)，500 μg/mL AC組的糖原含量高于200 μg/mL組，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性；其他各萃取相結(jié)果與AC組結(jié)果類似，僅200 μg/mL BU組糖原水平與模型組相比無顯著變化。綜上所述，F(xiàn)FAs誘導(dǎo)后，HepG2細(xì)胞中糖原快速降解，松花粉乙醇提取物及各萃取相可以抑制細(xì)胞內(nèi)糖原的降解[22]，抑制糖異生途徑，從而改善細(xì)胞的胰島素抵抗水平(圖4，圖6)。

圖4 油紅O染色圖(400×)Fig.4 Oil Red O staining (400×)

2.4 松花粉乙醇提取物及各萃取相對(duì)細(xì)胞內(nèi)和上清甘油三酯(TG)含量的影響

模型組細(xì)胞內(nèi)TG的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，如圖5所示，提取物與造模液共處里24 h后，各劑量AC處理組細(xì)胞內(nèi)TG含量與模型組相比極顯著降低(P<0.01)，且樣品濃度越高，胞內(nèi)TG的含量越低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性；如圖6，AC組上清TG的含量明顯高于模型組(P<0.01)，且500 μg/mL AC組的上清TG含量高于200 μg/mL組，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；其他各萃取結(jié)果與AC結(jié)果相類似。因此，推測(cè)松花粉提取物調(diào)節(jié)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞脂代謝是通過將TG從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外而實(shí)現(xiàn)的(圖7，圖8)。

圖5 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對(duì)上清葡萄糖含量的影響Fig.5 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on glucose content in supernatant for 24 h 注：與M組相比，*表示顯示(P<0.05)， **表示極顯著(P<0.01)。

圖6 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對(duì)細(xì)胞內(nèi)糖原含量的影響Fig.6 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on intracellular glycogen content for 24 h注：與M組相比，**表示極顯著(P<0.01)。

圖7 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對(duì)細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響Fig.7 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on TG content in cells for 24 h注：與M組相比，**表示極顯著(P<0.01)。

圖8 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對(duì)上清TG含量的影響Fig.8 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on the content of TG in supernatant for 24 h注：與M組相比，**表示極顯著(P<0.01)。

2.5 松花粉乙醇提取物及各萃取相對(duì)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)含量的影響

模型組細(xì)胞內(nèi)TC含量明顯高于對(duì)照組，為對(duì)照組的3.78倍，各劑量AC處理組的細(xì)胞內(nèi)TC的含量極顯著低于模型組(P<0.01)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；其他各組結(jié)果與AC組類似。其中正丁醇萃取物處理后效果最為明顯，500 μg/mL BU處理組細(xì)胞內(nèi)TC含量最低，約為模型組的12.36%。結(jié)果表明，F(xiàn)FAs誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量顯著上升，脂代謝出現(xiàn)異常，松花粉具有促進(jìn)脂代謝，降低細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的作用(圖9)。

圖9 松花粉乙醇提取物及其萃取物處理24 h對(duì)細(xì)胞內(nèi)TC含量的影響Fig.9 Effect of pine pollen ethanol extract and its extracts on intracellular TC content after 24 h treatment注：與M組相比，**表示極顯著(P<0.01)。

2.6 松花粉對(duì)HepG2細(xì)胞中InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達(dá)量的影響。

圖10 松花粉對(duì)HepG2細(xì)胞中InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達(dá)量的影響Fig.10 Effect of pine pollen on the expression of InSR, PI3K and GLUT-4 mRNA in HepG2 cells注：與M組相比，*表示顯著(P<0.05)，**表示極顯著(P<0.01)。

與對(duì)照組相比，造模液處理24 h后，模型組細(xì)胞中InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，F(xiàn)FAs會(huì)導(dǎo)致胰島素受體InSR的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，從而降低活化PI3K的能力，并削弱下游胰島素受體GLUT-4的信號(hào)傳導(dǎo)(圖10)，這與SHULMAN的結(jié)論相一致[23]。與模型組相比，MET組InSRmRNA表達(dá)量顯著上升，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達(dá)量有一定程度的上調(diào)但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AC組和PE組PI3K以及GLUT-4 mRNA表達(dá)量上調(diào)，AE組，BU組和WT組InSR，PI3K以及GLUT-4 mRNA表達(dá)量均上調(diào)，且組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明不同極性的松花粉提取物可以通過調(diào)控PI3K/Akt/GLUT-4信號(hào)通路促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，加速糖代謝；AE，BU，WT組還可以上調(diào)InSR的表達(dá)，增強(qiáng)胰島素的敏感性。

3 討論

HepG2細(xì)胞是一種表型與肝細(xì)胞極為相似的肝胚胎瘤細(xì)胞株，保留了肝細(xì)胞的許多生物學(xué)特性[24]。大量研究發(fā)現(xiàn)，人體出現(xiàn)代謝綜合征與高糖高脂飲食有直接關(guān)系。故本文采用果糖、葡萄糖聯(lián)合FFAs[25]誘導(dǎo)24 h建立胰島素抵抗模型并給予各劑量不同極性松花粉提取物處理，檢測(cè)上清葡萄糖，上清TG，細(xì)胞內(nèi)糖原，TG和TC水平。發(fā)現(xiàn)松花粉處理組上清葡萄糖的含量顯著低于模型組，而細(xì)胞內(nèi)糖原的含量顯著高于模型組，說明松花粉能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞吸收葡萄糖，抑制細(xì)胞內(nèi)糖原的降解從而抑制肝糖異生；松花粉處理后細(xì)胞內(nèi)TG和細(xì)胞內(nèi)TC的含量下降，而上清TG的含量上升，說明松花粉可以調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞的脂代謝，其中調(diào)節(jié)TG代謝可能是通過將TG從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外實(shí)現(xiàn)的。

機(jī)體物質(zhì)代謝幾乎都受到胰島素的調(diào)控，一旦產(chǎn)生胰島素抵抗，糖類、脂類和蛋白質(zhì)代謝都會(huì)發(fā)生紊亂，胰島素抵抗是機(jī)體物質(zhì)代謝紊亂的共同通路[26]。胰島素進(jìn)入肝臟后，會(huì)與肝細(xì)胞膜上的InSR結(jié)合，并沿著PI3K/Akt/GLUT-4信號(hào)通路發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)肝糖原的合成、分解、糖異生途徑以及血糖穩(wěn)定起調(diào)節(jié)作用。二甲雙胍是口服降糖藥物，被廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療。這也是二甲雙胍起作用的主要途徑之一。此外，二甲雙胍還能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來實(shí)現(xiàn)降糖的作用[27]。本研究以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，MET組細(xì)胞內(nèi)InSR的表達(dá)量明顯增多，說明MET能夠通過提高HepG2細(xì)胞中InSR的表達(dá)量來增強(qiáng)胰島素敏感性，但由于本研究采用FFAs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，在沒有胰島素存在的情況下，胰島素不能與受體的α亞基相結(jié)合，從而改變?chǔ)聛喕臉?gòu)象，進(jìn)而影響了IRS1/2的磷酸化[28]，因此，下游的PI3K和GLUT-4的表達(dá)量增加不明顯，推測(cè)本研究中MET調(diào)節(jié)糖脂代謝主要是通過激活A(yù)MPK抑制細(xì)胞的合成代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝來實(shí)現(xiàn)的[29]。

本研究中AC組和PE組InSR的表達(dá)量與模型組相比沒有顯著變化，說明這2組松花粉提取物并非是通過增強(qiáng)胰島素的敏感性來起到降糖的作用，而AE，BU和WT組中InSR的表達(dá)量與模型組相比顯著提高，初步認(rèn)為這3組提取物可以通過提高胰島素的敏感性來起到降糖的作用。PI3K/Akt/GLUT-4信號(hào)通路是調(diào)節(jié)糖代謝的一條重要通路，多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、人生長(zhǎng)因子(HGF)、血管位蛋白I(Ang1)，胰島素以及氧化應(yīng)激(ROS)都能啟始PI3K的激活過程[30]。很多研究認(rèn)為高胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗HepG2模型中IRS1/PI3K/GLUT-4通路被激活，從而起到調(diào)節(jié)糖代謝的作用。與模型組相比，AE，BU，WT組細(xì)胞內(nèi)InSR的mRNA表達(dá)量顯著提高，5種松花粉提取物中PI3K和GLUT-4的含量均顯著提高，說明松花粉提取物能夠激活PI3K/Akt/GLUT-4信號(hào)通路，但是本研究中PI3K的激活過程不是由胰島素起始的，推測(cè)可能是由于FFAs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激所致，具體誘因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。