梁小銀，嚴(yán)萍，詹若挺，陳蔚文

廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心/嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣州中醫(yī)藥大學(xué))/國(guó)家中成藥技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

新胃乃安片由黃芪、三七、紅參、人工牛黃等組成，是基于藥效導(dǎo)向及保持原處方不變的原則，對(duì)胃乃安膠囊進(jìn)行二次開發(fā)制成的片劑。該產(chǎn)品具有補(bǔ)氣健脾、活血止痛的功能，常用于治療胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎等消化道黏膜損傷性疾病[1-2]。在前期的研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能與抗氧化、清除自由基、促進(jìn)多胺合成有關(guān)[1]。此外，本課題組還進(jìn)行了黃芪、紅參、三七以及人工牛黃的薄層色譜鑒別和黃芪甲苷含量測(cè)定方法的研究[3]。黃芪作為君藥對(duì)新胃乃安片的療效發(fā)揮具有重要的作用，異黃酮類成分是黃芪的主要活性成分及質(zhì)量控制指標(biāo)成分[4-5]，具有抗氧化，清除自由基的作用[6]。蔡海霞等[7]采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定黃芪藥材中芒柄花素、毛蕊異黃酮、芒柄花苷及毛蕊異黃酮苷的含量，但中藥復(fù)方制劑中黃芪異黃酮成分的一測(cè)多評(píng)含量測(cè)定方法尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以芒柄花素、毛蕊異黃酮、芒柄花苷及毛蕊異黃酮苷為研究對(duì)象，建立了一測(cè)多評(píng)含量測(cè)定方法，為新胃乃安片以及其他含有黃芪的藥品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(配置Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器、四元泵自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、Empower化學(xué)工作站)；KQ-700DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水設(shè)備(法國(guó)，Millipore公司)；BS224S電子天平(德國(guó)Sartorius，萬分之一)；XR205SM-DR電子天平(瑞士Precisa，十萬分之一)。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮苷對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：111007，含量>98%)；芒柄花苷對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：110930：含量>98%)；毛蕊異黃酮對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：100618，含量>98%)；芒柄花素對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：100525，含量>98%)；乙腈(色譜純，Merk公司)；水為超純水；甲醇、甲酸等其余試劑均為分析純。

新胃乃安片(批號(hào)分別為20101002、20110301、20110302)以及黃芪陰性樣品，由廣州白云山中一藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters XBridgeTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～32 min，5%～18%乙腈；32～38 min，18%～22%乙腈；38～58min，22%乙腈；58～70 min，22%～34%乙腈；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；PDA檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素對(duì)照品適量，分別加甲醇適量制成一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品母液，再分別吸取適量，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別0.04、0.008、0.02、0.006 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取新胃乃安片10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲(功率為280 W，頻率為40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

取相當(dāng)量的黃芪陰性樣品，按2.3項(xiàng)下的方法制備黃芪陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

進(jìn)樣上述3種溶液各20 μL，依法測(cè)定，結(jié)果表明，黃芪陰性對(duì)照溶液對(duì)試驗(yàn)無干擾，方法專屬性良好，見圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.新胃乃安片樣品；C.黃芪陰性對(duì)照；1.毛蕊異黃酮苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊異黃酮；4.芒柄花素。圖1 對(duì)照品、新胃乃安片樣品及黃芪陰性對(duì)照HPLC圖

2.6 線性關(guān)系、定量限及檢測(cè)限考察

分別進(jìn)樣上述混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、30 μL各2針，依法測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸；再取2.2項(xiàng)下的各對(duì)照品儲(chǔ)備液分別加甲醇逐級(jí)稀釋，依法測(cè)定，計(jì)算定量限(信噪比為10∶1)和檢測(cè)限(信噪比為3∶1)。結(jié)果見表1，4種異黃酮成分在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)(20110301)質(zhì)量差異項(xiàng)下的新胃乃安片6份，各1.0 g，按2.3項(xiàng)下的方法制備并測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的平均含量依次為0.212、0.067、0.111、0.032 mg/片，RSD依次為0.2%、0.7%、0.3%、0.6%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 精密度試驗(yàn)

取2.7項(xiàng)下制備的同一份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，計(jì)算6次進(jìn)樣測(cè)得的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD依次為0.1%、0.2%、0.2%、0.2%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.7項(xiàng)下制備的同一份供試品溶液，分別于0、5、10、20、30、72 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算測(cè)得的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD依次為0.1%、0.2%、0.2%、0.4%，結(jié)果表明供試品溶液在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的新胃乃安片(批號(hào)：20110301)0.5 g，共6份，置具塞錐形瓶中，分別加入相當(dāng)量的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的對(duì)照品，按上述方法平行制備測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的平均回收率分別為103.5%、99.8%、99.4%、101.6%，RSD分別為1.5%、0.4%、0.6%、1.2%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.11 一測(cè)多評(píng)法相對(duì)校正因子的計(jì)算

以毛蕊異黃酮苷為內(nèi)參物，結(jié)合2.6項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液系列進(jìn)樣濃度及其所得的峰面積，參照王智民等提出的相對(duì)校正因子計(jì)算公式[8]，計(jì)算出毛蕊異黃酮苷與待測(cè)成分芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素間的平均相對(duì)校正因子分別為1.200、1.463、2.086，RSD值均≤3.7%。

2.12 耐用性考察

2.12.1 相對(duì)校正因子 分別考察了不同品牌的色譜柱、不同高效液相色譜系統(tǒng)、不同流速及不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果在不同條件下各相對(duì)校正因子的RSD在1.1%～2.6%，表明毛蕊異黃酮苷與待測(cè)成分芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素間的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好，見表2。

2.12.2 待測(cè)組分色譜峰的定位 分別記錄上述考察的不同儀器不同色譜柱、不同流速及柱溫等條件下中各待測(cè)成分的保留時(shí)間，參照王智民等提出的相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算公式[8]，計(jì)算出各待測(cè)成分與毛蕊異黃酮苷的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見表3，在不同條件下各成分間的相對(duì)保留時(shí)間值變化較小，RSD在2.2%～3.6%，芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素與毛蕊異黃酮苷的相對(duì)保留時(shí)間分別為1.459、1.753、2.436。

2.12.3 樣品測(cè)定 取供試品3批，每批平行2份，按上述擬定方法測(cè)定，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算4種異黃酮成分的含量，結(jié)果見表4，常規(guī)的外標(biāo)法實(shí)測(cè)值與一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的各成分含量的RSD均≤3.1%，說明2種方法測(cè)得結(jié)果沒有顯著性差異，一測(cè)多評(píng)法用于黃芪的成方制劑新胃乃安片的異黃酮類成分的質(zhì)量控制是可行的。

表1 4種異黃酮成分的線性關(guān)系考察

表2 相對(duì)校正因子的影響因素和結(jié)果

表3 黃芪異黃酮成分相對(duì)保留時(shí)間的影響因素和結(jié)果

表4 黃芪異黃酮成分的一測(cè)多評(píng)結(jié)果 mg/片

3 討論

一測(cè)多評(píng)法是利用中藥有效成分之間內(nèi)在的函數(shù)和比例關(guān)系，以樣品中某一典型組分(對(duì)照品廉價(jià)易得)為內(nèi)參物，建立其與其他待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子f，通過f計(jì)算出其他待測(cè)成分的含量，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)定一個(gè)代表性成分同步監(jiān)測(cè)多個(gè)指標(biāo)成分[9-10]。待測(cè)組分色譜峰的定位、待測(cè)組分濃度、對(duì)照品純度以及色譜系統(tǒng)誤差等是影響一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素[11]，其中色譜系統(tǒng)誤差因素包括流動(dòng)相的組成比例、pH值、柱溫、流速及檢測(cè)波長(zhǎng)等的微小改變時(shí)和使用不同儀器、不同廠牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作人員等[8]。研究中采用相對(duì)保留時(shí)間值對(duì)待測(cè)組分色譜峰進(jìn)行定位，分別從3種不同品牌色譜柱和3種不同高效液相色譜儀、不同操作員、不同實(shí)驗(yàn)室以及流速、柱溫等因素對(duì)相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的重現(xiàn)性進(jìn)行考察，結(jié)果RSD均<5%，表明該研究建立的一測(cè)多評(píng)法系統(tǒng)適用性較好。目前一測(cè)多評(píng)法在藥材及復(fù)方制劑中應(yīng)用廣泛，但多以測(cè)定單味或多味藥材中同類多成分為主，而對(duì)復(fù)方制劑中多味藥材不同類成分的測(cè)定仍存在局限性[8，11]。

毛蕊異黃酮苷在黃芪中的含有量較高，藥理活性明確[12]，且又是《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》中黃芪含量測(cè)定的指標(biāo)成分，其對(duì)照品易得，在該實(shí)驗(yàn)條件下分離度及峰形較好，因此以其為內(nèi)參物。

采用PDA檢測(cè)器3D圖譜對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在波長(zhǎng)為249 nm與260 nm下樣品色譜圖的峰形和各成分的峰面積均較好，色譜峰數(shù)目基本一致。對(duì)上述兩種波長(zhǎng)測(cè)得的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的含量進(jìn)行比較，結(jié)果4種成分含量差異不大，RSD均<5%，因研究中以毛蕊異黃酮苷為內(nèi)參物，《中華人民共和國(guó)藥典》黃芪中毛蕊異黃酮苷含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，因此選取260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

該研究建立的一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定新胃乃安片中4種異黃酮成分的含量具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，其測(cè)定結(jié)果與常規(guī)外標(biāo)法所測(cè)的含量間無顯著差異，在對(duì)照品缺乏條件下，可作為新胃乃安片中4種異黃酮成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。