張希墨，陸璐，劉燕霏，楊建德

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384）

弗氏檸檬酸桿菌隸屬腸桿菌科（Enterobacteriaceae）枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter），為該屬的代表種，常與動(dòng)物和人的感染有關(guān)。該菌為革蘭氏陰性短桿菌[1]，需氧或兼性厭氧，廣泛存在于水體及土壤中[2]，是人和動(dòng)物（哺乳類、鳥類、爬行類及兩棲類）腸道內(nèi)正常的菌群，屬于條件致病菌[3-4]，感染致病性弗氏檸檬酸桿菌后可引起動(dòng)物和人腹瀉、肺炎、敗血癥及食物中毒等癥狀，某些毒力很強(qiáng)的菌株可引發(fā)人和動(dòng)物患腦膜炎、腦膿腫等病癥[5]。近年來，由于抗生素的濫用導(dǎo)致檸檬酸桿菌的耐藥性日益嚴(yán)重[6]，其危害性有加重的趨勢，尤其是在醫(yī)療機(jī)構(gòu)，其已成為感染常見病原之一[7]。本研究對1例犬子宮蓄膿膿汁細(xì)菌分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)及基因序列分析鑒定為弗氏檸檬酸桿菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基及各種糖發(fā)酵管購自杭州生物研究所；藥敏片購自杭州微生物試劑公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒、Dream Taq-TM DNA Polymease、瓊脂糖購自BBI；SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒及DNA Ladder Mix maker購自生工生物（上海）有限公司；引物由生工生物（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離和培養(yǎng)

無菌采集患子宮蓄膿犬的子宮分泌物。取少量膿汁接種在普通營養(yǎng)瓊脂平板及麥康凱瓊脂平板上，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)不同菌落的形態(tài)特征，分別挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化，并將純化后的菌種4 ℃保存待用。

1.2.2 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

分別觀察純培養(yǎng)物在普通營養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上的菌落特性及其生長表現(xiàn)。取分離的純培養(yǎng)菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察其染色、形態(tài)與排列特征。

1.2.3 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)

將分離純化的細(xì)菌分別無菌接種到甘醇、尿素、麥芽糖、乳糖、蔗糖、半糖、葡萄糖、葡萄糖磷酸、枸櫞酸鹽等11種發(fā)酵管，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，記錄結(jié)果。

1.2.4 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

采用圓紙片法對分離菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。藥敏片藥物含量見表2，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄抑菌圈的大小，分析其藥物敏感情況。

1.2.5 分離菌株16S rRNA基因的擴(kuò)增、測序與分析

按照SK8255（細(xì)菌）說明書對分離菌株的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增條帶為1 500 bp。擴(kuò)增體系為: Template（基因組DNA 20-5 ng/μL）0.5 μL，10×buffer（Mg2＋plus）2.5 μL，DNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，Taq酶0.2 μL，F(xiàn)（10 μmol/L）0.5 μL，R（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸水至25 μL，PCR 反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min, 4 ℃終止反應(yīng)。使用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司純化、測序。測序引物為，S1: 5＇-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3＇；S2: 5＇-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇。

1.2.6 分離菌株16S rRNA基因同源性分析與進(jìn)化樹構(gòu)建

將菌株的 16S rRNA 基因序列在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST比對，獲取與分離菌株16S rRNA基因序列最為相近的序列。采用DNAStar 軟件進(jìn)行多序列同源性比對、分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的生物學(xué)特性

分離菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈中等大小、圓形、表面濕潤、光滑、邊緣整齊、半透明、生長良好的灰白色（圖1）；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形光滑、稍隆起、邊緣整齊的紅色菌落（圖2）。革蘭氏染色陰性桿菌，單個(gè)或成對隨機(jī)排列、無芽孢、無莢膜、兩端鈍圓（圖3）。

圖1 營養(yǎng)瓊脂上分離菌菌落狀態(tài)

圖2 麥康凱瓊脂上分離菌菌落狀態(tài)

圖3 革蘭氏染色鏡檢

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

葡萄糖、麥芽糖、硫化氫、葡萄糖磷酸、乳糖、甘醇和靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽性；蔗糖、尿素、半糖和枸櫞酸鹽試驗(yàn)為陰性，該分離菌的生物學(xué)特性及生化試驗(yàn)結(jié)果符合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中檸檬酸桿菌的特征，見表1。

表1 分離菌生化特性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 抗生素藥敏試驗(yàn)

由表2看出，該細(xì)菌對氨卞西林、麥迪霉素、派拉西林耐藥；對氨曲南、頭孢噻吩、頭孢噻肟、卡那霉素中度敏感，對頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢西叮、頭孢他啶、氧氟沙星、鏈霉素、妥布霉素敏感。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 16S rRNA 基因同源性分析

將此序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST對比，與檸檬酸桿菌的相似性最高，將分離菌株的16S rRNA序列經(jīng)DNAstar軟件中的MegAlign分別與10株數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果見圖4，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明本試驗(yàn)所獲的菌株Citrobacter freundii與KF953995.1、KF953996.1親緣關(guān)系最近，而與KU570332.1、KU57034.1親緣性較遠(yuǎn)。同源性均為99%以上。

圖4 分離菌16S rRNA 基因序列與參考序列進(jìn)化樹分析結(jié)果

3 討論與分析

弗氏檸檬酸桿菌屬于腸桿菌科，是人類及動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，并且也普遍分布在自然界中，是條件致病菌，可能引起嚴(yán)重的腸道炎、尿道感染和呼吸道感染[7-9]。在2011年，劉廣義[10]從醫(yī)院臨床標(biāo)本分離出156株弗氏檸檬酸桿菌，檢出弗氏檸檬酸菌的分布規(guī)律及耐藥性特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該菌在臨床感染上占優(yōu)勢地位，以呼吸疾病為多。，2012年，徐文必等[6]對36例子宮蓄膿進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定，其中有24株大腸桿菌、9株金黃色葡萄球菌和3株疑似棒狀桿菌。犬子宮蓄膿是中老年母犬的常見病，犬子宮蓄膿的發(fā)病主要是由生殖激素和細(xì)菌感染雙重引起的。影響犬子宮蓄膿的病原有多種，如大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、李氏桿菌等[8]，但是由弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致犬感染發(fā)病的報(bào)道很少。本次研究通過對犬子宮蓄膿的膿汁分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)和16S rRNA基因序列分析，鑒定為弗氏檸檬酸桿菌，在子宮蓄膿病例中尚屬首次。

近年來，關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌耐藥性的報(bào)道不斷增多，王利等[11]檢測鯉魚弗氏檸檬酸桿菌的耐藥表型及耐藥基因，結(jié)果表明弗氏檸檬酸桿菌對氨卞西林、頭孢拉定耐藥；曹朕嬌[12]報(bào)道弗氏檸檬酸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素以及喹諾酮類抗生素產(chǎn)生完全耐藥性。經(jīng)過藥敏試驗(yàn)測定，本次分離菌對氨卞西林和麥迪霉素耐藥，對頭孢哌酮、頭孢曲松等高度敏感，與上述文獻(xiàn)報(bào)道的耐藥性有所差異，分析原因可能與該犬生活環(huán)境有關(guān)。由于弗氏檸檬酸桿菌日趨嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象以及對人類健康潛在的威脅[13-16]，應(yīng)加強(qiáng)其耐藥性監(jiān)測、加強(qiáng)抗生素的合理使用以控制耐藥株的流行。