張曉軍，付華平，李云鋼，劉 健，崔孟超，富麗萍，張錦明

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853；2.北京師范大學(xué) 放射性藥物重點實驗室，北京 100875)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)約占所有癡呆癥的50%～70%，具有高發(fā)病率、高患病率和高致殘率的特點[1]。AD主要神經(jīng)病理改變是淀粉樣(Aβ)斑塊的沉積和神經(jīng)纖維的纏結(jié)(NFTs)，只有腦組織的病理學(xué)檢查才是當(dāng)前AD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。PET顯像利用多種特征性顯像劑，以腦內(nèi)特異病理、生化改變?yōu)榘悬c進(jìn)行結(jié)合，可從分子水平上早期無創(chuàng)傷診斷AD[3]。其中，葡萄糖代謝顯像劑18F-FDG在AD患者腦內(nèi)表現(xiàn)為特征性皮質(zhì)代謝降低，但無法證實AD特異病理改變[4]；11C-PIB以及三種獲美國FDA批準(zhǔn)的18F-Flutemetamol、18F-Florbetapir和18F-Florbetaben能特異結(jié)合Aβ斑塊，但Aβ顯像結(jié)果與患者認(rèn)知受損程度不相關(guān)，只作為腦內(nèi)Aβ斑塊水平的評估，輔助醫(yī)生診斷，不直接應(yīng)用于阿爾茨海默病的診斷[5-7]。過度磷酸化的tau蛋白構(gòu)成的NFTs是AD另一主要病理變化，tau蛋白在腦內(nèi)的水平與認(rèn)知損傷程度高度相關(guān)，近年來tau蛋白顯像劑的研究受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注[8]。自18F-FDDNP應(yīng)用于tau蛋白顯像以來，許多新型顯像劑的研究有很大進(jìn)展，主要以THKs、T807/08、PBBs、MK-6240和ROs為代表，但tau蛋白存在6種同分異構(gòu)體，只有不溶性雙螺旋絲聚集的tau(PHF-tau)蛋白與NFTs密切相關(guān)[9]，探針是否只特異結(jié)合PHF-tau是評價顯像劑優(yōu)劣的關(guān)鍵，如T807結(jié)合tau的同時能非特異結(jié)合腦內(nèi)單氨氧化酶(MAO-A)，在一定程度上降低了該探針的臨床價值[10-12]。18F-THK5317與tau親和力高(Kd=5.19 nmol/L)，能快速入腦及清除且無毒副作用，是THKs系列中極有潛力應(yīng)用于臨床的tau蛋白顯像劑[13-14]。目前國際上針對該探針已有少量臨床研究，但藥物制備均采用自制模塊合成或手動標(biāo)記，未見商用模塊自動化合成報道，不利于該類探針的推廣，而國內(nèi)tau蛋白顯像劑的臨床前與臨床研究正處于起步階段，未見相關(guān)報道。本研究在文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化合成條件，建立可靠高效的18F-THK5317自動化合成方法，經(jīng)質(zhì)量控制和動物實驗后，對比了18F-THK5317在AD患者和健康人腦內(nèi)的PET/MR結(jié)果，初步探討了其臨床應(yīng)用價值。

1 主要材料

1.1 試劑

前體(S)-2-(4-甲氨基苯基)-6-[[2-(四氫吡喃基-)-3-對甲苯磺酰氧基]丙氧基]喹啉((2-(4-methylaminophenyl)-6-[[2-(tetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)-3-tosyloxy]propoxy]quinoline))、標(biāo)準(zhǔn)品(S)-6-[(3-[氟19]-2-羥基)丙氧基]-2-(4-甲基氨基苯基)喹啉：北京師范大學(xué)放射性藥物教育部重點實驗室提供；氨基聚醚(K2.2.2)：德國ABX公司產(chǎn)品；無水乙腈和碳酸鉀：美國Sigma-Aldrich產(chǎn)品；Light QMA、SPE C18柱：美國Waters公司產(chǎn)品；H218O：豐度98%：江蘇華益化工有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

Sumitomo HM-20S加速器：日本駐友；PET-MF-2V-IT-1型多功能合成模塊(配備Alltech 626雙泵和UVSI 200全波長紫外檢測器，Grace Alltima C18, 10 mm×250 mm, HPLC柱)：派特(北京)科技有限公司；內(nèi)毒素快速檢測儀(PTS)：美國charles river湛江安度斯生物有限公司；高效HPLC分析儀：美國Waters公司，配515泵，2487紫外檢測器，分析柱Phenomenex Gemini 5 μ 100 A C18(4.6 mm×150 mm)，BioScan流動放射性檢測器；Hidex Automatic Gamma Counter：芬蘭Hidex公司；PET/MR-MAGNETOM Biograph mMR：德國西門子公司。

1.3 實驗動物

KM小鼠：雄性，25只，體重(25±2) g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。

2 實驗方法

2.1 試劑準(zhǔn)備

1號至13號瓶分別預(yù)裝以下試劑。

1號為15 mg的K2.2.2和3 mg的K2CO3

溶解在1.2 mL的90%乙腈水溶液；2號為2 mL的無水乙腈；3號為5 mg(S)-2-(4-甲氨基苯基)-6-[[2-(四氫吡喃基-)-3-對甲苯磺酰氧基]丙氧基]喹啉溶解于0.8 mL乙腈；4號為1 mol/L HCl 1 mL；5號為1 mol/L NaOH 1 mL；6號為2 mL HPLC流動相或10 mL注射用水；7號為20 mL注射用水；8號為4 mL HPLC流動相；9、10號為空瓶；11號為10 mL注射用水；12號為1 mL無水乙醇；13號為50 mL注射用水；QMA柱處理同合成18F-FDG一致，依次通過10 mL 0.5 mol/L的NaHCO3和10 mL水；C-18柱依次通過10 mL無水乙醇和10 mL水；HPLC流動相：45%乙腈水溶液，含20 mmol/L NaH2PO4。

2.2 18F-THK5317合成流程

對比兩種合成18F-THK5317的流程，分別是直接HPLC分離粗產(chǎn)品和C18預(yù)處理粗產(chǎn)品后再HPLC分離，流程如下。

粗產(chǎn)品直接HPLC分離：Sumitomo HM-20S加速器經(jīng)18O(p,n)18F反應(yīng)生產(chǎn)的18F-被QMA捕獲后，以K2.2.2/K2CO3乙腈水溶液洗脫入反應(yīng)管，共沸除水至干，2號瓶內(nèi)2 mL乙腈分兩次加入共沸除水至干。冷卻后加入3號瓶前體，100 ℃加熱8 min進(jìn)行親核反應(yīng)，之后將溶劑濃縮至0.3 mL，加入1 mL的1 mol/L HCl，90 ℃下密閉水解3 min，冷卻后，加入1 mL 1 mol/L NaOH中和，混勻后轉(zhuǎn)移到中轉(zhuǎn)瓶，用6號瓶2 mL HPLC流動相清洗反應(yīng)管內(nèi)殘余放射性至中轉(zhuǎn)瓶。啟動半制備HPLC純化，純化柱為Grace Alltima C18(10 mm×250 mm)HPLC柱，流動相為V(乙腈)∶V(水)=45∶55溶液中含20 mmol/L NaH2PO4，流速為6 mL/min，收集產(chǎn)品的放射性，進(jìn)入13號固相萃取瓶(瓶中預(yù)裝50 mL注射用水)，產(chǎn)品轉(zhuǎn)移并被C18吸附，用11瓶內(nèi)10 mL水清洗C18柱，最后用12瓶中無水乙醇從C18柱上洗脫產(chǎn)品，用生理鹽水稀釋至產(chǎn)品中乙醇低于10%。

圖1 合成18F-THK5317的國產(chǎn)模塊Fig.1 Domestic module for synthesis of 18F-THK5317

粗產(chǎn)品經(jīng)C18柱純化后進(jìn)行HPLC分離：與上述步驟相同，至加入NaOH中和后，加入6號瓶10 mL水，并將混合液轉(zhuǎn)移至2號反應(yīng)管，混合液經(jīng)過V16、V15、C18柱、V17至廢液，再用8號20 mL水清洗C18柱后，以4 mL流動相溶液將純化的產(chǎn)品洗脫至中轉(zhuǎn)瓶10，HPLC分離和溶劑轉(zhuǎn)換得到最終產(chǎn)品溶液與上述相同。

2.3 18F-THK5317的質(zhì)量控制

采用分析型HPLC進(jìn)行產(chǎn)品鑒定、放化純度和比活度測量，分析柱為phenomenex luna C18 5 u(4.6 mm×150 mm)，紫外波長為254 nm，流動相為V(乙腈)∶V(水)=45∶55溶液中含20 mmol/L NaH2PO4，流速為1 mL/min，產(chǎn)品鑒定采用標(biāo)準(zhǔn)品19F-THK5317與18F-THK5317共進(jìn)樣；每隔1 h分析一次產(chǎn)品的放化純度至2個半衰期，得到18F-THK5317的體外穩(wěn)定性；以快速內(nèi)毒素檢測儀測量產(chǎn)品溶液細(xì)菌內(nèi)毒素含量；以氯鉑酸顯色法測定雜質(zhì)K2.2.2的含量；以氣相色譜測定溶液中有機(jī)溶劑乙腈的殘留；小鼠異常毒性實驗：KM小鼠5只，將稀釋至10 mCi/mL18F-THK5317注射液(比活度為23.1 Ci/μmol，載體濃度為0.141 mg/L)，每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL的18F-THK5317，合計放射性為：2 mCi/只，載體為：0.028 2 μg/只，于注射后48 h觀察小鼠是否正常。

2.4 正常KM小鼠體內(nèi)18F-THK5317分布

20只KM小鼠編號后，計算機(jī)隨機(jī)分成四組，每組5只，每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射18F-THK5317溶液，每只7.4 MBq/0.2 mL。不同組別注射后于不同時相(1、30、60、90 min)脫頸處死，取血、心、肝、脾、肺、腎、腦，稱重后置于Hidex Automatic Gamma Counter自動計數(shù)并衰減校正，計算每克組織百分注射劑量(%ID/g)。

2.5 18F-THK5317初步臨床實驗

該研究已通過中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會的審查。

分析18F-THK5317在AD患者、健康老年人對照的分布特點。一名78歲女性AD患者(MMSE=16)和一名72歲男性健康志愿者(healthy control, HC)(MMSE=29)簽署知情同意書后進(jìn)行實驗，經(jīng)肘靜脈注射18F-THK5317后，在待檢室內(nèi)安靜休息35 min，利用西門子公司PET/MR掃描儀(MAGNETOM Biograph mMR)完成給藥后40～60 min頭部動態(tài)采集數(shù)據(jù)，均接受PET分子探針18F-THK-5317以及MRI結(jié)構(gòu)和功能成像掃描，并進(jìn)行基于核磁共振成像的PET圖像重建，比較HC與AD之間腦放射性攝取的區(qū)別。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F-THK5317的自動化合成

采用國產(chǎn)的PET-MF-2V-IT-1型多功能合成模塊，能全自動完成親核反應(yīng)和水解，HPLC純化和固相萃取采用半自動方式。若采用第一種方法，中和后產(chǎn)品直接進(jìn)入中轉(zhuǎn)瓶并用HPLC分離，耗時較短，合成時間約為40 min，但加入NaOH中和后，混合液含有不溶物呈黃色渾濁狀態(tài)，直接上柱分離一方面使反相C18柱壓異常升高，另一方面混合液pH難以保持恒定，當(dāng)偏堿時，反相C18柱固定相中的硅醇基可與THK5317的胺基結(jié)合，使產(chǎn)品峰拖尾且保留時間不定，引起分離度降低，靈敏度和精密度變差，并且放射性分離圖包含18F-等雜質(zhì)峰，最終產(chǎn)品18F-THK5317的放化產(chǎn)率低于15%。在HPLC分離前，增加C18柱預(yù)純化，該步驟耗時約3 min，可除去鹽、K2.2.2、18F-等雜質(zhì)，利用流動相(45%乙腈水溶液，含20 mmol/L NaH2PO4)將18F-THK5317洗脫至中轉(zhuǎn)瓶，上柱樣品溶劑與流動相相同，pH偏酸，呈淡黃色透明，能夠有效的保護(hù)HPLC半制備柱，并獲得較高HPLC分離穩(wěn)定性和重復(fù)性，此時HPLC分離放射性峰示于圖2，18F-THK5317的保留時間為12.1 min，未見18F-峰等雜質(zhì)，未校正合成效率為(18.7±5.3)%(n=7)，另有文獻(xiàn)報道利用中性Al2O3柱純化混合液的方法，該法能簡便地除去混合液中氟離子和大部分鹽，但過柱后中轉(zhuǎn)瓶樣品略渾濁，上柱后柱壓升高，放射性分離圖呈現(xiàn)氟離子峰和其余雜質(zhì)峰，合成效率與本文方法相當(dāng)。

圖2 半制備HPLC的放射性分離圖Fig.2 Radioactive chromatogram of semiprep HPLC

3.2 18F-THK5317的質(zhì)量控制

18F-THK5317溶液無色透明，pH為6～7；將產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)品共進(jìn)，18F-THK5317的放射性峰與19F-THK5317的相對保留時間一致(圖3)；產(chǎn)品放化純度大于97%；18F-THK5317比活度為(20.6±5.0) Ci/μmol(n=7)；2個半衰期后產(chǎn)品放化純度仍大于95%；內(nèi)毒素含量小于5 Eu/mL；K2.2.2含量低于25 mg/L；乙腈殘留為(0.083±0.066) g/L；小鼠注射后48 h全部存活，未見異常毒性反應(yīng)(小鼠注射劑量按公斤體重計算約為人體注射劑量的650倍)。產(chǎn)品質(zhì)量符合要求。(依據(jù)15版《中國藥典》中18F-FDG的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))

圖3 產(chǎn)品18F-THK5317的HPLC質(zhì)控圖(下為放射性峰，上為UV峰)Fig.3 Analytical HPLC profiles of 18F-THK5317

3.3 18F-THK5317的生物學(xué)分布

18F-THK5317在正常KM小鼠體內(nèi)生物分布示于圖4。小鼠尾靜脈注射18F-THK5317后，放射性迅速從血液清除，到30 min時，血液僅存(0.76±0.11)%ID/g，藥物主要經(jīng)肝臟代謝，直至90 min，肝臟仍有較高攝取值，其余重要臟器心、脾、肺、腎在灌注相放射性攝取高峰后均迅速下降，由于藥物脂溶性較高(LogP=2.32)[13]，在靶組織腦內(nèi)，1 min入腦量高達(dá)(8.67±0.99)%ID/g，并且在正常小鼠腦內(nèi)迅速被清除，30、60、90 min放射性攝取值分別為(0.77±0.17)、(0.25±0.04)、(0.16±0.02)%ID/g，Brain1 min/Brain60 min攝取比為34，可見該探針易穿透血腦屏障，并且能迅速從正常腦組織清除，在THK系列探針中腦清除速率最快。文獻(xiàn)報道，與另外兩種具轉(zhuǎn)化潛力的tau蛋白顯像劑—嘧啶并吲哚類18F-T807(18F-AV1451)和苯并噻唑類11C-PBB3—相比，三者均表現(xiàn)出良好的藥代動力學(xué)特征，在腦內(nèi)特異的結(jié)合AD病理的tau蛋白，但18F-T807存在體內(nèi)脫氟現(xiàn)象，以及非特異結(jié)合MAO-A；11C-PBB3與非AD病理型tau蛋白也能特異結(jié)合，且應(yīng)用受限于11C的短半衰期[10]。區(qū)分生物分布的優(yōu)缺點有賴于進(jìn)一步橫向?qū)Ρ热N顯像劑的在體應(yīng)用。

圖4 18F-THK5317在KM小鼠體內(nèi)的分布數(shù)據(jù)(n=5)Fig.4 Biodistribution of 18F-THK5317 in KM mice (n=5)

3.4 18F-THK5317初步臨床實驗

78歲女性AD患者(MMSE=16，第一行)與72歲男性HC(MMSE=29，第二行)18F-THK5317 PET/MR顯像圖示于圖5。第一行：MRI見患者雙側(cè)顳葉及海馬體積縮小，Tau-PET顯示雙側(cè)顳葉皮層顯著放射性濃聚，腦干及雙側(cè)丘腦輕度放射性滯留，MIP圖顯示皮層異常放射性滯留，以右側(cè)為著。第二行：MRI見雙側(cè)海馬形態(tài)未見顯著異常，Tau-PET顯示腦干及雙側(cè)丘腦輕度放射性滯留，MIP圖顯示皮層無異常放射性滯留，白質(zhì)、腦干及基底節(jié)區(qū)彌漫性放射性攝取。二者比較而言，AD患者雙側(cè)顳葉、皮層的放射性滯留均高于健康對照，但健康老年人腦干與基底節(jié)呈彌漫性非特異放射性攝取。18F-THK5317為外消旋體18F-THK-5117的S型對映異構(gòu)體，(S)-18F-THK-5117與(R)-18F-THK-5117初始入腦量相似，在腦內(nèi)滯留區(qū)域與tau蛋白病理區(qū)域相一致，但S構(gòu)型THK5117洗脫速度更快，皮層下白質(zhì)的非特異攝取顯著低于18F-THK-5117[13]。另據(jù)文獻(xiàn)報道，18F-THK5317 PET顯像不僅能提供tau蛋白在腦內(nèi)沉積信息，還與腦內(nèi)18F-FDG葡萄糖代謝結(jié)果一致，能夠提供AD患者腦血流灌注信息[15]。另一種新型THK類顯像劑18F-THK5351與tau蛋白親和力更強(qiáng)，具有較快的動力學(xué)參數(shù)，基底神經(jīng)節(jié)和皮層下白質(zhì)放射性攝取低于18F-THK5317，圖像具有更高的信噪比，同樣具有臨床轉(zhuǎn)化潛力[16]。

圖5 AD患者與HC對照的PET/MR顯像圖(A為AD患者，B為HC對照組)Fig.5 PET/MR images of AD patient and health control (A: AD patient, B: Health control)

4 小結(jié)

18F-THK5317為外消旋體18F-THK-5117的S型對映異構(gòu)體，其標(biāo)記前體即為手型分子，經(jīng)由18F-親核取代-Tos及水解-THP保護(hù)基團(tuán)得到18F-THK5317，國產(chǎn)氟多功能模塊能自動化、穩(wěn)定、高效的合成該探針；動物分布實驗表明，18F-THK5317能迅速穿透血腦屏障并清除，體內(nèi)重要臟器也能迅速洗脫放射性；初步臨床研究表明，AD患者在雙側(cè)顳葉、皮層的放射性滯留均高于健康對照，與tau蛋白的分布區(qū)域一致，該探針適合作為tau蛋白顯像劑，具有臨床轉(zhuǎn)化潛力。