王 冉，朱志玲，張?zhí)N涵，胡 驥，姚 靜，山廣志

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液(云克)在臨床上主要用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)及破骨修復(fù)作用[1-4]。锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液作為骨顯像劑，用于早期診斷惡性轉(zhuǎn)移性骨腫瘤和原發(fā)性骨腫瘤，單次注射使用。

亞甲基二膦酸(methylenediphosphonic acid, MDP)作為锝[99Tc]亞甲基二膦酸鹽注射液和锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液的主要原料，多采用溫和的亞磷酸三異丙酯合成路線[5]，在其合成工藝中可能存在兩種工藝雜質(zhì)(原料及中間體)：亞磷酸三異丙酯(triisopropyl phosphite, TPP)和亞甲基二磷酸四異丙酯(tetraisopropyl methylenediphosphonate, TPMDP)。

圖1 MDP及兩種雜質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of MDP and two impurities

中國(guó)藥典收錄了锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]，但未收載MDP原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，檢索CFDA網(wǎng)站，亦未發(fā)現(xiàn)MDP原料藥注冊(cè)信息。歐洲藥典[7]采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，利用核磁共振氫譜法(1H NMR)對(duì)MDP原料藥中可能殘留的TPP和TPMDP進(jìn)行控制，并規(guī)定兩種工藝雜質(zhì)殘留量均不得高于1%。

歐洲藥典收載的NMR方法需要使用昂貴的專用設(shè)備，無法滿足生產(chǎn)控制和一般實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)的需求。本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜法[8-11]建立MDP原料藥中兩種工藝雜質(zhì)的氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(GC-FID)控制方法，為MDP原料藥中兩種工藝雜質(zhì)的檢測(cè)和控制提供了一種簡(jiǎn)便可行的分析方法，為MDP原料藥的質(zhì)量控制提供了方法和依據(jù)，能夠有效保證以MDP為原料藥的臨床藥品的質(zhì)量安全。

1 儀器與試劑

TRACE1310氣相色譜儀：美國(guó)Thermo Fisher公司；ME204型電子天平、XP205型電子天平：瑞士Mettler-oledo公司；Milli-Q Integral超純水器：德國(guó)Merck Millipore公司。

TPP：純度97.88%，北京百靈威科技有限公司，批號(hào)L360R28；TPMDP：純度99.40%，北京百靈威科技有限公司，批號(hào)LPB0058；MDP：原子高科股份有限公司提供，批號(hào)10201922、10208056、10032224。水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以硝基對(duì)苯二甲酸改性的聚乙二醇為固定液的毛細(xì)管柱(HP-FFAP)(25 m×0.32 mm，0.5 μm)為色譜柱；程序升溫，初始溫度為40 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升溫至220 ℃，保持6 min；載氣為氮?dú)?，流速?.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度為200 ℃；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取TPP和TPMDP對(duì)照品適量，用丙酮稀釋至濃度為400 mg/L，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2對(duì)照品溶液 精密量取上述對(duì)照品適量，用丙酮稀釋至100 mg/L，即得。

2.2.3供試品溶液 取MDP(批號(hào)：10201922)約20 mg，精密稱定置20 mL頂空瓶中，精密加入丙酮2 mL，密封，渦旋震蕩6 min，靜置，取上清，作為供試品溶液。

2.2.4供試品加標(biāo)溶液 取MDP(批號(hào)：10201922)約20 mg，精密稱定置20 mL頂空瓶中，精密加入對(duì)照品溶液2 mL，密封，渦旋震蕩6 min，靜置，取上清，作為供試品加標(biāo)溶液。

2.3 專屬性

取丙酮、對(duì)照品溶液、供試品溶液、供試品加標(biāo)溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀，按“2.1”小節(jié)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果示于圖2，TPP保留時(shí)間為5.947 min，TPMDP保留時(shí)間為15.547 min，空白溶劑丙酮和供試品中其他色譜峰均不干擾目標(biāo)峰測(cè)定。

2.4 溶液穩(wěn)定性

取供試品加標(biāo)溶液，分別于0、1、2、4、8 h進(jìn)樣，記錄TPP和TPMDP峰面積(圖3)。結(jié)果8 h內(nèi)TPP峰面積RSD=12.57%，TPMDP峰面積RSD=3.15%。室溫條件下，TPMDP 8 h內(nèi)保持穩(wěn)定，TPP在供試品溶液中只能在2 h內(nèi)保持穩(wěn)定。因此供試品溶液采用臨用現(xiàn)制的方法進(jìn)行制備。

a——空白溶液；b——供試品溶液；c——對(duì)照品溶液；d——供試品加標(biāo)溶液；圖2 MDP中兩種雜質(zhì)色譜圖a——Blank solution；b——Test sample；c——Reference solution；d——Test spiked solution；Fig.2 GC chromatograms of two impurities of MDP

圖3 供試品加標(biāo)溶液中TPP和TPMDP 8 h內(nèi)峰面積變化圖Fig.3 Change of peak areas within 8 hours of TPP and TPMDP in the spiked solution

2.5 線性關(guān)系

精密量取“2.2.1”小節(jié)對(duì)照品儲(chǔ)備液，用丙酮依次稀釋成TPP濃度分別為194.59、97.29、48.65、24.32、12.16、6.08 mg/L，TPMDP濃度分別為200.69、100.34、50.17、25.09、12.54、6.27 mg/L的系列對(duì)照品溶液，按“2.1”小節(jié)色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。TPP在6.081～194.6 mg/L范圍內(nèi)，濃度與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為A=0.075C-0.095(r=0.999，n=6)；TPMDP在6.272～200.7 mg/L濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為A=0.066C-0.036(r=0.999，n=6)。

2.6 精密度

取對(duì)照品溶液，按“2.1”小節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果TPP和TPMDP峰面積RSD分別為2.00%、2.08%，方法精密度良好。

2.7 檢出限和定量限

精密量取“2.2.1”小節(jié)對(duì)照品儲(chǔ)備液加丙酮逐級(jí)稀釋，按“2.1”小節(jié)色譜條件進(jìn)樣，并記錄色譜圖，按信噪比(S/N)分別為10和3計(jì)算定量限和檢出限。TPP的定量限為1.520 mg/L，檢出限為0.760 1 mg/L；測(cè)得TPMDP的定量限為1.568 mg/L，檢出限為0.783 9 mg/L。可滿足兩種工藝雜質(zhì)的測(cè)定要求。

2.8 重復(fù)性

精密稱取6份供試品，按“2.2.4”小節(jié)方法制備供試品加標(biāo)溶液，按“2.1”小節(jié)色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定。TPP測(cè)得量的RSD=1.73%，TPMDP測(cè)得量的RSD=3.45%，方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率

取供試品約20 mg，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，按高、中、低不同濃度精密加入混合對(duì)照品溶液適量,每個(gè)濃度各3份，按“2.2.4”小節(jié)方法制備供試品加標(biāo)溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。兩種雜質(zhì)的平均加樣回收率(n=9)分別為96.04%，97.72%。

表1 TPP回收率結(jié)果(n=9)Table 1 The recovery result of TPP (n=9)

ND:未檢出

表2 TPMDP回收率結(jié)果(n=9)Table 2 The recovery result of TPMDP (n=9)

ND:未檢出

2.10 耐用性

載氣流速(±2%)、進(jìn)樣口溫度(±2 ℃)、檢測(cè)器溫度(±2 ℃)發(fā)生微小變化時(shí)，TPP測(cè)定的含量RSD分別為：3.37%、0.46%、3.05%；TPMDP測(cè)定的含量RSD分別為：2.68%、0.89%、1.62%。表明方法耐用性良好。

2.11 樣品測(cè)定

取本品3批樣品，按照“2.2”小節(jié)方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按“2.1”小節(jié)色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果3批樣品中均未檢出TPP和TPMDP。

利用Bruker 600 MHZ NMR，按照歐洲藥典[7]采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)供試品(批號(hào)：10201922)和對(duì)照溶液中TPP和TPMDP的含量進(jìn)行測(cè)定，樣品中均未檢出兩種工藝雜質(zhì)，供試品中的雜質(zhì)含量符合限度要求。1H NMR測(cè)定譜圖示于圖4。

1——TPP定量峰；2——TPMDP定量峰圖4 樣品核磁測(cè)定圖譜1——Quantitative peak of TPP；2——Quantification of TPMDPFig.4 Sample’s NMR determination map

3 討論

3.1 溶劑

分別采用乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷溶劑進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)，其中二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮作為溶劑時(shí)，均不干擾TPP和TPMDP的測(cè)定，乙酸乙酯溶劑峰干擾TPP測(cè)定，因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇丙酮作為溶劑。

3.2 提取時(shí)間

對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行考察，在渦旋振蕩儀上準(zhǔn)確震蕩3、6、9、12、15 min，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)過程中震蕩時(shí)間超過6 min后測(cè)定結(jié)果幾乎無變化，所以選取6 min作為樣品的提取時(shí)間。

3.3 TPP穩(wěn)定性

室溫條件下，TPP在丙酮溶液中能夠長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，精密度良好；而在供試品加標(biāo)溶液中，TPP僅能在2 h內(nèi)保持穩(wěn)定，推測(cè)該現(xiàn)象可能是由于TPP在酸性條件下不穩(wěn)定，發(fā)生降解導(dǎo)致。故采用臨用現(xiàn)制的方法進(jìn)行樣品制備。

3.4 GC-FID法與NMR方法靈敏度的比較

比較NMR和GC-FID方法對(duì)上述工藝雜質(zhì)的檢測(cè)靈敏度(圖5)。結(jié)果顯示， NMR方法測(cè)定TPP的檢出限為70.51 mg/L，TPMDP的檢出限為78.75 mg/L。GC-FID方法檢測(cè)靈敏度較NMR方法更高。

1——TPP定量峰；2——TPMDP定量峰圖5 核磁測(cè)定MDP兩種雜質(zhì)靈敏度圖譜(TPP:70.51 mg/L;TPMDP:78.75 mg/L)1——Quantitative peak of triisopropyl phosphonate；2——Quantification of methylene diphosphonate tetraisopropyl esterFig.5 The sensitivity map of two impurities in MDP measured by nuclear magnetism(TPP:70.51 mg/L;TPMDP:78.75 mg/L)

4 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定MDP原料藥中兩種工藝雜質(zhì)殘留量的氣相色譜方法。建立的方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，能夠有效控制MDP原料中的可能雜質(zhì)。建立的方法為藥品生產(chǎn)企業(yè)提供了簡(jiǎn)便的控制手段，對(duì)提高M(jìn)DP原料藥的質(zhì)量控制水平，保障用藥安全具有推動(dòng)作用，對(duì)促進(jìn)MDP原料藥的研發(fā)和申報(bào)具有一定借鑒價(jià)值。