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(中國石油大學(xué)(華東) 化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580)

威蘭膠是由產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenessp.)發(fā)酵生產(chǎn)的一種微生物多聚糖，由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖組合成四糖單元，再以四糖單元為重復(fù)單位形成分子量不同的微生物多聚糖[1-3]。威蘭膠具有高穩(wěn)定性、高粘度、剪切稀釋性等理化性質(zhì)，在建筑材料和石油開采領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，同時在醫(yī)藥、日用化工、油墨和食品等行業(yè)中也存在較大的應(yīng)用潛力[4-6]。

20世紀(jì)80年代，美國C.P.Kelco公司在繼黃原膠和結(jié)冷膠之后，研發(fā)出了威蘭膠，并成為全球唯一的生產(chǎn)供應(yīng)商。在國內(nèi)，威蘭膠的研究目前仍處于菌種篩選、發(fā)酵過程優(yōu)化等初始階段，但對于下游的威蘭膠提取工藝研究相對較少。分離提取工藝是工業(yè)上獲得威蘭膠成品的關(guān)鍵工序，也決定著威蘭膠產(chǎn)品的質(zhì)量和生產(chǎn)成本[7-9]。

本研究從膠州灣海域篩選得到鞘氨醇單胞桿菌Sphingomonassp.WG作為威蘭膠發(fā)酵生產(chǎn)菌株，經(jīng)發(fā)酵獲得威蘭膠發(fā)酵液[10]，采用乙醇作為沉淀劑，對Sphigomonassp.WG產(chǎn)威蘭膠的提取工藝進(jìn)行了設(shè)計和優(yōu)化，以提高威蘭膠的提取效率和最終產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

鞘氨醇單孢桿菌[11]由作者實驗室在膠州灣海域篩選獲得，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(北京)，保藏號為：CCTCC No.M2013161。

1.2 試劑

乙醇(體積分?jǐn)?shù)95%，工業(yè)級)、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和無水硫酸鎂等購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基

葡萄糖40 g/L，酵母膏2 g/L，磷酸氫二鉀4 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，無水硫酸鎂0.1 g/L，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2。

1.4 培養(yǎng)方法

將鞘氨醇單孢桿菌種子液以體積分?jǐn)?shù)5%轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基中，在32.5 ℃、175 r/min攪拌條件下發(fā)酵72 h得到黃色粘稠狀的威蘭膠發(fā)酵液。

1.5 擬優(yōu)化的威蘭膠醇沉工藝流程

根據(jù)文獻(xiàn)[12-15]報道的威蘭膠醇沉工藝的差異，本研究設(shè)計了擬優(yōu)化的威蘭膠醇沉工藝流程(如圖1所示)。其中，對發(fā)酵液加熱處理與否、固液分離方式、乙醇用量、沉淀時間和沉淀溫度的優(yōu)化，以最終的威蘭膠提取量為依據(jù)；而對干燥方式的選擇，以威蘭膠的粘度作為衡量產(chǎn)品質(zhì)量的依據(jù)。

圖1 擬優(yōu)化的威蘭膠醇沉工藝流程

1.6 威蘭膠粘度測定

將干燥后的威蘭膠產(chǎn)品進(jìn)行粉碎研磨，收集可以通過50目(297 μm)孔篩的威蘭膠干粉，使用SK-2型分析天平準(zhǔn)確稱量1.000 0 g威蘭膠，加入199 mL去離子水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.5%的威蘭膠溶液，使用DV-E型粘度計(4號轉(zhuǎn)子，30 r/min，25 ℃)測定威蘭膠溶液的表觀粘度。

1.7 威蘭膠提取量的計算方法

威蘭膠提取量(g/L)=威蘭膠干質(zhì)量/發(fā)酵液的體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液加熱處理對威蘭膠提取量的影響

能耗是工業(yè)生產(chǎn)成本的主要組成部分，降低能耗不僅可以使威蘭膠的提取成本降低，同時也有利于威蘭膠的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。另外，熱激處理有可能改變發(fā)酵液中威蘭膠分子的存在狀態(tài)，對威蘭膠的分離提取產(chǎn)生影響。因此，本實驗首先考察了發(fā)酵液加熱處理(85 ℃加熱20 min)對威蘭膠提取量的影響，實驗結(jié)果如圖2所示。

實驗結(jié)果表明，在所考察的乙醇用量范圍內(nèi)，對發(fā)酵液進(jìn)行加熱和不加熱處理所獲得的威蘭膠提取量基本相同，這說明對發(fā)酵液進(jìn)行熱激處理對威蘭膠的提取量沒有明顯影響。考慮到對發(fā)酵液進(jìn)行加熱需要大量熱能，增加了分離過程的能耗，因此取消對發(fā)酵液進(jìn)行熱激處理的環(huán)節(jié)，直接對發(fā)酵液進(jìn)行乙醇沉淀。

圖2 發(fā)酵液加熱處理對威蘭膠提取量的影響

圖3 固液分離方式對威蘭膠提取量的影響

2.2 固液分離方式對威蘭膠提取量的影響

離心和過濾是工業(yè)生產(chǎn)中兩種常用的固液分離方法。其中，過濾法的能耗較低，但速度較慢；而離心法的能耗偏高，但處理速度較快。為尋找一種較為合適的沉淀分離方式，本實驗比較了過濾和離心兩種方法對威蘭膠提取量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3表明，在乙醇用量相同的情況下，過濾操作獲得的威蘭膠提取量均大于離心處理所得的量。其原因可能是在離心過程中由于離心力的限制，導(dǎo)致少量威蘭膠未能從上清液中沉淀下來，進(jìn)而造成一定量的損失。為了盡可能多地提取威蘭膠產(chǎn)品，最好用過濾方式進(jìn)行固液分離操作。但考慮生產(chǎn)效率和成本，工業(yè)上仍建議采用離心分離工藝。

2.3 乙醇用量對威蘭膠提取量的影響

乙醇沉淀法是微生物多糖分離提取的常用方法，其用量與發(fā)酵液本身的性質(zhì)有關(guān)。不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液在微生物多糖的含量、粘度、理化性質(zhì)等方面存在差異，這些因素都會影響乙醇的最佳用量。因此，本實驗分別考察了乙醇用量為發(fā)酵液體積1～6倍時的威蘭膠提取情況，結(jié)果如圖4所示。

圖4表明，當(dāng)乙醇用量較少時，威蘭膠的提取量隨乙醇用量的增加而逐漸上升，在乙醇用量達(dá)到5.5倍時，威蘭膠的提取量獲得最大值，繼續(xù)增加乙醇用量，威蘭膠的提取量出現(xiàn)下降。在實驗過程中我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇用量為發(fā)酵液體積的2倍以下(1倍、1.5倍)時，混合溶液會呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，威蘭膠很難形成有效的絮狀沉淀。當(dāng)乙醇用量超過發(fā)酵液體積5.5倍后，溶液的極性可能使威蘭膠分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其無法進(jìn)行有效的沉淀，導(dǎo)致提取量呈現(xiàn)下降趨勢。因此確定95%乙醇的用量為發(fā)酵液體積的5.5倍。

圖4 乙醇用量對威蘭膠提取量的影響

圖5 沉淀時間對威蘭膠提取量的影響

2.4 沉淀時間對威蘭膠提取量的影響

乙醇沉淀威蘭膠是威蘭膠分子間相互作用聚集的過程，該過程需要一定的時間。本實驗在乙醇用量為5.5倍發(fā)酵液體積的條件下，分別靜置2、4、6、8和10 h進(jìn)行沉淀，考察了沉淀時間對威蘭膠提取量的影響，實驗結(jié)果見圖5。

從圖5可以看出，在乙醇加入的初始階段，威蘭膠的提取量隨著沉淀時間的延長而增加。當(dāng)沉淀時間達(dá)到6 h時，威蘭膠的提取量獲得最大值，繼續(xù)延長沉淀時間，威蘭膠的提取量開始下降。此現(xiàn)象說明如果沉淀時間過短，威蘭膠分子無法充分聚集、導(dǎo)致沉淀不完全；反之，如果沉淀時間過長，可能會使得少量已經(jīng)聚集的威蘭膠分子從沉淀狀態(tài)重新溶解，同樣導(dǎo)致提取量降低。由此可見，威蘭膠提取過程中的沉淀時間應(yīng)在6 h左右為宜。

2.5 沉淀溫度對威蘭膠提取量的影響

沉淀溫度是影響威蘭膠分子間相互作用并最終影響其提取量的又一因素，因此本實驗考察了沉淀溫度分別為4、10、20、30、40和50 ℃時的威蘭膠提取量，實驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 沉淀溫度對威蘭膠提取量的影響

實驗結(jié)果表明，在所考察的沉淀溫度范圍內(nèi)(4～50 ℃)，威蘭膠提取量隨沉淀溫度的增加先增加后降低，并在沉淀溫度為20 ℃時獲得最大值。作者推測，溫度過高可能使威蘭膠在乙醇中的溶解度增大，致使威蘭膠的提取量降低。因此，威蘭膠的最佳沉淀溫度為20 ℃。

2.6 干燥方式對威蘭膠溶液粘度的影響

干燥是提取威蘭膠產(chǎn)品的最后一個環(huán)節(jié)，其目的是脫除沉淀物中含有的乙醇和水分，不同干燥方式脫除水分的程度不同，對威蘭膠分子結(jié)構(gòu)造成的損害程度也有差異。因此，本實驗考察了通風(fēng)加熱干燥(即烘干干燥)、真空干燥和真空冷凍干燥對威蘭膠溶液粘度的影響，實驗結(jié)果列于表1。

表1 干燥方式對威蘭膠溶液表觀粘度的比較

圖7 優(yōu)化后的威蘭膠醇沉工藝

由表1可以看出，通風(fēng)加熱干燥和真空干燥得到的威蘭膠溶液粘度基本相同，而真空冷凍干燥獲得的威蘭膠溶液的粘度比二者高出約45%。其可能原因是，在通風(fēng)加熱干燥和真空干燥過程中，水分損失較快、較多，甚至包括部分維持分子結(jié)構(gòu)的結(jié)合水分子，導(dǎo)致威蘭膠分子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷，而在真空冷凍干燥過程中水分子升華緩慢，威蘭膠分子結(jié)構(gòu)受到的損傷較小。

2.7 優(yōu)化后的威蘭膠提取工藝

根據(jù)上述實驗結(jié)果，獲得的鞘氨醇單孢桿菌Sphingomonassp.WG產(chǎn)威蘭膠的最佳醇沉工藝如圖7所示。

3 結(jié)論

對鞘氨醇單孢桿菌Sphingomonassp.WG發(fā)酵液中提取威蘭膠的醇沉工藝進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，考察了發(fā)酵液加熱處理、固液分離方式、乙醇用量、沉淀時間及沉淀溫度對威蘭膠提取量的影響，同時研究了3種干燥方式對威蘭膠溶液粘度的影響。研究表明：對發(fā)酵液進(jìn)行加熱處理不會增加威蘭膠的提取量；相對于離心操作而言，過濾能夠獲得更高的威蘭膠提取量；最佳的乙醇用量、沉淀時間和沉淀溫度分別為發(fā)酵液體積的5.5倍(95%乙醇)、6 h和20 ℃；真空冷凍干燥獲得的威蘭膠溶液的粘度比烘干干燥和真空干燥高出約45%。